Настоящее изобретение относится к новым комплексам тромбоцитарного фактора роста (PDGF), ассоциированным с амфифильными полимерами, позволяющим улучшать физическую и химическую устойчивость in vitro и in vivo терапевтического белка для применения в фармации.
PDGF являются гликопротеинами размером примерно 30000 дальтон, состоящими из двух полипептидных цепочек, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Были идентифицированы четыре типа цепочек - А, В, С и D. Нативный белок существует в виде гомодимера и гетеродимера типа АВ (Oefner C.EMBO J.11, 3921-2926, 1992).
Впервые PDGF был выделен из тромбоцитов. Это факторы роста, высвобождаемые во время коагуляции крови, способствующие росту разных видов клеток (Ross R. tt al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1974, 71, 1207; Kohler N. & Lipton A., Exp.Cell Res., 1974, 87, 297). В настоящее время известно, что PDGF продуцируется некоторым числом клеток, не являющихся тромбоцитами, и что он является митогенным для большей части клеток, происходящих из мезенхимы, то есть кровяных, мышечных, костных и хрящевых клеток, а также клеток соединительной ткни (Raines e.w. in ''Biology of Platelet-Derived Growth Factor”, 1993, Westermark, B. et C. Sorg Ed.Basel, Kerger, стр.74). Во многих статьях также показано, что PDGF, происходящий из макрофагов, выступает как хематотактический и митогенный агент в отношении гладкомышечных клеток, что он способствует миоинтимальному утолщению стенок артерий, что характерно для атеросклероза (Ross R et al., Science, 1990, 248, 1009). Кроме того, в частности, к функциям PDGF относится стимуляция высвобождения гранул нейтрофильными моноцитами (Tzeng D.У. et al., Blood, 1985, 66, 179), облегчение стероидного синтеза клетками Leydig (Risbridger G.P., Mol.cell. Endocrinol., 1993, 97, 125), стимуляция нейрофильного фагоцитоза (Wilson E et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1987, 84, 2213), модуляция экспрессии и секреции тромбоспондина (Majak R.A et al., J.Biol.Chem., 1987, 262, 8821) и пострегуляция гена ICAM-1 в гладкомышечных клетках сосудов (Morisaki N. Et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 200, 612).
С учетом этих разнообразных свойств уже рассматривалось использование рекомбинантных PDGF в фармации. В частности, использование PDGF было одобрено для лечения диабетических язв ноги (Regranex, J&J) и периодонтального заживления (GEM 21S, Biomimetic).
Рубцевание язв, также как и рубцевание кожи в целом, является сложным феноменом, который требует координированного во времени и в пространстве участия клеток разных видов, которое можно резюмировать тремя фазами: фазой воспаления, фазой пролиферации и фазой ремоделирования.
Во время фазы воспаления, которая продолжается примерно 7 дней при нормальном рубцевании, магрофаги убивают бактерии, разрезают поврежденные ткани и регенерируют ткани. Для этого макрофаги секретируют коллагены, цитокины и факторы роста.
Во время фазы пролиферации, которая продолжается от 3 дней до 3 недель при нормальном рубцевании, происходят три последовательных события. Рана заполняется грануляционной тканью, развивается ангиогенез и рана покрывается эпителиальными клетками. Грануляционная ткань растет от краев к центру. Фибробласты в избытке продуцируют коллаген III типа.
Во время фазы ремоделирования, которая продолжается от 3 недель до 1 или даже 2 лет, грануляционные ткани созревают, фибробласты продуцируют меньше коллагена. Ненужные кровеносные сосуды, образовавшиеся во время грануляции, устраняются апоптозом. Коллаген III типа заменяется коллагеном I типа, который располагается по линиям натяжения и структурируется.
В этом процессе PDGF играет главную роль. Во время образования раны тромбоциты агрегируют и высвобождают PDGF. PDGF притягивает нейрофилы, макрофаги и фибробласты к ране и является мощным митогеном. В свою очередь, макрофаги, эндотелиальные клетки синтезируют и секретируют PDGF. PDGF стимулирует продуцирование новой внеклеточной матрицы посредством фибробластов, главным образом неколлагеновых соединений, таких как гликозаминогликаны и адгезивные белки (J.F.Norton et al., Essential practice of surgery, Springer, 2003, глава 7, стр.77-89).
Особенность хронических ран, таких как диабетические язвы ноги, венозные язвы и язвы, образовавшиеся в местах повышенного давления, заключается в том, что их рубцевание происходит очень медленно и иногда неполностью, так как процесс рубцевания не является нормальным (R.lobmann et al., of Diabetes and its complications, 2006, 20, 329-335).
Процесс рубцевания в действительности является хрупким равновесием между процессом разрушения, необходимым для устранения поврежденных тканей, и процессом регенерации, который приводит к образованию новых тканей. Протеазы и факторы роста играют ключевую роль в этом процессе, регулируя указанное равновесие. В случае хронических ран это равновесие нарушается в пользу разрушения, чем объясняется задержка их заживления. Хотя существуют разные виды хронических ран, в биохимическом отношении они являются относительно сходными в том смысле, что для них характерны длительные фазы воспаления, которые приводят к повышению уровня протеазы и, таким образом, снижают активность факторов роста (G.Lauer et al., J.Invest. Dermatol.115 (2000) 12-18). Это разрушение факторов роста способствует общей потере тканей, ассоциированных с этими хроническими ранами, что не способствует заживлению (D.R.Yager et al., J.Invest. Dermatol. 107(1996) 743-748).
В настоящее время на рынке представлено лекарственное средство на основе рекомбинантного PDGF-ВВ человека, общее международное название которого “becaplermin”, выпускаемое под товарным наименованием Regranex®. Это лекарственное средство показано при лечении язв нижних конечностей диабетиков. Оно имеет форму геля для топического нанесения и способствует заживлению язв. Также как и эндогенный PDGF оно, в частности, способствует клеточной пролиферации и, следовательно, образованию новых тканей.
Эффективность этого лечения ограничена (Cullen et al., The international journal of biochemistry & Cell Biology 34, 1544-1556, 2002), даже если клинические исследования показали улучшение заживления и сокращение продолжительности заживления (Greenhalgh et al., american Journal of pathology, 136, 1235-1246, 1990; Ladin Plastic and reconstructive Surgery, 105, 1230-1231, 2000; Holloway et al., Wounds, 5/4; 198-206; Mandracchia et al., Clinics in Podiatric medecine and Surgery, 18, 189-209 2001; Wieman T.J.American Journal of Surgery, 176, 74S-79S 1998).
