Композиции и способы доставки терапевтических средств Российский патент 2017 года по МПК A61K9/14 A61K31/535 A61K31/496 A61K31/426 A61K47/30 B82B1/00 B82Y5/00 A61P31/18 

В соответствии с §119 (е) Патентного закона США раздела 35 настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/409372, поданной 2 ноября 2010 года, и предварительной заявки на патент США №61/526976, поданной 24 августа 2011 года. Вышеупомянутая заявка включена в данный документ посредством ссылки.

Настоящее изобретение выполнено при правительственной поддержке в рамках гранта №1P01DA026146-01, предоставленного Национальными институтами здравоохранения/Национальным институтом по вопросам злоупотребления наркотическими средствами. Правительство имеет определенные права на настоящее изобретение.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение, в основном, относится к доставке терапевтических средств. А именно, настоящее изобретение относится к композициям и способам доставки терапевтических средств пациенту для лечения вирусной инфекции.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Необходимость в улучшении биодоступности, фармакологии, цитотоксичности и интервала дозирования противоретровирусных лекарственных препаратов в лечении инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека (HIV), широко известна (Broder, S. (2010) Antivir. Res., 85:1-18; Este et a 1. (2010) Antivir. Res., 85:25-33; Moreno et al. (2010) J. Antimlcrob. Chemother., 65:827-835). После внедрения противоретровирусной терапии (ART) значительно снизились случаи, как летальных исходов, так и сопутствующих заболеваний, ассоциированных с HIV-1 инфекцией. Было показано, у что составленного в наночастицы индинавира (IDV) может улучшаться поиск тканей-мишеней и противоретровирусная эффективность (Dou et al. (2006) Blood 108:2827-2835; Dou et al. (2009) J. Immunol. 183:661-669; Dou et al. (2007) Virology 358:148-158; Nowacek et al. (2009) Nanomedicine 4:903-917). Однако все еще остаются многие ограничения, ассоциированные с ART, которые препятствуют полной супрессии репликации вируса у HIV-инфицированных индивидуумов. Эти ограничения включают неудовлетворительную фармакокинетику (РК) и поиск тканей-мишеней, пожизненное лечение и множество неблагоприятных токсических побочных эффектов (Garvie et al. (2009) J. Adolesc. Health 44:124-132; Hawkins, Т. (2006) AIDS Patient Care STDs 20:6-18; Royal et al. (2009) AIDS Care 21:448-455). Поскольку противоретровирусные лекарственные препараты быстро выводятся из организма и не до конца проникают во все органы, схемы дозирования обычно бывают сложными и предполагают большие количества лекарственного средства. Пациентам тяжело надлежащим образом следовать рекомендациям терапии, что приводит к неоптимальному соблюдению рекомендаций и повышенному риску развития вирусной резистентности, результатом чего может быть безуспешность лечения и ускоренное прогрессирование заболевания (Danel et al. (2009) J. Infect. Dis. 199:66-76). Для HIV-инфицированных пациентов, у которых также имеются психиатрические и психические расстройства и/или злоупотребление наркотическими средствами, точное соблюдение рекомендаций терапии является даже более сложным (Meade et al. (2009) AIDS Patient Care STDs 23:259-266; Baum et al. (2009) J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 50:93-99). В этой связи, существует необходимость в системах доставки лекарственных средств, которые оптимизируют поглощение клеткой, улучшают внутриклеточную стабильность, расширяют высвобождение лекарственного средства, поддерживают противоретровирусную эффективность и минимизируют клеточную токсичность внутри транспортирующих клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с настоящим изобретением обеспечиваются кристаллические наночастицы, содержащие по меньшей мере одно терапевтическое средство и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. В конкретном варианте осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой амфифильный блок-сополимер. В конкретном варианте осуществления поверхностно-активное вещество связано по меньшей мере с одним нацеливающим лигандом, таким как макрофаг-нацеливающий лиганд. В конкретном варианте осуществления терапевтическое средство представляет собой противовирусное, противоретровирусное соединение или соединение против HIV. Также обеспечиваются композиции, содержащие по меньшей мере наночастицу по настоящему изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечиваются способы нацеливания терапевтических средств на орган(ы) и способы лечения, подавления или предупреждения заболевания или расстройства у субъекта. В конкретном варианте осуществления способ включает введение субъекту по меньшей мере одной наночастицы по настоящему изобретению. В конкретном варианте осуществления способ включает нацеливание терапевтического средства на головной мозг. В конкретном варианте осуществления способы служат для лечения, подавления или предупреждения HIV-инфекции, и терапевтическое средство наночастицы представляет собой соединение против HIV. В конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства или терапии заболевания или расстройства, например, по меньшей мере одно добавочное соединение против HIV.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фигуре 1 представлены фотоснимки морфологии nanoART и включения nanoART в клетку. Анализы с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) (увеличение 15000х) составов с наночастицами IDV (М1001-М1005), RTV (M2001-M2005), ATV (М3001-М3005) и EFV (M4001-M4005) на верхней поверхности поликарбонатной мембраны для фильтрации толщиной 0,2 мкм. Все IDV nanoART были от сферических до эллипсоидных с зазубренными краями; nanoART ритонавира (RTV) были похожи на толстые палочки с гладкими краями; nanoART атазанавира (ATV) были похожи на тонкие палочки с гладкими краями, а nanoART эфавиренза (EFV) были от сферических до эллипсоидных с зазубренными краями. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕМ) (увеличение 15000х) продемонстрировала поглощение nanoART в MDM, на которые воздействовали М1004, М2006, М3001 и М4002. Внутри клеток каждый тип nanoART легко идентифицируется по форме, и пример был приведен для IDV (М1004), RTV (M2006), ATV (М3001) и EFV (М4002). Масштабная линия на всех кадрах равна 1,0 мкм.

