Способ диагностики лептоспирозов Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

9

Iw

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗОВ путем добавления лептоспирозной культуры к исследуемой сыворотке с последующим определением титров лептоспирозных антител, отличающийся тем, что, с целью повышения точности диагностики и упрощения способа, к исследуемой сыворотке добавляют убитые лептоспирозные культуры, далее образовавшийся комплекс смешивают с комплементом и вносят резусположительные эритроциты человека, имеющего 1-ю группу крови.

to

САЭ Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике инфекционных заболеваний и может быть использовано для диагностики лептоспироза. Известен способ диагностики лептоспироза путем добавления лептоспирозной культуры к исследуемой сыворотке с последующим определением титров лептоспирозных антител 1. Однако известный способ недостаточно точен, поскольку он обладает невысокой чувствительностью и сложен в исполнении, а также требует использования парных сывороток и наличия полного набора живых диагностических лептоспирозных культур. Цель изобретения - повышение точноети диагностики и упрощение способа. Указанная цель достигается тем, что согласно способу диагностики лептоспирозов путем добавления лептоспирозной культуры к исследуемой сыворотке с последующим определением титров лептоспирозных антител, к исследуе.мой сыворотке добавляют убитые лептоспирозные культуры, далее образовавшийся комплекс смещивают с комплементом и вносят резусположительные эритроциты человека, имеющего 1-ю группу крови. Способ осуществляется следующим образо.м. У больного Д. с соответствующим эпиданамнезом и клинической картиной, подозрительной на лептоспироз, берут кровь в первые дни поступления в стационар и через 10 дней после первого забора крови. Сыворотки крови больного исследуют реакцией иммуноадизивной гемагглютинации РИАГА, которую ставят в м.икротитрационных панелях в объеме 0,1 мл. Ингредиенты реакции: 1) буфер желатиновероналмединаловый (ЖВМБ), РН 7,5: 17,0 г NaCl; 0,75 медилала; 1,15 г веронала; 1 мл смеси 0,03 м СаСГ. и 0,1 м MgCl,; дистиллированная вода до 400 мл. Для работы этот маточный раствор разводят дистиллированной водой в соотношении 1:4 и на каждые 100 мл раствора добавляют 0,1 мл lQ/o-ной желатины. ЖВМБ применяют для разведения сывороток, антигенов, комплемента и эритроцитов; 2) исследуемая сыворотка, нрогретая при 56°С в течение 3.0 мин; 3) комплемент - консервированная (сернокислым натрием и борной кислотой) сыворотка морских свинок. Используют в разведении 1,50-1:75; 4) эритроциты человека 0(1) группы, резусположительные; хранят в, растворе Алсевера при 4°С до 45 дней; для реакции из них готовят 1,5%-ную взвесь; 5) лептоспирозные диагностикумы применяют 2-х типов: антигены для диагностики лептоспироза реакцией микроагглютинации ТУ46-21-43-74, которые производятся Ставропольской биофабрикой; используют в рабочем разведении 1:20-1:40; формалинизированные антигены, которые готовят по методи ке Стийнера (1954), применяются в рабочем разведении 1:10-1:20. Техника реакции: двухкратные разведения сывороток, начиная с 1:40, вносят в микротитрационные панели. Затем в каждую лунку добавляют определенный лептоспирозный диагностикум в разведении 1:40. Панели встряхивают на вибраторе и помещают в термостат при t -37° на 30 мин. После этого в каждую лунку добавляют 0,025 мл комплемента в разведении 1:75. Панель снова встряхивают на вибраторе и инкубируют в термостате 30 мин. Затем во все лунки вносят по 0,025 мл 1,5%-ной - взвеси эритроцитов человека. После очередноговстряхивания на вибраторе панель оставляют при комнатной температуре на 1 ч (до прохождения контролей). Положительной считают реакцию на 3 или 4 креста. В опыт включают контроли исследуемых сывороток, антигена и комплекмента. Гемагглютинации в контрольных лунках не наблюдалось. В первой сыворотке гемагглютинация с L. i terohaemorrhagiae отмечалась до титра 1:320, во второй до 1:10240. При параллельном исследовании данных сывороток в реакции аплютинации (РА) в первой сыворотке лептоспирозных антител не выявлено. Титр антител во второй сыворотке к L. icterohaemorrhagiae оказался равным 1:640. Многократное нарастание титра лептоспирозных антител в совокупности с соответствующим эпиданамнезом и клинической картиной позволяет поставить больному Д. диагноз: лептоспироз, вызванный L icterohaemorrhagiae. Пример 1. У больного, подозрительного на лептоспироз, на 4-й день болезни исследована сыворотка крови параллельно при помощи РА и РИАГА. В РА лептоспирознь е антитела не выявлены, с помощью РИАГА определены антитела к лептоспирам Jcterohaemorrhagiae в титре 1:1280 и поставлен диагноз: лептоспироз.-На девятые сутки больной при явлениях почечно-печеночной недостаточности умер. На вскрытии диагноз: лептоспироз подтвердился (характерные патологоанатомические изменения в органах; обнаружение лептоспир при микроскопии срезов внутренних органов), Пример 2. У больного С. на второй день болезни произведен бактериологический посев крови на лептоспироз. С этого же дня больной стал получать антибиотикотерапию: пенициллин со стрептомицином. Сыворотка крови больного исследована на 5-й и 14-й дни болезни. РА не выявила лептоспирозных антител ни в первой, ни во второй сыворотке больного. С помощью РИАГА определены антитела к лептоспирам Hebdomadis в первой сыворотке в титре 1:320, во второй - 1:1280. Диагноз был подтвержден результатом бактериологического посева крови.