Продукт Regranex, который содержит PDGF-ВВ, выпускаемый J&J, продемонстрировал свою эффективность путем повышения процента выздоровления пациентов, к которым он применялся, до 50% по сравнению с 36% пациентов, которые получали только традиционное лечение раны. Несмотря на это существенное улучшение в области лечения диабетической язвы ноги, следует отметить, что только 50% пациентов выздоравливают после длительного и дорогостоящего лечения. В случае если выздоровление не наступило, последствия могут быть очень тяжелыми и привести во многих случаях к ампутации нижней конечности. Следует добавить, что в среднем лечение является очень длительным, примерно 20 недель, и дорогостоящим и неудобным в связи с необходимостью очищать рану и наносить Regranex утром, затем очищать рану через 12 часов. Эти две процедуры чаще всего должна проводить медсестра. Кроме того, стоимость лечения продолжительностью 20 недель очень высока (примерно 1400 долларов США).
Частичная эффективность может объясняться быстрым разложением PDGF в обрабатываемой ране. В случае хронической раны это разложение является результатом продолжительного воспаления, которое создает в ране окружение, неблагоприятное для PDGF, путем стимуляции сверхпродуцирования протеаз.
Тогда как контроль за разложением необходим для рубцевания ран, чрезмерная протеолитическая активность является вредной, так как ведет к разрушению внеклеточной матрицы (F.Grinnell et al., J.Invest dermatol.106 (1996) 335-341 et C.N.Rao et al., J.Invest dermatol.105 (1995) 572-578) и молекул, имеющих ключевую функциональную роль в качестве факторов роста (V. Falanga et al., J.Derm.Surg.Onc.18 (1992) 604-606; D.R.Yager et al., Wound Rep Reg.5(1997) 23-32 et M.Wlaschek et al.,Br.J.dermatol.137 (1997) 646-647). В действительности, факторы роста, такие как PDGF, TGFβ или bFGF, являются ключевыми элементами в процессе рубцевания за счет их способности вызывать миграцию клеток, пролиферацию, синтез белка, образование матрицы и в более широком смысле за счет регулирования процесса восстановления. Однако эти факторы роста являются белковыми молекулами и, следовательно, чувствительны к протеолитическому разложению. В нескольких исследованиях показано, что разложение факторов роста, таких как PDGF, значительно ускоряется, если их приводят в контакт с жидкостями, происходящими из хронических ран, так как они содержат повышенные концентрации металлопротеиназ (D.R.Yager et al., J.Invest dermatol.107 (1996) 743-748).
Клинические пилотные исследования применения Regranex при лечении венозных язв, изложенные в публикации T.J.Wielman, Wounds, 2003, том 15, n8, 257-264, показали лишь незначительное улучшение современных методов лечения, основанных на регулярной очистке раны компрессионной терапией.
Проблема неустойчивости PDGF проявилась, например, при продуцировании белка. Известно, что PDGF особенно чувствителен к посттрансляционному протеолизу (Hart et al., Biochemistry 29; 166-172, 1990 и патент US 07/557219) и, в частности, на уровне связи между аминокислотой аргинином в положении 32 и аминокислотой треонином в положении 33 зрелой цепи белка. Другие связи чувствительны к протеолизу, например связь между аргинином в положении 79 и лизином в положении 80, или связь между аргинином в положении 27 и аргинином в положении 28 цепи В PDGF.
Эта протеолитическая неустойчивость представляет собой основную проблему при получении этого белка, который продуцируется в рекомбинантном виде в дрожжах способом, описанным в патенте US 4845075. Действительно, в патенте US 7084262 указано, что анализ и очистка PDGF-ВВ приводит к получению 21 изоформы, полученных в результате эндолитических посттрансляционных (post-traductionnels) расщеплений. Эта большая структурная гетерогенность вызывает 50%-ное снижение активности белка, продуцированного генетическим гением по отношению к интактному зрелому белку.
К тому же клинические результаты, недавно полученные Cardium, сообщение о которых было опубликовано 14 августа 2006 года (www.prnwswire.com), касающиеся диабетических язв ноги, незарубцевавшихся после 14 недель лечения, показывают потенциал, который может иметь лечение с использованием PDGF-ВВ. Предложенное Cardium решение заключается во введении гена экспрессии PDGF-ВВ в клетки раны для локальной сверхэкспрессии. Эта генная терапия при помощи аденовектора привела к рубцеванию около 80% таких диабетических язв ноги, которые не поддавались обычному лечению, в группе из 15 пациентов. Такое терапевтическое решение является многообещающим. Однако фармацевтические разработки методов лечения, основанных на генной терапии, в настоящее время носят случайный характер в связи с проблемами безопасности, связанными с применением вирусных векторов типа аденовирусов.
Таким образом, существует потребность и возможность улучшить современное лечение диабетической язвы ноги при помощи PDGF.
В случае лечения диабетической язвы ноги есть три основные цели:
ускорить выздоровление,
повысить процент выздоровлений,
упростить методику лечения.
Существуют также случаи венозных язв и язв, образующихся в местах повышенного давления, вызывающих сильные боли и очень серьезные медицинские осложнения.
Проблемой, требующей решения, является, таким образом, защита PDGF в хронической ране.
Были предложены различные решения.
В патенте US 5905142 описано средство для решения этих проблем протеолиза в отношении PDGF путем генерирования мутантных белков, обладающих повышенной устойчивостью в отношении протеолитических атак, замещая или устраняя одну или несколько аминокислот лизин или аргинин, близких к потенциальным сайтам расщепления. Эта стратегия, направленная на повышение устойчивости белка в отношении протеаз, не является удовлетворительной. Эта генная модификация PDGF может привести к изменению биологической активности в связи с различным сродством в отношении этих разных рецепторов, что может также вызвать токсикологические проблемы. Кроме того, такая модификация PDGF требует новых фармацевтических разработок, очень дорогостоящих и носящих случайный характер.