На фигуре 2 представлены динамики поглощения IDV, RTV, ATV и EFV nanoART в макрофаг, происходящий из моноцита (MDM). Уровни IDV (фиг.2А), RTV (фиг.2В), ATV (фиг.2С) или EFV (фиг.2D) из клеточных лизатов культивируемых MDM, обработанных nanoART и собранных в 1, 2, 4 и 8 часов, анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Данные представлены в виде среднего±стандартная ошибка среднего (SEM) для n=3 определений/момент времени.

На фигуре 3 представлена площадь под кривой (AUC) поглощения nanoART в MDM. AUC поглощения IDV (фиг.3А), RTV (фиг.3В), ATV (фиг.3С) и EFV (фиг.3D) определяли в клеточных лизатах культивируемых MDM, обработанных 100 мкм nanoART и собранных после 1, 2, 4 и 8 часов. Данные представлены в виде средней AUC для n=3 определений/обработку.

На фигуре 4 представлено балльное оценивание составов nanoART на основании поглощения лекарственного средства, высвобождения и противоретровирусной активности. ^а Поглощение лекарственного средства на основании AUC концентрации лекарственного средства в MDM на протяжении 8 часов. ^b Удержание клеткой на основании AUC концентрации лекарственного средства, удержанного в MDM на протяжении 15 дней. ^с Высвобождение в среду на основании AUC концентрации лекарственного средства, высвобождаемого в среду на протяжении 15 дней. ^d Противоретровирусная активность определялась исходя из AUC активности обратной транскриптазы (RT) из супернатанта от инфицированных MDM через 15 дней. ^е GO/NOGO на основании среднего значения параметров, получивших балльную оценку.

На фигурах 5А и 5В представлены динамики удержания клеткой и высвобождения IDV, RTV, ATV и EFV nanoART. Уровни IDV, RTV, ATV или EFV в клеточных лизатах и среде клеток анализировали с помощью ВЭЖХ в дни 1, 5, 10 и 15 после обработки nanoART. Данные представлены в виде среднего ± SEM для n=3 определений/момент времени. Для М1002-М1005 уровни IDV не обнаруживались в среде в день 15 (предел обнаружения: 0,025 мкг/мл).

На фигуре 6 показана Противоретровирусная эффективность nanoART. Сравнение противоретровирусных эффектов в MDM, зараженных HIV-1_ADA через 15 дней после предварительной обработки nanoART, которые измерялись с помощью активности RT через 10 дней после заражения вирусом. Активности RT измеряли с помощью включения ³H-ТТР. Данные представлены в виде среднего для n=8 определений/обработку.

На фигуре 7 представлена экспрессия антигена р24 HIV-1 в клетках, обработанных nanoART. Сравнение противоретровирусных эффектов М1002 с М1004, М2002 с М2004, М3001 с М3005 и М4003 с М4005 при заражении hiv-iada через 1-15 дней после предварительной обработки nanoART. Через десять дней после каждого заражения вирусом клетки окрашивали с применением иммунной метки к антигену р24 HIV-1. Для клеток, обработанных обоими составами IDV, M2002 (RTV) и М3005 (ATV), показано постепенное снижение подавления вируса и возрастание экспрессии р24 HIV с течением времени; тогда как для клеток, обработанных М2004 (RTV), M3001 (ATV) и обоими составами EFV, показано полная или сильно улучшенная супрессия вирусной продукции р24. Однако даже в клетках, обработанных nanoART, где наблюдался вирусный прорыв, экспрессия р24 была ниже, чем в клетках, инфицированных HIV-1, которые не были обработаны nanoART.

На фигуре 8 показаны характеристики наночастицы ритонавира и ее взаимодействие с клеткой. На фигуре 8А показана RTV-NP с измерениями физических свойств и с изображением покрытия из внутреннего слоя mPEG₂₀₀₀ DSPE/ISS и наружного слоя DOTAP. Размер и заряд определяли с помощью динамического рассеяния света. Получали по меньшей мере четыре повторения для каждого измеренного значения с <2% дисперсией. Сканирующая электронная микроскопия (увеличение 15000х) RTV-NP на верхней поверхности поликарбонатной мембраны толщиной 0,2 мкм показывает типичную морфологию, напоминающую короткие палочки с гладкими краями (фиг.8В). Поглощение RTV-NP в макрофагах, происходящих из моноцитов (MDM), в продолжение 12 часов и удержание RTV-NP внутри MDM (левая y-ось) и высвобождение лекарственного средства в окружающую среду (правая y-ось) в продолжение 15 дней определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (фиг.8С и 8D). Данные проточной цитометрии и данные высокоэффективной жидкостной хроматографии для MDM, на которые воздействовали флуоресцентными RTV-NP, демонстрируют, что обработка MDM ингибитором клатрина дайносором значительно снижает поглощение (фиг.8Е и 8F). Все данные представлены в виде среднего±стандартная ошибка среднего для n=3.

