СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАТЕКСНЫХ АНТИГЕННЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БРУЦЕЛЛЕЗА, ТУЛЯРЕМИИ Российский патент 2022 года по МПК A61K39/02 C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и, в частности, к способу получения латексных антигенных диагностикумов для реакции агглютинации латекса.

Получение высокоактивных и специфичных диагностических препаратов - достаточно сложная задача. Стандартизация реакции агглютинации латекса (РАЛ), обеспечение максимальной чувствительности методов предусматривают выяснение не только способов наиболее эффективной стабилизации латексов, но и оптимального режима взаимодействия твердых матриц с антителами и антигенами.

Биомолекулы могут быть иммобилизованы на микросферы с помощью физической сорбции (за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий) или ковалентной связи. Адсорбционная способность различных веществ в отношении антител или антигенов зависит от их химической структуры. Наиболее интенсивно антигены адсорбируются на вещества, содержащие сульфогруппы, нитрогруппы, альдегидные, гидроксильные и карбоксильные группы [1].

Покрытие полимерных микросфер с помощью физической сорбции не требует особых условий и протекает достаточно быстро. Определение специфической сорбции веществ, таких как антитела (антигены), легко достигается путем смешивания микросфер с белками при оптимальном рН и последующим отделением несвязавшегося белка с твердой фазы, как правило, путем центрифугирования или диализа.

Известна работа по получению бруцеллезного антигенного эритроцитарного диагностикума с чувствительностью 1:25600 и сроком годности стабилизированных эритроцитов 2 года и более [2].

Известна работа по получению туляремийного иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума с чувствительностью 7,8×10⁵-1,56×10⁶ м.к./мл и сроком годности эритроцитов 2 года [3].

Недостатком данных препаратов является то, что свойства эритроцитов, применяемых при производстве эритроцитарных диагностикумов, широко варьируют в зависимости от многих условий, таких как гормональный статус животного-продуцента, его возраст, пол, время взятия крови, источника выделения и методов предварительной обработки. Поэтому латексные микроносители обеспечивают более воспроизводимые результаты по сравнению с эритроцитами и могут с успехом их дополнять или заменять в методах иммуноанализа.

Известен метод иммуномониторинга бруцеллеза животных с помощью иммуноферментного анализа [4].

Известны исследования по разработке и применению иммуноферментной тест-системы для выявления возбудителя туляремии [5].

Недостатками ИФА являются возможность получить ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Например, ложноположительные результаты при определении антител к различным инфекциям могут возникнут за счет ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин М против собственных иммуноглобулинов G человека; за счет антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена веществ или приеме лекарственных препаратов. Помимо этого, причиной ложноположительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества - суперантигены - неспецифически стимулируют выработку В-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям. Ложноотрицательные результаты при определении антител могут быть обусловлены состояниями иммунодефицита, а также техническими ошибками при постановке реакции.

Кроме того, для постановки ИФА необходимо дорогостоящее оборудование, высококвалифицированный персонал, химически чистая посуда, специальные помещения. Нет возможности использовать ИФА в полевых условиях.

Наиболее близким к заявляемому способу является работа Левченко Н.В. с описанием биотехнологии получения латексного диагностикума для выявления вируса гриппа птиц в реакции суспензионной агглютинации, при конструировании которого использована латексная основа акролар К (диаметр частиц (1,2±0,1 мкм), полученная из института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. При получении латексного диагностикума 1,0 мл 1,25% суспензии полиакролеиновых микросфер смешивали с 1,0 мл раствора IgG (концентрация белка 100 мкг/мл) в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (рН 7,2) и перемешивали на магнитной мешалке в течение 4 ч при температуре 22±2°С. Перемешивание продолжали при 4°С в течение 12 ч. Полученную суспензию сенсибилизированного латекса дважды отмывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером (рН 7,2), содержащем белковый стабилизатор (БС), центрифугируя при 5000 об/мин, осадок ресуспендировали в 5,0 мл БС. Белковый стабилизатор готовили путем добавления к 5,0 мл белка куриного яйца 10,0 мл 5% натрия фосфорнокислого трехзамещенного 12 водного (Na₃PO₄×12H₂O) с последующим прогреванием на кипящей водной бане в течение 10 мин. рН белкового стабилизатора доводили до значения 7,2 1 Н раствором соляной кислоты, разводили 1:1000 и добавляли азид натрия до 0,001%. Чувствительность всех серий диагностикумов составила 25-50 нг/мл инактивированного вируса гриппа птиц A/H5N1 [6].