В 1970-х годах, когда этот белок активно изучали, было обнаружено, что очистка была чрезвычайно сложной, так как PDGF является “очень клейким белком” в том, что касается его катионных и гидрофобных свойств (Heldin C.H. EMBO j. 11; 4251-4259, 1992; Raines and Ross, J.Biol.Chem. 257(9); 5154-5160, 1982; Antoniades, PNAS 78; 7314, 1981; Deuel et al., J.Biol.Chem. 256:8896, 1981). PDGF, действительно, является высококатионным белком, изоэлектрическая точка которого находится в интервале от 9,8 до 10,5. Другие авторы подтверждают это свойство, например Wei et al. (Journal of controlled release 112;103-110, 2006), и поясняют, что PDGF легко адсорбируется поверхностями вещества, в котором он растворен. Однако эти решения не являются удовлетворительными с фармацевтической точки зрения в связи с животным происхождением BSA и рисками, связанными с губчатой энцефалопатией крупного рогатого скота.
Другое решение, предложенное теми же авторами, заключается в том, чтобы добавлять более сильное анионное поверхностно-активное вещество (SDS), которое позволяет сохранять PDGF в растворе. К несчастью, SDS также вызывает частичную денатурацию белка, ведущую к потере биоактивности. Это решение не является удовлетворительным для стабилизации протеина.
В патенте WO 93/08825 авторы выявили, что очищенный PDGF обладает высокой неустойчивостью, если он входит в состав препарата в форме геля для топического нанесения. В качестве примера они приводят несовместимость PDGF с рядом продуктов, традиционно используемых в составе фармацевтических продуктов, таких как метилцеллюлоза или гидроксипропилцеллюлоза, а также с рядом традиционных консервантов, таких как бензиловый спирт. Авторы указывают на проблему в целом, поясняя, что существует потребность в получении лекарственной формы в виде геля, содержащей PDGF, для местного применения, обеспечивая при этом его устойчивость в течение длительного времени. Те же авторы показывают, что PDGF в растворе распадается под действием процесса деамидирования с нейтральным рН и что белок более устойчив при слабокислом рН. Авторы показывают, что, комбинируя несколько параметров: полимер, не взаимодействующий с белком, буфер со слабокислым рН, позволяющий ограничивать реакцию деамидирования, и консервант, нейтральный к белку, можно включить PDGF в состав лекарственной формы, устойчивой с фармацевтической точки зрения.
Авторы показывают, что можно получить состав, устойчивый при хранении путем добавки полимера, не взаимодействующего с белком в условиях поддержания слабокислого рН с тем, чтобы избежать реакций разложения при деамидировании белка. Это решение, тем не менее, не является удовлетворительным, так как оно не дает возможности защищать фактор роста от протеолитического разложения in vivo при физиологическом рН.
В патенте WO 97/12601, в котором описаны составы в форме геля, содержащие PDGF, авторы поясняют, что производное целлюлозы, которое они используют, может стабилизировать факторы роста в отношении вероятной потери активности при хранении. При этом они основываются на результатах, полученных ранее по EGF в патенте US 4,717,717. Однако они также поясняют, что устойчивость целлюлозного геля, содержащего PDGF, можно существенно улучшить путем добавления в состав заряженного химического вещества, такого как заряженные аминокислоты или металлические ионы. Это решение позволяет стабилизировать факторы роста, содержащиеся в составе, во время хранения продукта, но не обеспечивает устойчивость этих факторов в отношении протеаз, присутствующих на уровне хронических ран при физиологическом рН.
Таким образом, в области терапии существует потребность в стабилизации и защите факторов роста и, в частности, PDGF, с тем, чтобы повысить его эффективность в рамках терапевтического лечения хронических ран и, более конкретно, диабетических язв ноги. Таким образом, изобретение относится к стабилизации PDGF в отношении химического или физического разложения, которое может происходить при физиологическом рН in vitro и in vivo, путем разработки комплекса амфифильного полимера и PDGF.
Таким образом, изобретение относится к образованию комплекса амфифильного полимера и PDGF (амфифильный полимер- PDGF), причем указанный комплекс обеспечивает химическую и физическую устойчивость протеина в отношении разложения при физиологическом рН in vitro и in vivo.
Таким образом, настоящее изобретение относится к полимерному комплексу амфифильный полимер-PDGF, обладающему химической и физической устойчивостью, растворимому в воде, отличающемуся тем, что:
амфифильные полимеры состоят из гидрофильного полимерного скелета, функционализированного гидрофобными заместителями и гидрофильными группами, соответствующего следующей общей формуле:
при этом
R, R' обозначают связь или цепочку, содержащую от 1 до 18 атомов углерода, возможно разветвленную и/или ненасыщенную, содержащую один или несколько гетероатомов, таких как O, N или/и S,
R, R' являются одинаковыми или разными,
F, F' обозначают сложный эфир, сложный тиоэфир, амид, карбонат, карбамат, простой эфир, простой тиоэфир, амин,
F, F' являются одинаковыми или разными,
Х обозначает гидрофильную группу, которой может являться:
Карбоксилат
Сульфат
Сульфонат
Фосфат
Фосфонат.
Y обозначает гидрофильную группу, которой может являться:
Сульфат
Сульфонат
Фосфат
Фосфонат.
Ну обозначает гидрофобную группу, которой может являться:
линейный или разветвленный (С8-С30)алкил, возможно ненасыщенный и/или содержащий один или несколько гетероатомов, таких как O, N или S,
линейный или разветвленный (С8-С18)алкиларил или арилалкил, возможно ненасыщенный и/или возможно содержащий один гетероатом,
(С8-С30)полициклил, возможно ненасыщенный,
n и о составляют от 1 до 3,
h обозначает молярную фракцию звена, гидрофобного по отношению к мономерной единице, составляющую от 0,01 до 0,5,
х обозначает молярную фракцию групп, гидрофильных по отношению к мономерной единице, составляющую от 0 до 2,0,
y обозначает молярную фракцию групп, гидрофильных по отношению к мономерной единице, составляющую от 0 до 0,5.
PDGF выбирают из группы PDGF (Platelet-Derived Growth factors).
Изобретение относится к комплексу, отличающемуся тем, что PDGF выбирают из группы рекомбинантных PDGF человека, содержащих две цепочки В (rhPDGF-BB).
Оно относится к комплексу, отличающемуся тем, что PDGF является PDGF-BB.
Заместители амфифильных полимеров распределены контролируемым и статистическим образом. Из полимеров, имеющих контролируемое распределение заместителей, можно, например, назвать блок-сополимеры и чередующиеся сополимеры.