На фигуре 9 показаны протеомные анализы мест локализации RTV-NP. Внутриклеточные RTV-NP идентифицировали внутри обособленных мембранных компартментов с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (увеличение 15000х) (фиг.9А). На фигуре 9В показан способ определения внутриклеточной локализации. RTV-NP пометили бриллиантовым голубым-250 и воздействовали ими на MDM. Клетки лизировали и внутриклеточные компартменты разделили с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы. Полоски представляют компартменты, содержащие RTV-NP. Эти полоски собирали и белки разделяли электрофорезом. После расщепления трипсином в геле белки идентифицировали с применением жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии. На фигуре 9С показано внутриклеточное распределение идентифицированных белков. Идентифицировали всего 38 эндосомальных белков. Протеомный анализ показал, что распределение RTV-NP было преимущественно в компартментах ре циркулирующих эндосом (RE) и ранних эндосом (ЕЕ).

На фигуре 10 представлены белковые маркеры, ассоциированные с эндосомами, содержащими наночастицы ритонавира. ⁺Для каждого белка был идентифицирован ряд уникальных значимых (р<0,05) пептидов. ⁺Теоретическую молекулярную массу для первичного продукта трансляции рассчитывали на основании последовательностей ДНК. § Номера доступа для UniProt (доступны на www.uniprot.org). 1[Постулируемые внутриклеточные локализации (см. www.uniprot.org, locate.imb.uq.edu.au, andwww.ncbi.nim.nih.gov/pubmed). #Постулируемая клеточная функция (см. www.uniprot.org, locate.imb.uq.edu.au и www.ncbi.nim.nih.gov/pubmed). CCP: Ямки, окаймленные клатрином; L: лизосомы; LE: поздние эндосомы; MVB: мультивезикулярные тельца; SE: сортирующие эндосомы.

На фигуре 11 показана иммуногистологическая идентификация внутриклеточной локализации наночастиц. С помощью конфокальной микроскопии подтвердилось распределение RTV-NP внутри эндоцитозных компартментов (фиг.11А-Н). Коэффициенты колокализации Пирсона указывают, что RTV-NP распределены преимущественно в рециркулирующих эндосомах Rab11 и Rab14 по сравнению с ранними эндосомами, эндосомами Rab8 или Rab7 и лизосомами (фиг.11I). Анализ распределения RTV-NP внутри подкисленных (деградирующих) компартментов, идентифицируемых посредством декстрановых гранул pHrodo™, выявляет минимальное перекрывание, указывающее на то, что RTV-NP, вероятно, избегают деградации внутри клетки и, в основном, рециклируются на высвобождение. Высокая колокализация RTV-NP с трансферрином также указывает на то, что частицы, наиболее вероятно, рециклируются. Масштабные линии равны 1 мкм. Данные на графе представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего для n=3.

На фигуре 12 показана проверка данных внутриклеточной локализации наночастиц. Нарушение эндоцитозного рециклирования с помощью siRNA (Rab8, 11 и 14), а также нарушение клеточной секреции с помощью брефелдина А, привело в результате к нокауту ассоциированного белка и вызвало перераспределение RTV-NP внутри макрофагов, происходящих из моноцитов (фиг.12Л и 12В). В каждом случае, обработка siRNA привела в результате к скоплению RTV-NP в перинуклеарной области внутри крупных вакуолей. siRNA-сайленсинг специфических белков подтверждали посредством вестерн-блоттинга (фиг.12С). Количественное определение RTV-NP с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в клетках (фиг.12D) и культуральных жидкостях (фиг.12Е) продемонстрировало, что нарушение эндоцитозного рециклирования и подавление секреции значительно повысило клеточное удержание RTV-NP и снизило высвобождение. Верхнее р-значение указывает отличие от контрольных клеток и нижнее р-значение указывает отличие от клеток, обработанных скремблированной siRNA. Масштабные линии равны 1 мкм. Данные на графе представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего для n=3.

На фигуре 13 показано, что наночастицы ритонавира транспортируются во время эндоцитозной сортировки. Поскольку RTV-NP пометили с помощью липофильных красителей (DiD или DiO), которые связываются с полимерной оболочкой, а не с собственно кристаллом лекарственного средства, протестировали, совпадало ли эндоцитозное распределение лекарственного средства с таковым помеченного полимера. Обработка MDM с помощью RTV-NP и последующее иммунное выделение внутриклеточных компартментов и ВЭЖХ-анализ содержания лекарственного средства (фиг.13А). На фигуре 13В представлен фотоснимок магнитных гранул вместе с выделенными иммунным способом эндосомальными компартментами перед ВЭЖХ-анализом; белое вещество на верхней поверхности осадка гранул в пробирке Rabll составляли, предположительно, эндосомы, заполненные RTV-NP. На фигуре 13С представлены ВЭЖХ-анализы выделенных иммунным способом компартментов, которые подтвердили, что большее количество RTV присутствует в эндосомах Rabll, чем как в ЕЕА1, так и в LAMP1. Данные на графе представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего для n=3. Значимо(р<0,01) отличается от контроля. Значимо (р<0,01) отличается от Rab11.