Недостатком способа является применение белкового стабилизатора, который подвержен микробному проросту, за счет чего может снижаться срок годности препарата и время его использования.

Цель предлагаемого изобретения - получение антигенных латексных диагностикумов для выявления антител против возбудителей бруцеллеза, туляремии.

Технический результат изобретения заключается в том, что полиакролеиновую латексную суспензию центрифугируют, осадок ресуспендируют в 0,1 М растворе ФСБ (рН 9,5) до получения 2% концентрации по сухому остатку латекса и смешивают в равных объемах с раствором бруцеллезного антигена (1600 мкг/мл) в 0,1 М ФСБ (рН 9,5). Иммобилизацию проводят при температуре 37°С, постоянно перемешивая на магнитной мешалке в течение 2 ч и 18 ч при температуре 4°С. Затем дважды отмывают от несвязавшегося антигена 0,1 М ФСБ (рН 7,2-7,4), центрифугируя при 5000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида до получения 0,2% суспензии латекса. Для блокировки свободных после сорбции антигена центров матрицы применяют 0,05% раствор казеина. В качестве консерванта используют мертиолят натрия до конечной концентрации 0,01%. Приготовленный указанным способом диагностикум хранится в течение 6 мес. при 4°С (срок наблюдения).

Туляремийный антигенный диагностикум получают аналогично. Отличием является внесение раствора туляремийного антигена в 0,1 М ФСБ (рН 9,5) концентрацией 800 мкг/мл.

Для получения бруцеллезного и туляремийного антигенного латексного диагностикума с целью выявления специфических антител в РАЛ использован полиакролеиновый латекс для агглютинации (Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва) с размером частиц 1,1 мкм. В качестве лигандов применяли бактериальные антигены, полученные из микробной массы методом водно-солевой экстракции, и последующим применением ультразвука и гидравлического пресса для разрушения клеточных структур.

Эксперименты по определению чувствительности и специфичности полученных диагностикумов проводились с гомологичными и гетерологичными сыворотками, инактивированными при температуре 56°С в течение 30 мин. РАЛ ставили в U-образных планшетах.

Постановку РАЛ с разработанным бруцеллезным латексным диагностикумом осуществляли следующим образом: во все лунки планшета вносили по 50 мкл разводящей жидкости (Tween 80, разведенный 0,9% раствором натрия хлорида до 1:50000). Далее, в первые лунки каждого ряда - по 50 мкл гомологичных и гетерологичных сывороток в разведении 1:20, с последовательным 2-кратным титрованием до одиннадцатой лунки включительно, получая разведения от 1:40 до 1:40960. Для контроля диагностикума на отсутствие спонтанной агломерации в двенадцатые лунки каждого ряда вносили разводящую жидкость без исследуемых сывороток. Затем в каждую лунку планшета вносили по 25 мкл суспензии бруцеллезного латексного диагностикума.

Постановку РАЛ с туляремийным латексным диагностикумом осуществляли аналогично. Отличием является начальное разведение гомологичных и гетерологичных сывороток 1:200 (разведения в лунках от 1:400 до 1:409600).

Чувствительность разработанных диагностикумов составила: бруцеллезный латексный диагностикум - 1:5120-1:10240, туляремийный латексный диагностикум - 1:20480-1:40960.

От прототипа предлагаемый способ получения диагностикума отличается тем, что, во-первых, используются разные лиганды: в прототипе - антитела к вирусу гриппа птиц, в предлагаемом - туляремийный и бруцеллезный водорастворимые антигены; во-вторых, в прототипе для сенсибилизации использована концентрация суспензии латекса 1,25%, в предлагаемом варианте - 2%; кроме того, в прототипе сенсибилизация латексных частиц лигандами проводилась с использованием 0,1 М ФСБ рН 7,2, в предлагаемом варианте - рН буфера - 9,5; в прототипе осадок после освобождения от несвязавшегося лиганда переводили в белковый стабилизатор, подверженный микробному проросту, в предлагаемом - в 0,9% раствор натрия хлорида; в прототипе отсутствует блокирующий реагент, в предлагаемом варианте применяется казеин до конечной концентрации 0,05%, что позволяет добиться большей специфичности. Таким образом, подобрана эффективная биотехнологическая схема приготовления препарата, позволившая получить стабильный препарат с достаточной чувствительностью и специфичностью.

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Разработка бруцеллезного латексного диагностикума с использованием бруцеллезного антигена в концентрации 3200 мкг/мл.