Таким образом, в варианте осуществления изобретение также относится к комплексу амфифильный полимер-PDGF, отличающемуся тем, что полимер выбирают из полимеров, заместители которых распределены статистически.
В одном варианте осуществления изобретение также относится к комплексу амфифильный полимер-PDGF, отличающемуся тем, что амфифильный полимер выбирают из полиаминокислот.
В одном варианте осуществления полиаминокислоты выбирают из группы, состоящей из полиглутаматов и полиаспартатов.
В одном варианте осуществления полиаминокислоты являются гомополиглутаматами.
В одном варианте осуществления полиаминокислоты являются гомополиаспартатами.
В одном варианте осуществления полиаминокислоты являются сополимерами аспартата и глютамата. Эти сополимеры являются или блочными, или статистическими.
В одном варианте осуществления изобретение относится также к комплексу амфифильный полимер-PDGF, отличающемуся тем, что полимер выбирают из полисахаридов.
В одном варианте осуществления полисахариды выбирают из группы, содержащей гиалуронаны, альгинаты, хитозаны, галактуронаны, хондроитинсульфат, декстраны, целлюлозы.
Группа целлюлоз состоит из целлюлоз, функционализированных кислотами, таких как карбоксиметилцеллюлоза.
Группа декстранов состоит из декстранов, функционализированных кислотами, таких как карбоксиметилдекстран.
В одном варианте осуществления полисахарид является растворимым производным декстрана, соответствующим следующей формуле (1)
DMCaBbSuc (1),
в которой:
D обозначает полисахаридную цепочку, предпочтительно состоящую из цепочек глюкозидных единиц,
МС обозначает метилкарбоновые группы,
В обозначает N-бензилметиленкарбоксамидные группы,
Su обозначает сульфатные группы (сульфатирование свободных гидроксильных функциональных групп, связанных с глюкозидными единицами),
а, b, и c обозначают степень замещения (ds) групп МС, В и Su соответственно, причем
i) а строго больше 0;
ii) b является таким, что
или b больше или равно 0,3 и с составляет от 0,1 до 0,5;
или b строго ниже 0,3 и с соответствует следующему равенству (1):
c≥8,5 b2-5,41 b+0,86 (1)
Эти производные декстрана формулы (1), а также способ их получения описаны в заявке на патент WO 99/29734. Эти производные декстрана формулы (1) обычно называют DMCBSu и рассматривают как сополимеры, состоящие из подгрупп R-OH и R-OX, причем Х может быть метилкарбоновой группой (МС), бензиламидом (В) или сульфатом (Su). Так метилкарбоновый декстран (DMC) со степенью замещения (ds) 0,6 по метилкарбоновым группам содержит 0,6 замещенной группы (R-МС) и 2,4 гидроксильных групп (R-ОН) на глюкозидную единицу.
В одном варианте осуществления молярная масса D составляет от 1000 до 2000000 Da и в варианте осуществления меньше 70000 Da.
В одном варианте осуществления производные декстрана выбирают из соединений формулы (1), в которой b больше или равно 0,35.
В этом случае и в соответствии с одним вариантом осуществления производные декстрана выбирают из соединений формулы (1), в которых а составляет от 0,5 до 0,8 и с составляет от 0,1 до 0,5.
В одном варианте осуществления полисахариды выбирают из группы, состоящей из гиалуронанов, альгинатов, хитозанов.
Эти разные полисахариды можно обозначить следующим образом:
Средняя степень полимеризации m полисахарида может составлять от 10 до 10000.
В одном варианте осуществления его средняя степень полимеризации m составляет от 10 до 5000.
В другом варианте осуществления его средняя степень полимеризации m составляет от 10 до 500.
В одном варианте осуществления изобретение также относится к комплексу амфифильный полимер-PDGF, отличающемуся тем, что гидрофобную группу Ну выбирают из группы, состоящей из жирных кислот, жирных спиртов, жирных аминов, бензиловых аминов, производных холестерина и фенолов.
В одном варианте осуществления производным холестерина является холевая кислота.
В одном варианте осуществления фенолом является альфа-токоферол.
В одном варианте осуществления комплекс амфифильный полимер-PDGF является обратимым.
Используемые полимеры синтезируют методами, известными специалисту, или покупают у поставщиков, таких, например, как Sigma-Aldrich, Nof Corp., CarboMer Inc.
PDGF выбирают из рекомбинантных PDGF человека, полученных методами, известными специалисту, или покупают у поставщиков, таких, например, как фирмы Gentaur (USA) или Research Diagnostic Inc. (USA).
Выявление химической и физической устойчивости одновременно осуществляют, в частности, при помощи следующих тестов:
тест на обнаружение комплекса амфифильный полимер-PDGF по изобретению, выполняемый гель-электрофорезом (Gel Mobility Shift Assay);
тест на замедление ферментативного разложения комплекса амфифильный полимер-PDGF по изобретению, выполняемый путем приведения в контакт с протеазой;
тест на физическую стабилизацию комплекса амфифильный полимер-PDGF по изобретению при физиологическом рН, выполняемый при помощи SDS-Page.
Изобретение также относится к комплексу амфифильный полимер-PDGF, отличающемуся тем, что он является удовлетворительным по результатам тестов на обнаружение химической и физической стабилизации, а именно теста на обнаружение комплекса (Gel Mobility Shift Assay), теста на замедление ферментативного разложения путем приведения в контакт с протеазой и теста на физическую стабилизацию комплекса при физиологическом рН, выполняемого при помощи SDS-Page.
Тест на обнаружение комплекса, выполняемый при помощи Gel Mobility Shift Assay, основан на перемещении ионов под действием электрического поля. Анионные комплексы мигрируют к аноду, а катионные комплексы перемещаются к катоду. После миграции белки перемещаются под действием капиллярности на мембрану PVDF и обнаруживаются при помощи специфического антитела белка, распознаваемого вторым антителом, связанным с пероксидазой. Белок один не мигрирует или мигрирует незначительно, белок в комплексе с амфифильным полимером мигрирует к аноду или катоду в зависимости от общего заряда комплекса.
Тест на замедление ферментативного разложения основан на проверке целостности белка после контакта комплекса амфифильный полимер-PDGF по изобретению с протеазой, раствор протеазы (трипсин, химотрипсин) вводят в раствор комплекса и проводят кинетическую реакцию. Реакцию останавливают путем добавления специфического ингибитора фермента (индола, бензамидина). Целостность белка затем анализируют электрофорезом на полиакриламидном геле (SDS-Page).