На фигуре 14 показано, что наночастицы ритонавира высвобождаются интактными и сохраняют свою противоретровирусную эффективность. Сканирующая электронная микроскопия (увеличение 15000х) нативных RTV-NP (фиг.14А) и RTV-NP, высвобожденных из клеток в окружающую среду (фиг.14В). RTV-NP отделили от растворенного лекарственного средства с помощью ультрацентрифугирования; показана процентная доля общего лекарственного средства как в форме частиц, так и растворенной форме. Концентрация общего лекарственного средства составила 40 мкг/мл (фиг.14С). Макрофаги, происходящие из моноцитов, обработали или свободным RTV, или нативными RTV-NP, или высвобожденными RTV-NP и затем заразили HIV. Обработка макрофагов, происходящих из моноцитов, высвобожденными RTV-NP снижало вирусную инфекцию до уровней подобных нативным (не подвергшимся эндоцитозу) частицам, как видно посредством р24-окраски и образования многоядерных гигантских клеток (фиг.14D), измерения активности RT (фиг.14Е) и плотности р24-окраски (фиг.14F). Для обоих измерений, как активности RT, так и плотности р24, все данные представлены в виде среднего±стандартная ошибка среднего для n=4.

На фигуре 15 представлено схематическое изображение возможных внутриклеточных путей частиц ритонавира. RTV-NP попадают внутрь MDM через ямки, окаймленные клатрином, и затем транспортируются в компартмент ранней эндосомы (ЕЕ). Из компартмента ЕЕ частицы могут иметь три различные судьбы: быстрая рециркуляция через эндосомы Rab4+ или 14+; направленное перемещение в позднюю эндосому, регулируемое, частично, с помощью системы ESCRT для последующего высвобождения в виде секреторной лизосомы; или, для большинства частиц, транспорт в компартмент рециркулирующей эндосомы (RE), где они будут храниться в течение продолжительных периодов и медленно рециркулировать через эндосомы Rab11+.

На фигуре 16 представлено схематическое изображение синтеза полоксамеров с концевым фолатом (FA) (P188 и Р407).

На фигуре 17 представлены фотоснимки морфологии наносуспензий ATV. Полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM; 15000х увеличение) микрофотографии составов с наночастицами ATV на верхней поверхности поликарбонатной мембраны толщиной 0,2 мкм. Все составы с наночастицами ATV были палочкообразными независимо от типа полимерной оболочки. Линия = 1 микрон.

На фигуре 18 показано поглощение наносуспензий ATV, содержащих немодифицированные P188 или FA-P188. На фигуре 18А показано, что поглощение наносуспензий ATV в неактивированных человеческих макрофагах, происходящих от моноцитов (MDM) улучшилось, когда частицы покрыли 10% или 30% FA-P188. На фигуре 18В показано, что поглощение наносуспензий ATV не менялось у MDM, предварительно обработанных 50 нг/мл LPS в течение 24 часов. На фигуре 18С показано, что улучшенное поглощение наносуспензий ATV, покрытых 20% FA-P188, снизилось при добавлении 2,5 мМ свободной фолиевой кислоты. Данные представлены в виде среднего ± SEM.

На фигуре 19 показано поглощение наносуспензий ATV, декорированных FA-P407. Поглощение наносуспензий P407-ATV улучшилось при включении FA-P407 в полимерную оболочку. Данные представлены в виде среднего ± SEM.

На фигуре 20 показано поглощение, удержание и высвобождение макрофагами наносуспензий ATV с модифицированными фолатом полоксамерами и без них. Поглощение наносуспензий ATV, содержащих Р407, улучшилось относительно поглощения наносуспензий ATV, содержащих Р188. Наблюдали улучшенное поглощение наносуспензий ATV, покрытых конъюгированными с фолатом полоксамерами, в сравнении с наносуспензиями, покрытыми неконъюгированными полоксамерами. Профили удержания клеткой наносуспензий ATV на протяжении 15 дней были аналогичными для всех полимерных оболочек и зависели от первоначальной загрузки клетки. Непрерывное высвобождение ATV в среду было аналогичным на протяжении 15 дней для всех составов. Данные представлены в виде среднего ± SEM.

На фигуре 21 показаны противоретровирусные эффекты наносуспензий ATV. Активность обратной транскриптазы (RT) в среде от клеток, нагружаемых наносуспензиями ATV в течение 8 часов и затем зараженных HIV-1_ADA в 1, 5, 10 и 15 дни после обработки лекарственным средством. Активность RT измеряли посредством внедрения ³H-ТТР. Данные представлены в виде среднего N=8 измерений.

На фигуре 22 показано р24+ - окрашивание HIV-1 у MDM, загруженных наносуспензиями ATV и инфицированных HIV-1_ADA - MDM загружали nanoART в течение 8 часов и затем заражали вирусом HIV-1 в 1, 5, 10 или 15 дни после удаления наносуспензий ATV из культуральной среды. Масштабная линия ± 250 микрон.

На фигуре 23 представлено схематическое изображение синтеза F127 с концевой маннозой (манноза-F127).