Пример 3. У больного М. подозрительного на лептоспироз, исследована сыворотка крови на 3-й и 12-й день болезни. В первой сыворотке лептоспирозные антитела с помощью РА не выявлены, в РИАГА их титр оказался равным 1:320.

Это свидетельствует о более высокой точности диагностики способом РИАГА уже в первые дни заболевания. (Комплементсвязывающие антитела, определяемые РИАГА, появляются в крови на 2-4 день болезни, а агглютинины, выявляемые РА, - только на 6-7 день).

Во второй сыворотке этого больного титр антител в РИАГА был равен 1:20480, в РА только 1:640. Чувствительность РИАГА в данном случае в 32 раза превосходит чувствительность РА. Причем РА выявила антитела к трем серогруппам лептоспир: Hcterohaemorrhagiae (1:640), Hebdornadis (1:640), Canicola (1:320) (перекрестные серологические реакции). РИАГА оказалась более специфичной и выявила антитела только к лептоспирам Hebdomadis, что позволяет поставить точный диагноз.

При исследовании сывороток 84 больных лептоспирозом людей диагноз подтвержден с помощью известной реакции агглотинации (РА) в 73 случаях (86,9%), а с помощью предлагаемо.й реакции иммуноадгезивной гемагглютинации (РИАГА) во всех 84 случаях (). При этом титры антител, выявляемые в РИАГА, были в 10-50 раз выше, чем в РА. Уровень вырабатываемых антител у больных лептоспирозом невысок р связи с ранним применением антибиотиков. Высокая чувствительность РИАГА позволяет выявлять небольилие количества антител и тем самым повышает точность диагностики (пример 2). Важное преимущество РИАГА состоит в способности выявлять ранние комплементсвязывающие антитела, что обеспечивает точность диагностики в первые дни болезни, когда агглютининов, выявляемых с помощью РА, в крови еще нет. Кроме того, обладая более высокой специфичностью, РИАГА позволяет поставить точный серогрупповой диагноз (пример 3).

Наряду с этим, точность диагностики при использовании РИАГА повышается за счет

объективности учета результатов реакции. При применении РА учет субъективен, осуществляется путем микроскопии « в темном поле. При этом возможна неправильная 5 интерпретация результатов вследствие неспецифической агглютинации лептоспир. Тогда как учет РИАГА, осуществляемый визуально по феномену гемагглютинации, является просты.м и четким.

Преимущества предлагаемого способа диагностики лептоспирозов: значительное упрощение диагностики заболевания благодаря применению убитых щтаммов лептоспир, вследствие чего устраняются больщие трудности, связанные с необходимостью под5 держания и использования в диагностических лабораториях полного набора живых лептоспирозных культур. Упрощается также учет полученных результатов реакции, который проводится визуально, а не «в темном поле зрения микроскопа, как при РА, когда возможна неправильная интерпретация результатов. Высокая чувствительность способа. РИАГА по своей чувствительности в 2-10 раз превосходит РА, считающуюся самой чувствительной реакцией для диагности5 ки лептоспироза. Это было показано при исследовании сухих агглютинирующих лептоспирозных сывороток, нативных гипериммунных сывороток кроликов и сывороток больных людей. Высокая чувствительность РИАГА позволяет выявлять лептоспирозные

0 антитела в более ранние сроки после начала заболевания по сравнению с РА и другими серологическими реакциями. Многократное увеличение объема производимых исследований в связи с устранением необходимости просматривать под микроскопом и оценивать результаты реакции каждого разведения сыворотки с каждым из 13-ти сероваров лептоспир. Цоявляется возможность одномоментно исследовать большое количество сывороток благодаря использованию микро0 титрационных панелей. Обеспечение безопасности работы персонала благодаря использованию убитого диагностикума вместо живых культур лептоспир. Это имеет большое значение, так как в соответствии с положением Министерства здравоохранения СССР лептоспироз включен во вторую группу инфекций, требующих особых мер предосторожностей при работе.