Тест на физическую устойчивость PDGF основан на проверке целостности белка путем сравнения концентрации белка в растворе комплекса амфифильный полимер-PDGF по изобретению и в растворе одного PDGF с рН 7,4. Оба раствора помещают на испытательный стенд на 48 часов при комнатной температуре, после чего подвергают центрифугированию. Концентрацию PDGF в каждом из растворов оценивают при помощи SDS-Page.
Комплекс амфифильный полимер-PDGF по изобретению образуется путем растворения PDGF и амфифильного полимера с физиологическим рН в воде без использования органического растворителя, способного денатурировать белок. Образование комплекса амфифильный полимер-PDGF является спонтанным и не требует образования ковалентной связи между PDGF и амфифильным полимером. Эта ассоциация возникает посредством слабых связей, которые представляют собой, главным образом, гидрофобные взаимодействия и ионные взаимодействия.
Изобретение относится также к способу получения комплекса амфифильный полимер-PDGF по изобретению, отличающемуся тем, что вводят в контакт PDGF и амфифильный полимер в растворе с физиологическим рН.
Для обнаружения образования комплекса амфифильный полимер-PDGF по изобретению можно дополнительно провести другие тесты:
тест на поддержание третичной структуры PDGF на основании кругового дихроизма,
тест на устойчивость PDGF в комплексе амфифильный полимер-PDGF по изобретению при физиологическом рН в условиях стресса. Стрессом может быть особый способ перемешивания, присутствие солей и т.д.
Изобретение относится также к комплексу амфифильный полимер-PDGF по изобретению, отличающемуся тем, что соотношение PDGF/амфифильный полимер составляет от 1/5 до 1/5000.
В одном варианте осуществления оно составляет от 1/100 до 1/5000.
В одном варианте осуществления оно составляет от 1/300 до 1/700.
Изобретение относится также к терапевтической композиции, отличающейся тем, что она содержит комплекс амфифильный полимер-PDGF по изобретению.
Под терапевтической композицией понимают композицию, применяемую в медицине или в ветеринарии.
Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно является композицией для топического нанесения, которая может иметь форму геля, крема, спрея или пасты, или пластыря.
Эксципиенты, которые могут входить в состав композиции вместе с комплексом амфифильный полимер-PDGF по изобретению, выбирают в зависимости от формы композиции в соответствии с общими знаниями галениста.
Таким образом, если композиция по изобретению имеет форму геля, последний является, например, гелем, полученным из полимеров, таких как карбоксиметилцеллюлозы (СМС), виниловые полимеры, сополимеры типа РЕО-РРО, полисахариды, РЕО, акриламиды или производные акриламидов.
Другие эксципиенты можно использовать в этом изобретении с тем, чтобы регулировать параметры состава, такие как буферный раствор для регулировки рН, агент, позволяющий регулировать изотоничность, консерванты, такие как метила парагидроксибензоат, пропила парагидроксибензоат, m-креазол или фенол или антиоксидант, такой как L-лизина хлоргидрат.
Терапевтическая композиция по изобретению отличается тем, что позволяет применять примерно 100 мкг/мл PDGF.
Настоящее изобретение также относится к применению комплекса амфифильный полимер-PDGF по изобретению для получения терапевтической композиции с заживляющим действием, предназначенной для лечения язв путем топического нанесения.
Оно также относится к методу терапевтического лечения людей или животных, отличающемуся тем, что он заключается в нанесении на область, подлежащую лечению, терапевтической композиции, содержащей комплекс амфифильный полимер-PDGF по изобретению.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: комплекс PDGF-ВВ/DMCBSu
Синтез сульфатированного карбоксиметилдекстрана, модифицированного бензиламином (DMCBSu)
Амфифильный полимер синтезируют из карбоксиметилдекстрана со степенью замещения по карбоксиметилу сахаридной единицей 1,0, и со средней молекулярной массой 40000 г/моль. Бензиламин прививают на кислоты этого полимера традиционным методом связывания в воде в присутствии водорастворимого карбодиимида. Степень замещения бензиламина сахаридной единицей, определяемая при помощи ЯМР 1Н, составляет 0,4. Этот полимер затем сульфатируют комплексом SO3/пиридин. Степень замещения по сульфату сахаридной единицей составляет 0,3.
Получение комплекса PDGF-ВВ/DMCBSu
10 мкл раствора PDGF-ВВ в концентрации 0,1 мг/мл вводят в 90 мкл раствора DMCBSu в концентрации 50 мг/мл. В растворы PDGF-ВВ и DMCBSu вводят буфер до получения рН 7,4 и 300 mOsm. Этот раствор подвергают слабому перемешиванию в течение 2 часов при комнатной температуре, затем хранят при 4°С.
Обнаружение образования комплекса PDGF-ВВ/DMCBSu
10 мкл раствора комплекса PDGF-ВВ/DMCBSu, описанного выше, наносят на гель агарозы. Миграция соединений происходит под действием электрического поля (200mA-4 часа). После миграции PDGF-ВВ переносятся на мембрану PVDF на одну ночь, затем идентифицируют иммуноблотингом при помощи анти-PDGF-ВВ антител козы, к которым прикрепляются вторичные анти-lgG антитела козы, связавшиеся с пероксидазой HRP, обнаруженной субстратом (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолмий).
Комплекс PDGF-ВВ/DMCBSu мигрирует к аноду. Его отрицательный заряд объясняется тем, что его состав содержит значительно больше DMCBSu, чем PDGF-ВВ. Контрольный образец, состоящий только из PDGF-ВВ, не мигрирует.
Выявление устойчивости раствора комплекса PDGF-ВВ/DMCBSu
10 мкл раствора PDGF-ВВ в концентрации 0,01 мг/мл, имеющего рН 7,4, и 10 мкл раствора комплекса PDGF-ВВ/DMCBSu, имеющего рН 7,4, описанного выше, помещают на испытательный стенд для перемешивания на 48 часов при комнатной температуре. После центрифугирования концентрацию PDGF-ВВ в каждом из растворов определяют при помощи SDS-Page. Оказывается, что концентрация PDGF-ВВ в растворе комплекса PDGF-ВВ/DMCBSu не изменилась, тогда как концентрация в растворе одного PDGF-ВВ понизилась.