На фигуре 24 показано поглощение фолат-ATV nanoART в MDM. P188-FA, F127-FA и F127-M отражают поглощение фолат-F68-АТУ nanoART, фолат-F127-АТУ nanoART и манноза-F127-АТУ nanoART в MDM, соответственно. Р188 и F127 представляют поглощение ненацеленных F68- и F127-ATV nanoART в MDM.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Долгосрочная противоретровирусная терапия (ART) в отношении инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека типа один (HIV-1) показывает ограничения в фармакокинетике и поиске тканей-мишеней, при этом вызывает метаболические и цитотоксические отклонения. В свою очередь, при ART обычно требуются сложные схемы дозирования, и это приводит к возникновению резистентности вируса и безуспешности лечения. Составленные в наночастицы композиции для ART по настоящему изобретению устраняют такие ограничения и влияют на улучшенные клинические исходы. В данном документе, показано, что после клатрин-зависимого эндоцитоза наночастицы (NP) избегали лизосомной деградации посредством сортировки из ранних эндосом в рециркулирующем пути эндосом. Частицы высвобождались интактными и полностью сохраняли противоретровирусную эффективность. Эти результаты предусматривают возможные пути внутриклеточного транспорта противоретровирусных составов наночастиц, которые сохраняют как целостность частицы, так и противоретровирусные активности, что демонстрирует потенциальную полезность данного подхода для нацеленной доставки лекарственного средства. В самом деле, внутриклеточное место локализации NP и их медленное высвобождение лежит в основе долгосрочной противоретровирусной эффективности. Кроме того, данные демонстрируют, что клетки, такие как макрофаги, могут действовать как переносчики лекарственного средства и, что важно, не деградируют и не модифицируют нагруженные лекарственным средством частицы при переносе. В связи с этим, биологически активное(ые) лекарственное(ые) средство(а) доставляется неизмененным в его намеченные места назначения.

Настоящее изобретение охватывает наночастицы для доставки соединений в клетку. В конкретном варианте осуществления наночастица служит для доставки противоретровирусной терапии субъекту. Наночастицы по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одно соединение, представляющее интерес, и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. Эти компоненты наночастицы вместе с другими необязательными компонентами описаны ниже.

I. Терапевтическое средство

Наночастицы по настоящему изобретению можно применять для доставки любого средства(средств) или соединения(и), в частности биоактивных средств (например, терапевтического средства или диагностического средства), в клетку или субъекту (в том числе животным, отличным от человека). Используемое в данном документе выражение "биоактивное средство" также включает соединения, подлежащие скринингу в качестве потенциальных лидеров в разработке лекарственных средств или средств защиты растений. Биоактивное средство и терапевтические средства включают, без ограничения, полипептиды, пептиды, гликопротеины, нуклеиновые кислоты, синтетические и природные лекарственные средства, пептоиды, полиены, макроциклы, гликозиды, терпены, терпеноиды, алифатические и ароматические соединения, малые молекулы и их производные и соли. В конкретном варианте осуществления терапевтическое средство представляет собой химическое соединение, такое как синтетическое и природное лекарственное средство. Несмотря на то, что любой тип соединения может доставляться в клетку или субъекту с помощью композиций и способов по настоящему изобретению, в следующем описании настоящего изобретения приводится пример соединения в качестве терапевтического средства.

Наночастицы по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одно терапевтическое средство. Наночастицы являются, в основном, кристаллическими (твердые вещества со свойствами кристаллов) наночастицами терапевтического средства, причем наночастицы, как правило, содержат приблизительно 99% чистого терапевтического средства. В конкретном варианте осуществления наночастицы синтезируют с помощью добавления терапевтического средства, в частности, формы свободного основания терапевтического средства к раствору поверхностно-активного вещества (описывается ниже), и затем получают наночастицы с помощью мокрого размола или гомогенизации высокого давления. Терапевтическое средство и раствор поверхностно-активного вещества можно перемешивать перед мокрым размолом или гомогенизацией высокого давления.

В конкретном варианте осуществления получаемая в результате наночастица составляет до 1 мкм в диаметре. В конкретном варианте осуществления наночастица имеет от приблизительно 200 нм до приблизительно 500 им в диаметре, в частности, приблизительно 250-350 нм в диаметре. В конкретном варианте осуществления наночастицы являются палочкообразными, в частности, удлиненными палочками, а не неправильными или округлыми. Наночастицы по настоящему изобретению могут быть нейтральными или заряженными. Наночастицы могут быть заряжены положительно или отрицательно.

Терапевтическое средство может представлять собой гидрофобное, нерастворимое в воде соединение, или слаборастворимое в воде соединение. Например, терапевтическое средство может иметь растворимость меньше чем приблизительно 10 мг/мл, меньше чем 1 мг/мл, конкретнее, меньше чем приблизительно 100 мкг/мл и, конкретнее, меньше приблизительно 25 мкг/мл в воде или водных средах в диапазоне рН 0-14, конкретно, рН 4-10, в частности, при 20°С.

В конкретном варианте осуществления терапевтическое средство наночастиц по настоящему изобретению представляет собой противомикробное средство. В другом варианте осуществления терапевтическое средство является противовирусным средством, конкретнее, противоретровирусным средством. Противоретровирусное средство может быть эффективным против лентивирусов или специфичным к ним. Лентивирусы включают, без ограничения, вирус иммунодефицита человека (HIV) (например, HIV-1, HIV-2), вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), вирус иммунодефицита кошек (FIV), вирус иммунодефицита обезьян (SIV) и вирус инфекционной анемии лошадей (EIA). В конкретном варианте осуществления терапевтическое средство представляет собой средство против HIV.

Соединение против HIV или средство против HIV представляет' собой соединение, которое подавляет HIV. Примеры средств против HIV включают, без ограничения:

(I) Нуклеозидные аналоги ингибиторов обратной транскриптазы (NRTI). NRTI относится к нуклеозидам и нуклеотидам и их аналогам, подавляющим активность обратной транскриптазы HIV-1. Примером нуклеозидного аналога ингибиторов обратной транскриптазы является, без ограничения, адефовира дипивоксил.