Латексную суспензию центрифугировали, осадок ресуспендировали в 0,1 М растворе ФСБ (рН 9,5) до получения 2% концентрации по сухому остатку латекса и смешивали в равных объемах с раствором бруцеллезного антигена (3200 мкг/мл) в 0,1 М ФСБ (рН 9,5). Иммобилизацию проводили при температуре 37°С постоянно перемешивая на магнитной мешалке в течение 2 ч и 18 ч при температуре 4°С. Затем дважды отмывали от несвязавшегося антигена 0,1 М ФСБ (рН 7,2-7,4), центрифугируя при 5000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендировали в 0,9% растворе натрия хлорида до получения 0,2% суспензии латекса. Для блокировки свободных после сорбции антигена центров матрицы применяли 0,05% раствор казеина. В качестве консерванта использовали мертиолят натрия до конечной концентрации 0,01%. Приготовленный указанным способом диагностикум хранили в течение 6 мес.при 4°С без потери стабильности качественных характеристик.

Чувствительность бруцеллезного латексного диагностикума проверяли с гомологичными сыворотками: иммунной бруцеллезной кроличьей сывороткой, полученной в ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора; сывороткой диагностической бруцеллезной сухой для РА (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора).

Для контроля специфичности использовали следующие сыворотки: сыворотка диагностическая холерная 01 адсорбированная сухая для РА (ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»); сыворотка диагностическая сальмонеллезная адсорбированная О-поливалентная для РА (ЗАО «Эколаб»); сыворотка диагностическая туляремийная сухая для РА (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора). Готовили разведения сывороток 1:10, инактивировали 30 мин при температуре 56°С и использовали для постановки РАЛ.

Чувствительность бруцеллезного латексного диагностикума составила 1:10240 с гомологичными сыворотками.

При контроле специфичности установлено: отсутствие перекрестных реакций с сальмонеллезной, холерной сыворотками; с сывороткой диагностической туляремийной наблюдалась агглютинация до 1/4 титра, что соответствует требованиям нормативной документации на диагностические препараты и подтверждает специфичность диагностикума.

Пример 2. Разработка бруцеллезного латексного диагностикума с использованием бруцеллезного антигена в концентрации 1600 мкг/мл.

Получали диагностикум аналогично примеру 1, используя меньшую концентрацию бруцеллезного антигена - 1600 мкг/мл.

Чувствительность бруцеллезного латексного диагностикума составила 1:10240 с гомологичными сыворотками. При контроле специфичности установлено: отсутствие перекрестных реакций с сальмонелезной, холерной сыворотками; с сывороткой диагностической туляремийной наблюдалась агглютинация до 1/4 титра, что соответствует требованиям нормативной документации на диагностические препараты и подтверждает специфичность диагностикума.

Результаты полученные в примере 2 аналогичны примеру 1. Таким образом, целесообразно изготовление диагностикума с использованием меньшего количества бруцеллезного антигена.

Пример 3. Разработка туляремийного латексного диагностикума с использованием туляремийного антигена в концентрации 1600 мкг/мл.

Латексную суспензию центрифугировали, осадок ресуспендировали в 0,1 М растворе ФСБ (рН 9,5) до получения 2% концентрации по сухому остатку латекса и смешивали в равных объемах с раствором туляремийного антигена (1600 мкг/мл) в 0,1 М ФСБ (рН 9,5). Иммобилизацию проводили при температуре 37°С постоянно перемешивая на магнитной мешалке в течение 2 ч и 18 ч при температуре 4°С. Затем дважды отмывали от несвязавшегося антигена 0,1 М ФСБ (рН 7,2-7,4), центрифугируя при 5000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендировали в 0,9% растворе натрия хлорида до получения 0,2% суспензии латекса. Для блокировки свободных после сорбции антигена центров матрицы применяли 0,05% раствор казеина. В качестве консерванта использовали мертиолят натрия до конечной концентрации 0,01%. Приготовленный указанным способом диагностикум хранили в течение 6 мес.при 4°С без потери стабильности качественных характеристик.

Чувствительность туляремийного латексного диагностикума проверяли с туляремийными сыворотками: иммунной туляремийной кроличьей сывороткой, полученной в ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора; сывороткой диагностической туляремийной сухой для РА (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора).