Выявление защиты PDGF-ВВ от трипсина в указанном комплексе PDGF-ВВ/DMCBSu.
10 мкл раствора комплекса BMP-2/DMCTrpOMe, описанного выше, опрокидывают в 90 мкл раствора трипсина в концентрации 10 нг/мл при 37°С.
Берут пробу, объемом 10 мкл, и измеряют концентрацию PDGF-ВВ каждые 30 минут при помощи Elisa после остановки ферментативной реакции путем добавления раствора 10 мкл индола 10 мкг/мл.
Эта кинетика показывает, что PDGF-ВВ в чистом виде полностью разложился в течение 1 часа 30 минут, тогда как в комплексе PDGF-ВВ/DMCBSu этого не произошло.
Оценка биологической активности комплекса PDGF-ВВ/DMCBSu
Первичное культивирование фибробластов дермы человека (Human Dermal Fibroblast adult (HDFa)) проводят при температуре 37°С в среде αМЕМ с 10% эмбриональной бычьей сыворотки (SVF) и 1% пеницилин-стрептомицина в атмосфере, насыщенной влажностью и обогащенной СО2 (5%). Среду обновляют каждые 4 дня. Затем клеточную суспензию в культурной среде разбавляют для посева в лунки для культивирования с плотностью 5000 клеток на лунку в 96-ти луночных планшетах (фирмы Nunc).
По каждому комплекту клеток действие, стабилизирующее PDGF-ВВ, в комплексе с разными концентрациями проверяли путем введения тритийсодержащего тимидина (5000 клеток на лунку в 100 мкл). Через 24 часа после прекращения приема лекарственного препарата фибробласты стимулировали путем добавления PDGF-ВВ в разных концентрациях от 0,1 до 100 нг/мл в присутствии или в отсутствие амфифильного полимера в концентрации 1 мкг/мл. Тритийсодержащий тимидин вводили через 18 часов после стимуляции посредством PDGF-ВВ в присутствии или в отсутствие комплекса путем добавления раствора 50 мкCi/мл, то есть 0,5 мкCi на лунку. Радиоактивные атомы собирали в колбы для подсчета, лунки споласкивали 100 мкл NaOH 100 mM и радиоактивные атомы считали автоматическим счетчиком после добавления 1 мл сцинтиллирующей жидкости (Zinsser Analytic).
Полученные результаты представлены на чертеже, где количество тритийсодержащего тимидина, введенного в фибробласты (в Dpm×103), выражено в зависимости от концентрации PDGF-ВВ в мкг/мл.
Кривая, изображенная сплошной линией, показывает результаты, полученные по комплексу по изобретению, с концентрацией 1 мкг/мл производного декстрана, а кривая, изображенная пунктирной линией, показывает результаты в отсутствие производного декстрана.
ED50 соответствует концентрации PDGF-ВВ, достаточной для 50%-ной пролиферации фибробластов человека. Соотношение R обозначает отношение значений ED50, вычисляемое следующим образом:
R=ED50(PDGF-ВВ)/ED50(PDGF-ВВ+DMCBSu)
Эти результаты показывают, что если используют только PDGF-ВВ, его необходимо использовать в концентрации 6 мкг/мл для получения 50% пролиферации, тогда как если PDGF-ВВ используют в комплексе с производным декстрана формулы (1), достаточно 2 мкг/мл для получения 50% пролиферации. В этом случае соотношение R равно 3.
Пример 2: Комплекс PDGF-ВВ/DMCTrpOMe
Синтез карбоксиметилдекстрана, модифицированного сложным метиловым эфиром триптофана (DMCTrpOMe)
Амфифильный полимер синтезируют из карбоксиметилдекстрана, имеющего степень замещения по карбоксиметилу сахаридной единицей 1,0 и среднюю молярную массу 40000 г/моль. Сложный метиловый эфир триптофана прививают на кислоты этого полимера традиционным методом связывания в воде в присутствии водорастворимого карбодиимида. Степень замещения триптофана сахаридной единицей, определяемая при помощи ЯМР 1Н, составляет 0,3.
Получение комплекса PDGF-ВВ/DMCTrpOMe
10 мкл раствора PDGF-ВВ в концентрации 0,1 мг/мл вводят в 90 мкл раствора DMCTrpOMe в концентрации 50 мг/мл. В растворы PDGF-ВВ и DMCTrpOMe вводят буфер до получения рН 7,4 и 300 mOsm. Этот раствор подвергают слабому перемешиванию в течение 2 часов при комнатной температуре, затем хранят при 4°С.
Обнаружение образования комплекса PDGF-ВВ/DMCTrpOMe
10 мкл раствора комплекса PDGF-ВВ/DMCTrpOMe, описанного выше, наносят на гель агарозы для проведения гель-электрофореза с иммунологическим обнаружением. Миграция соединений происходит под действием электрического поля (200mA-4 часа). После миграции PDGF-ВВ переносят на мембрану PVDF на одну ночь, затем идентифицируют иммуноблотингом при помощи анти-PDGF-ВВ антител козы, к которым прикрепляются вторичные анти-lgG антитела козы, связываемые с пероксидазой, обнаруженной субстратом (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий).
Комплекс PDGF-ВВ/DMCTrpOMe мигрирует к аноду. Его отрицательный заряд объясняется тем, что его состав содержит значительно больше DMCTrpOMe, чем PDGF-ВВ. Контрольный образец, состоящий только из PDGF-ВВ, не мигрирует.
Выявление устойчивости раствора комплекса PDGF-ВВ/DMCTrpOMe
10 мкл раствора PDGF-ВВ в концентрации 0,01 мг/мл, имеющего рН 7,4, и 10 мкл раствора комплекса PDGF-ВВ/DMCTrpOMe, имеющего рН 7,4, описанного выше, помещают на испытательный стенд для перемешивания на 48 часов при комнатной температуре. Концентрацию PDGF-ВВ в каждом из растворов определяют при помощи SDS-Page. Оказалось, что концентрация PDGF-ВВ в растворе комплекса PDGF-ВВ/DMCTrpOMe не изменилась, тогда как концентрация в растворе одного PDGF-ВВ понизилась.