(II) Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы

(NNRTI). NNRTI представляют собой аллостерические ингибиторы, которые обратимо связываются в несубстратном центре связывания на обратной транскриптазе HIV, таким образом меняя форму активного центра или блокируя активность полимеразы. Примеры NNRTI включают, без ограничения, делавирдин (ВНАР, U-90152; RESCRIPTOR®), эфавиренз (DMP-266, SUSTIVA®), невирапин (VIRAMUNE®), PNU-142721, каправирин (S-1153, AG-1549), эмивирин (+)-каланолид A (NSC-675451) и В, этравирин (ТМС-125), рилпивирин (ТМС278, Edurant™), DAPY (TMC120), BILR-355 BS, PHI-236 и PHI-443 (TMC-278).

(III) Ингибиторы протеазы (PI). Ингибиторы протеазы представляют собой ингибиторы протеазы HIV-1. Примеры ингибиторов протеазы включают, без ограничения, дарунавир, ампренавир (141W94, AGENERASE®), типранавир (PNU-140690, APTIVUS®), индинавир (МК-639; CRIXIVAN®), саквинавир (INVIRASE®, FORTOVASE®), фосампренавир (LEXIVA®), лопинавир (АВТ-378), ритонавир (АВТ-538, NORVIR®), атазанавир (REYATAZ®), нелфинавир (AG-1343, VIRACEPT®), лазинавир (BMS-234475/CGP-61755), BMS-2322623, GW-640385X (VX-385), AG-001859 и SM-309515.

(IV) Ингибиторы слияния (FI). Ингибиторы слияния представляют собой соединения, такие как пептиды, которые действуют посредством связывания с белком оболочки HIV и блокируют структурные изменения, необходимые для слияния вируса с клеткой-хозяином. Примеры ингибиторов слияния включают, без ограничения, маравирок (Selzentry®, Celsentri), энфувиртид (INN, FUZEON®), Т-20 (DP-178, FUZEON®) и Т-1249.

(V) Ингибиторы интегразы. Ингибиторы интегразы представляют собой класс противоретровирусных лекарственных средств, разработанных для блокирования действия интегразы, вирусного фермента, который вставляет вирусный геном в ДНК клетки-хозяина. Примеры ингибиторов слияния включают, без ограничения, ралтегравир, элвитегравир и МК-2048.

Соединения против HIV также включают вакцины против HIV, такие как, без ограничения, ALVAC® HIV (vCPl521), AIDSVAX®B/E (gp120) и их комбинации. Соединения против HIV также включают антитела к HIV (например, антитела к gp120 или gp41), в частности, нейтрализующие антитела широкого спектра действия.

В конкретном варианте осуществления средство против HIV по настоящему изобретению представляет собой ингибитор протеазы, NNRTI или NRTI. В конкретном варианте осуществления средство против HIV выбирается из группы, состоящей из индинавира, ритонавира, атазанавира и эфавиренза. Можно применять более одного средства против HIV, в частности, если средства обладают отличающимися механизмами действия (как обозначено выше). В конкретном варианте осуществления терапия против HIV представляет собой высокоактивную противоретровирусную терапию (HAART).

II. Поверхностно-активные вещества

Как указано в данном документе выше, наночастицы по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. "Поверхностно-активным веществом" называется поверхностно-активное средство, в том числе вещества, обычно называемые смачивающими средствами, детергентами, диспергирующими средствами или эмульгирующими средствами. Поверхностно-активные вещества обычно представляют собой органические соединения, которые являются амфифильными. В конкретном варианте осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой амфифильный блок-сополимер. В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество наночастицы представляет собой амфифильный блок-сополимер, в частности, сополимер, содержащий по меньшей мере один блок поли(оксиэтилена) и по меньшей мере один блок поли(оксипропилена).

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения поверхностно-активное вещество присутствует в растворе наночастиц и/или поверхностно-активного вещества для синтеза наночастицы (как описано в данном документе выше) при концентрации в диапазоне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 5%. В конкретном варианте осуществления концентрация поверхностно-активного вещества находится в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 2%.

Поверхностно-активное вещество по настоящему изобретению может быть заряженным или нейтральным. В конкретном варианте осуществления поверхностно-активное вещество является положительно или отрицательно заряженным, в частности, отрицательно заряженным.

В конкретном варианте осуществления амфифильный блок-сополимер представляет собой сополимер, содержащий по меньшей мере один блок поли(оксиэтилена) и по меньшей мере один блок поли(оксипропилена). Примерами амфифильных блок-сополимеров служат блок-сополимеры с формулами:

,

,

,

,

,

в которых х, у, z, i и j имеют значения от приблизительно 2 до приблизительно 800, в частности, от приблизительно 5 до приблизительно 200, конкретнее, от приблизительно 5 до приблизительно 80, и где для каждой пары R¹, R², показанных на формуле (IV) и (V), один представляет собой водород и другой является метильной группой. Специалист в данной области будет учитывать, что значения х, у и z обычно будут отражать статистическое среднее и, что значения х и z зачастую, хотя необязательно, являются одинаковыми. Формулы (I)-(III) являются упрощенными в том, что, фактически, ориентация изопропиленовых радикалов внутри В-блока будет случайной. Эта случайная ориентация указывается на формулах (IV) и (V), которые являются более полными. Такие соединения поли(оксиэтилена)-поли(оксипропилена) были описаны Santon (Am. Perfumer Cosmet. (1958) 72 (4):54-58); Schmolka (Loc. cit. (1967) 82 (7):25-30), Schick, ed. (Non-ionic Surfactants, Dekker, N.Y-, 1967 pp.300-371). Ряд таких соединений имеются в продаже под такими родовыми торговыми наименованиями как "липолоксамеры", "Pluronics®", "полоксамеры" и "синпероники". Сополимеры Pluronic® в рамках формулы В-А-В, в противовес формуле А-В-А, типичной для Pluronics®, часто называются "обращенными" Pluronics®, "Pluronic® R" или "мероксаполом". В основном, блок-сополимеры можно описать в зависимости от наличия гидрофильных "А" и гидрофобных "В" блоков-сегментов. Так, например, сополимер с формулой А-В-А представляет собой триблок-сополимер, состоящий из гидрофильного блока, соединенного с гидрофобным блоком, соединенным с другим гидрофильным блоком. "Полиоксаминовый" полимер формулы (IV) доступен от BASF под торговым названием Tetronic®. Порядок полиоксиэтиленовых и полиоксипропиленовых блоков, представленных на формуле (IV), может обращаться, образуя Tetronic R®, также доступный от BASF (см., Schmolka, J. Am. Oil. Soc. (1979) 59:110).

Блок-сополимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена можно также разрабатывать с гидрофильными блоками, содержащими неупорядоченную смесь повторяющихся элементарных звеньев этиленоксида и пропиленоксида. Для поддержания гидрофильного свойства блока должен преобладать этиленоксид. Аналогичным образом, гидрофобный блок может представлять собой смесь повторяющихся элементарных звеньев этиленоксида и пропиленоксида. Такие блок-сополимеры доступны от BASF под торговым названием Pluradot™. He требуется, чтобы элементарные звенья блоков поли(оксиэтилена)-поли(оксипропилена), составляющих первый сегмент, состояли исключительно из этиленоксида. Также нет необходимости, чтобы все сегменты В-типа состояли исключительно из элементарных звеньев пропиленоксида. Наоборот, в простейших случаях, например, по меньшей мере один из мономеров в сегменте А может замещаться группой боковой цепи.

Ряд сополимеров полоксамера разработаны, чтобы удовлетворять следующей формуле:

.

Примеры полоксамеров включают, без ограничения, Pluronic® L31, L35, F38, L42, L43, L44, L61, L62, L63, L64, Р65, F68, L72, Р75, F77, L81, Р84, Р85, F87, F88, L92, F98, L101, Р103, Р104, Р105, F108, L121, L122, L123, F127, 10R5, 10R8, 12R3, 17R1, 17R2, 17R4, 17R8, 22R4, 25R1, 25R2, 25R4, 25R5, 25R8, 31R1, 31R2 и 31R4. Блок-сополимеры Pluronic® обозначаются посредством буквенного префикса с последующим двузначным или трехзначным числом. Буквенные префиксы (L, Р или F) относятся к физической форме каждого полимера, (жидкость, паста или образующее чешуйки твердое вещество). Числовой код определяет структурные параметры блок-сополимера. Последний разряд этого кода приблизительно равен весовому содержанию ЕО-блока в десятках весовых процентов (например, 80% по весу, если разряд равен 8, или 10% по весу, если разряд равен 1). Остальные первые один или два разряда кодируют молекулярную массу центрального РО-блока. Для расшифровки кода следует умножить соответствующее число на 300, чтобы получить приблизительную молекулярную массу в дальтонах (Да). Следовательно, номенклатура Pluronic обеспечивает удобный подход для оценки характеристик блок-сополимера в отсутствие справочной литературы. Например, код 'F127' обозначает блок-сополимер, который представляет собой твердое вещество, имеет РО-блок 3600 Да (1.2Х300) и 70% по весу ЕО. Точные молекулярные свойства каждого блок-сополимера Pluronic® можно получить от производителя.

Другие биосовместимые амфифильные сополимеры включают описываемые у Gaucher et al. (J. Control Rel. 2005) 109:169-188. Примеры других полимеров включают, без ограничения, поли(2-оксазолин)овые амфифильные блок-сополимеры, полиэтиленгликоль-полимолочную кислоту (PEG-PLA), PEG-PLA-PEG, полиэтиленгликоль-сополимер(лактида и гликолида) (PEG-PLG), полиэтиленгликоль-сополимер (молочной и гликолевой кислоты) (PEG-PLGA), полиэтиленгликоль-поликапролактон (PEG-PCL), полиэтиленгликоль-полиаспартат (PEG-PAsp), полиэтиленгликоль-поли(глутаминовую кислоту) (PEG-PGlu), полиэтиленгликоль-поли(акриловую кислоту) (PE;G-РАА), полиэтиленгликоль-поли(метакриловую кислоту) (PEG-РМА), полиэтиленгликоль-поли(этиленимин) (PEG-PEI), полиэтиленгликоль-поли(L-лизин) (PEG-PLys), полиэтиленгликоль-поли(2-(N,N-диметиламино)этилметакрилат) (PEG-PDMAEMA) и полиэтиленгликоль-производные хитозана.