Чувствительность туляремийного латексного диагностикума составила 1:40960 с гомологичными сыворотками. При контроле специфичности установлено: отсутствие перекрестных реакций с сальмонелезной, холерной сыворотками; с сывороткой диагностической бруцеллезной наблюдалась агглютинация до 1/4 титра, что соответствует требованиям нормативной документации на диагностические препараты и подтверждает специфичность диагностикума.

Пример 4. Разработка туляремийного латексного диагностикума с использованием туляремийного антигена в концентрации 800 мкг/мл.

Получали диагностикум аналогично примеру 3, используя меньшую концентрацию туляремийного антигена - 800 мкг/мл.

Чувствительность туляремийного латексного диагностикума составила 1:40960 с гомологичными сыворотками. При контроле специфичности установлено: отсутствие перекрестных реакций с сальмонелезной, холерной сыворотками; с сывороткой диагностической бруцеллезной наблюдалась агглютинация до 1/4 титра, что соответствует требованиям нормативной документации на диагностические препараты и подтверждает специфичность диагностикума.

Результаты получились аналогичные примеру 3. Таким образом, целесообразно изготовление диагностикума с использованием меньшего количества туляремийного антигена.

Используемая литература

1. Получение диагностических тест-систем на основе полимерных микросфер в присутствии поливинилпирролидона, модифицированного аминокислотой / Артыкова З.Б. [и др.] // Тонкие химические технологии. 2010. №5(3). С. 82-87.

2. Яникова Э.А. Способы получения бруцеллезных антигенных и антительных эритроцитарных диагностикумов и оценка их эффективности: автореф. на соиск. ученой степ. канд. вет. наук: 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология. Краснодар. 2020. 18 с.

3. Способ приготовления эритроцитарного диагностикума иммуноглобулинового туляремийного: пат. 2747420 Рос. Федерация. №2020124885 / Жарникова И.В.; заявл. 17.07.2020; опубл. 04.05.2021, Бюл №13. 10 с.

4. Мальцева Б.М. Разработка методов и средств иммуномониторинга бруцеллеза животных [иммуноферментные диагностикумы] // Ветеринария. Реферативный журнал. 2004. №3. С. 783.

5. Разработка иммуноферментной и иммунохроматографической моноклональных тест-систем для выявления возбудителя туляремии / Еремкин А.В. [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. 2016. Т. 61. №3. С. 184-187.

6. Левченко Н.В. Биотехнология получения и характеристика диагностикума полиакролеинового (латексного) для выявления вируса гриппа птиц в реакции суспензионной агглютинации // Медицинский вестник Северного Кавказа. 2011. №1.С. 64-65.

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и, в частности, к способу получения латексных диагностикумов для реакции агглютинации латекса (РАЛ). Сущность изобретения: разработка латексного диагностикума для РАЛ заключается в том, что полиакролеиновую латексную суспензию центрифугируют, доводят 0,1 М раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ), рН 9,5 до концентрации 2% по сухому остатку полимера и смешивают в равных объемах с водорастворимым бруцеллезным (туляремийным) антигеном, разведенным 0,1 М ФСБ, рН 9,5 до концентрации 1600 мкг/мл, туляремийным - 800 мкг/мл. Иммобилизацию проводят при перемешивании и температуре 37°С в течение 2 ч и 18 ч при температуре 4°С, далее центрифугируют при 5 тыс.об/мин в течение 10 мин, дважды отмывают от несвязавшегося антигена 0,1 М ФСБ, рН 7,2-7,4 и последний осадок ресуспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида до 0,2% концентрации. Для блокировки свободных центров диагностикума применяют казеин до 0,05%. В качестве консерванта - 0,01% мертиолята натрия. Постановку РАЛ проводят с подобранной разводящей жидкостью Tween 80 в разведении 1:50000. 4 пр.

Способ получения латексных антигенных диагностикумов для выявления антител против возбудителей бруцеллеза, туляремии, заключающийся в иммобилизации бруцеллезного (туляремийного) антигена концентрацией 1600 (800) мкг/мл, на частицах полиакролеинового латекса в суспензии до 2% по сухому остатку в соотношении 1:1, в 0,1 М растворе фосфатно-солевого буфера, рН 9,5; инкубации при постоянном перемешивании и температуре 37°С в течение 2 ч и 18 ч - при температуре 4°С; отмывании от несвязавшегося антигена; ресуспендировании осадка в 0,9% растворе натрия хлорида до 0,2% концентрации; блокировке свободных центров матрицы казеином до 0,05% и консервировании мертиолятом натрия до 0,01%; постановке РАЛ с подобранной разводящей жидкостью Tween 80 в разведении 1:50000.