Выявление защиты PDGF-ВВ от трипсина в указанном комплексе PDGF-ВВ/DMCTrpOMe
10 мкл раствора комплекса BMP-/DMCTrpOMe, описанного выше, инкубируют с 90 мкл раствора трипсина в концентрации 10 нг/мл при 37°С. Берут пробу, объемом 10 мкл, каждые 30 минут и структурную целостность PDGF-ВВ оценивают при помощи электрофореза на полиакриламидном геле (SDS-Page) после остановки ферментативной реакции путем добавления 10 мкл раствора индола 10 мкг/мл.
Эта кинетика показывает, что PDGF-ВВ в чистом виде полностью разложился в течение 1 часа 30 минут, тогда как в комплексе PDGF-ВВ/DMCTrpOMe этого не произошло.
Пример 3: Комплекс PDGF-ВВ/CMCBSu
Синтез сульфатированной карбоксиметилцеллюлозы, модифицированной бензиламином (CMCBSu)
Амфифильный полимер синтезируют из карбоксиметилцеллюлозы со степенью замещения по карбоксиметилу сахаридной единицей 1,2 и со средней молекулярной массой 30000 г/моль. Бензиламин прививают на кислоты этого полимера традиционным методом связывания в воде в присутствии водорастворимого карбодиимида. Степень замещения бензиламина сахаридной единицей, определяемая при помощи ЯМР 1Н, составляет 0,2. Сульфатирование осуществляют в присутствии комплекса SO3/пиридин, степень замещения сульфата составляет 0,30.
Получение комплекса PDGF-ВВ/CMCBSu
10 мкл раствора PDGF-ВВ в концентрации 0,1 мг/мл вводят в 90 мкл раствора CMCB в концентрации 50 мг/мл. В растворы PDGF-ВВ и CMCBSu вводят буфер до получения рН 7,4 и 300 mOsm. Этот раствор подвергают слабому перемешиванию в течение 2 часов при комнатной температуре, затем хранят при 4°С.
Обнаружение образования комплекса PDGF-ВВ/CMCBSu
10 мкл раствора комплекса PDGF-ВВ/CMCBSu, описанного выше, наносят на гель агарозы для проведения гель-электрофореза с иммунологическим обнаружением. Миграция соединений происходит под действием электрического поля (200mA-4 часа). После миграции PDGF-ВВ переносят на мембрану PVDF на одну ночь, затем идентифицируют иммуноблотингом при помощи анти-PDGF-ВВ антител козы, к которым прикрепляются вторичные анти-lgG антитела козы, связываемые с пероксидазой HRP, выявленной субстратом (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий.
Комплекс PDGF-ВВ/CMCBSu мигрирует к аноду. Его отрицательный заряд объясняется тем, что его состав содержит значительно больше CMCBSu, чем PDGF-ВВ. Контрольный образец, состоящий только из PDGF-ВВ, не мигрирует.
Выявление устойчивости раствора комплекса PDGF-ВВ/CMCBSu
10 мкл раствора PDGF-ВВ в концентрации 0,01 мг/мл, имеющего рН 7,4, и 10 мкл раствора комплекса PDGF-ВВ/CMCBSu, имеющего рН 7,4, описанного выше, помещают на испытательный стенд для перемешивания на 48 часов при комнатной температуре. После центрифугирования концентрацию PDGF-ВВ в каждом из растворов определяют при помощи SDS-Page. Оказалось, что концентрация PDGF-ВВ в растворе комплекса PDGF-ВВ/CMCBSu не изменилась, тогда как концентрация в растворе одного PDGF-ВВ понизилась.
Выявление защиты PDGF-ВВ от трипсина в указанном комплексе PDGF-ВВ/CMCBSu
10 мкл раствора комплекса PDGF-ВВ/CMCBSu, описанного выше, инкубируют с 90 мкл раствора трипсина в концентрации 10нг/мл при 37°С. Берут пробу, объемом 10 мкл, каждые 30 минут и структурную целостность PDGF-ВВ оценивают при помощи электрофореза на полиакриламидном геле (SDS-Page) после остановки ферментативной реакции путем добавления раствора 10 мкл раствора индола 10 мкг/мл.
Эта кинетика показывает, что PDGF-ВВ в чистом виде полностью разложился в течение 1 часа 30 минут, тогда как в комплексе PDGF-ВВ/DMCBSu этого не произошло.
Контрпример 1: комплекс PDGF-ВВ/CMCB
Синтез карбоксиметилцеллюлозы, модифицированной бензиламином (CMCB)
Амфифильный полимер синтезируют из карбоксиметилцеллюлозы со степенью замещения по карбоксиметилу сахаридной единицей, составляющей 1,2, и со средней молекулярной массой 30000 г/моль. Бензиламин прививают на кислоты этого полимера традиционным методом связывания в воде в присутствии водорастворимого карбодиимида. Степень замещения бензиламина сахаридной единицей, определенная при помощи ЯМР 1Н, составляет 0,2.
Получение комплекса PDGF-ВВ/CMCB
10 мкл раствора PDGF-ВВ в концентрации 0,1 мг/мл вводят в 90 мкл раствора CMCB в концентрации 50 мг/мл. В растворы PDGF-ВВ и CMCB вводят буфер до получения рН 7,4 и 300 mOsm. Этот раствор подвергают слабому перемешиванию в течение 2 часов при комнатной температуре, затем хранят при 4°С.
Выявление отсутствия образования комплекса PDGF-ВВ/CMCB
10 мкл раствора комплекса PDGF-ВВ/CMCB, описанного выше, наносят на гель агарозы для проведения гель-электрофореза с иммунологическим обнаружением. Миграция соединений происходит под действием электрического поля (200mA-4 часа). После миграции PDGF-ВВ переносят на мембрану PVDF на одну ночь, затем обнаруживают иммуноблотингом при помощи анти-PDGF-ВВ антител козы, к которым прикрепляются вторичные анти-lgG антитела козы, связываемые с пероксидазой HRP, обнаруженной субстратом (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий).
Миграция одного PDGF-ВВ с амфифильным полимером не выявлена. Комплекс PDGF-ВВ и CMCB не был образован.
Изобретение относится к новым комплексам Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), ассоциированным с амфифильными полимерами, обеспечивающим физическую и химическую устойчивость протеина в отношении разложения при физиологическом рН in vitro и in vivo для применения в фармацевтике. Комплекс амфифильный полимер-PDGE обладает химической и физической устойчивостью, растворим в воде, при этом полимер выбран из полисахаридов. Полимер состоит из гидрофильного полимерного скелета, функционализированного гидрофобными заместителями и гидрофильными группами. Изобретение также относится к способу получения комплекса амфифильный полимер-PDGF, который получают в водной среде в отсутствие органического растворителя, способного денатурировать белок, и к применению указанного комплекса амфифильный полимер-PDGF для получения терапевтической композиции с заживляющим действием, предназначенной для лечения язв путем топического нанесения. Технический результат - улучшение физической и химической устойчивости in vitro и in vivo терапевтического белка. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 1 ил.
1. Комплекс амфифильный полимер-PDGF, обладающий химической и физической устойчивостью, растворимый в воде, отличающийся тем, что:
амфифильные полимеры состоят из гидрофильного полимерного скелета, функционализированного гидрофобными заместителями и гидрофильными группами, соответствующего следующей общей формуле:
при этом полимер выбран из полисахаридов,
R, R' обозначают связь или цепочку, содержащую от 1 до 18 атомов углерода, возможно разветвленную и/или ненасыщенную, содержащую один или несколько гетероатомов, таких как О, N или/и S,
R, R' являются одинаковыми или разными,
F, F' обозначают сложный эфир, сложный тиоэфир, амид, карбонат, карбамат, простой эфир, простой тиоэфир, амин,
F, F' являются одинаковыми или разными,
Х обозначает гидрофильную группу, которой может являться:
Карбоксилат
Сульфат
Сульфонат
Фосфат
Фосфонат
Y обозначает гидрофильную группу, которой может являться:
Сульфат
Сульфонат
Фосфат
Фосфонат
Ну обозначает гидрофобную группу, которой может являться:
линейный или разветвленный (С8-С30)алкил, возможно ненасыщенный и/или содержащий один или несколько гетероатомов, таких как О, N или S,
линейный или разветвленный (С8-С18)алкиларил или арилалкил, возможно ненасыщенный и/или возможно содержащий один гетероатом,
(С8-С30)полициклил, возможно ненасыщенный,
n и о составляют от 1 до 3,
h обозначает молярную фракцию звена, гидрофобного по отношению к мономерной единице, составляющую от 0,01 до 0,5,
х обозначает молярную фракцию групп, гидрофильных по отношению к монометрической единице, составляющую от 0 до 2,0,
y обозначает молярную фракцию групп, гидрофильных по отношению к мономерной единице, составляющую от 0 до 0,5,
PDGF выбирают из группы PDGF (Platelet-Derived Growth factors).
2. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что PDGF выбирают из группы рекомбинантных PDGF человека, содержащих две цепочки В (rhPDGF-ВВ).
3. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что полисахариды выбирают из группы, содержащей гиалуронаны, альгинаты, хитозаны, галактуронаны, хондроитинсульфат, декстраны, целлюлозы.
4. Комплекс по п.3, отличающийся тем, что группа целлюлоз состоит из целлюлоз, функционализированных кислотами, таких как карбоксиметилцеллюлоза.
5. Комплекс по п.3, отличающийся тем, что группа декстранов состоит из декстранов, функционализированных кислотами, таких как карбоксиметилдекстран.
6. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что полисахариды выбирают из группы, состоящей из производных растворимого декстрана, соответствующих следующей формуле (1)
DMCaBbSuc (1)
в которой D обозначает полисахаридную цепочку, предпочтительно состоящую из цепочек глюкозидных единиц,
МС обозначает метилкарбоновые группы,
В обозначает N-бензилметиленкарбоксамидные группы,
Su обозначает сульфатные группы (сульфатирование свободных гидроксильных функциональных групп, связанных с глюкозидными единицами),
а, b и с обозначают степень замещения (ds) групп МС, В и Su соответственно, причем i) а строго больше 0;
ii) b является таким, что
или b больше или равно 0,3 и с составляет от 0,1 до 0,5;
или b строго ниже 0,3 и с соответствует следующему равенству (1):
c≥8,5 b2-5,41 b+0,86 (1)
7. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что гидрофобную группу Ну выбирают из группы, состоящей из жирных кислот, жирных спиртов, жирных аминов, бензиловых аминов, производных холестерина и фенолов.
8. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что образование комплекса амфифильный полимер-PDGF является обратимым.
9. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что он является удовлетворительным по результатам тестов на обнаружение химической и физической устойчивости.
10. Комплекс по п.9, отличающийся тем, что тесты на обнаружение химической и физической устойчивости выбирают из группы, состоящей из теста на обнаружение комплекса (Gel Mobility Shift Assay), теста на замедление ферментативного разложения путем приведения в контакт с протеазой и теста на физическую стабилизацию комплекса при физиологическом рН, выполняемого при помощи SDS-Page.
11. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что соотношение PDGF/амфифильный полимер составляет от 1/5 до 1/5000.
12. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что соотношение PDGF/амфифильный полимер составляет от 1/100 до 1/5000.
13. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что соотношение PDGF/амфифильный полимер составляет от 1/300 до 1/700.
14. Способ получения комплекса амфифильный полимер/PDGF по п.1, отличающийся тем, что этот комплекс амфифильный полимер/PDGF-BB получают в водной среде и в отсутствие органического растворителя, способного денатурировать белок.
15. Терапевтическая композиция с заживляющим действием, предназначенная для лечения язв путем топического нанесения, отличающаяся тем, что она содержит комплекс амфифильный полимер/PDGF по п.1.
16. Терапевтическая композиция по п.15, отличающаяся тем, что она позволяет вводить примерно 100 мкг на мл PDGF.
17. Применение комплекса амфифильный полимер-PDGF по п.1 для получения терапевтической композиции с заживляющим действием, предназначенной для лечения язв путем топического нанесения.
| Самоориентирующийся радиокомпас | 1939 |
|
SU76562A3 |
| Способ образования фасок на зубцах зубчатых барабанов | 1948 |
|
SU76452A1 |
| EP 1369136 А1, 10.12.2003 | |||
| МАТЕРИАЛ ДЛЯ ПЕРЕВЯЗКИ РАН, СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ, ХИРУРГИЧЕСКОЙ ИЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ РАНЫ, С ПОВЕРХНОСТИ КОТОРОЙ СОЧАТСЯ ВЫДЕЛЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) | 1994 |
|
RU2135212C1 |
| ПОЛИСАХАРИД С ПРИВИТЫМ АНТИОКСИДАНТОМ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 1996 |
|
RU2174985C2 |