В конкретном варианте осуществления поверхностно-активное вещество включает по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из полоксамера 188, полоксамера 407, поливинилового спирта (PVA), 1,2-дистеароил-фосфатидилэтаноламин-метил-полиэтиленгликоля конъюгата-2000 (mPEG2oooDSPE), додецилсульфат натрия (SDS) и 1,2-диолеилокси-3-триметиламмонийпропана (DOTAP).

Поверхностно-активное вещество по настоящему изобретению можно соединять с нацеливающим лигандом. Нацеливающий лиганд представляет собой соединение, которое будет специфично связываться со специфическим типом ткани или типом клеток. В конкретном варианте осуществления нацеливающий лиганд представляет собой лиганд для маркера/рецептора клеточной поверхности. Нацеливающий лиганд может представлять собой антитело или его фрагмент, иммунологически специфичный к маркеру клеточной поверхности (например, белку или углеводу), предпочтительно или исключительно экспрессируемому на целевой ткани или типе клеток. Нацеливающий лиганд может присоединяться к поверхностно-активному веществу прямо или через линкер. В основном, линкер представляет собой химический фрагмент, включающий ковалентную связь или цепь из атомов, которая ковалентно присоединяет лиганд к поверхностно-активному веществу. Линкер может присоединяться к любому синтетически осуществимому положению лиганда и поверхностно-активного вещества. Иллюстративные линкеры могут включать по меньшей мере одну необязательно замещенную; насыщенную или ненасыщенную; линейную, разветвленную или циклическую алкильную группу или необязательно замещенную арильную группу. Линкер также может быть полипептидом (например, от приблизительно 1 до приблизительно 10 аминокислот, в частности, от приблизительно 1 до приблизительно 5). Линкер может быть неразлагаемым и может представлять собой ковалентную связь или любую другую химическую структуру, которая не может по сути расщепляться или расщепляться полностью при физиологической среде или условиях.

В конкретном варианте осуществления нацеливающий лиганд является макрофаг-нацеливающим лигандом. Макрофаг-нацеливающие лиганды включают, без ограничения, лиганды фолатных рецепторов (например, фолат (фолиевую кислоту) и антитела к фолатным рецепторам и их фрагменты (см., например, Sudimack et al. (2000) Adv. Drug Del. Rev., 41:147-162)), лиганды маннозных рецепторов (например, маннозу) и лиганды формил-пептидных рецепторов (FPR) (например, Ы-формил-Met-Leu-Phe (fMLF)). Как показано в данном документе ниже, нацеливание наночастиц на макрофаг предусмотрено для нацеливания на центральную нервную систему (например, нацеливание на головной мозг), большее нацеливание на печень, сниженные скорости выведения, сниженную токсичность и пролонгированный период полувыведения по сравнению со свободным лекарственным средством или ненацеленными наночастицами.

III. Введение

Настоящее изобретение охватывает композиции, содержащие по меньшей мере одну наночастицу по настоящему изобретению (иногда называемую в данном документе nanoART) и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Как указано в данном документе выше, наночастица может содержать более одного терапевтического средства. В конкретном варианте осуществления композиция содержит первую наночастицу, содержащую первое терапевтическое(ие) средство(а), и вторую наночастицу, содержащую второе терапевтическое(ие) средство(а), где первое и второе терапевтические средства отличаются. Композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие терапевтические средства (например, другие соединения против HIV).

Настоящее изобретение также охватывает способы предупреждения, подавления и/или лечения микробных инфекций

(например, вирусных или бактериальных), в частности, ретровирусных или лентивирусных инфекций, в частности HIV-инфекций (например, HIV-1). Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить животному, в частности млекопитающему, конкретнее человеку, для лечения/подавления HIV-инфекции. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут также содержать по меньшей мере одно другое противомикробное средство, в частности, по меньшей мере одно другое соединение/средство против HIV. Добавочное соединение против HIV можно также вводить в отдельной композиции от NP против HIV по настоящему изобретению. Композиции можно вводить одновременно или в разное время

(например, последовательно).

Диапазоны дозировок для введения композиций настоящего изобретения достаточно велики для получения требуемого эффекта (например, терапия, облегчение, лечение и/или предупреждения HIV-инфекции, ее симптомов (например, AIDS, ARC) или склонности к ней). В конкретном варианте осуществления вводят более низкие дозы композиции по настоящему изобретению, например, приблизительно 50 мг/кг или менее, приблизительно 25 мг/кг или менее или приблизительно 10 мг/кг или менее. Дозировка не должна быть настолько большой, чтобы вызвать неблагоприятные побочные эффекты, такие как нежелательные перекрестные реакции, анафилактические реакции и т.п. В основном, дозировка будет варьировать с возрастом, состоянием, полом и степенью заболевания у пациента и может определяться специалистом в данной области. Дозировка может корректироваться лечащим врачом в случае любых противопоказаний.

Наночастицы, описанные в данном документе, будут, в основном, вводиться пациенту в виде фармацевтического препарата. Используемое в данном документе выражение "пациент" относится к субъекту-человеку или субъекту-животному. Данные наночастицы могут применяться терапевтически под руководством врача. Хотя в данном документе в качестве примера приводятся терапевтические средства, пациенту может вводиться любое биоактивное средство, например, диагностическое или радиофармацевтическое средство.

Композиции, содержащие наночастицы по настоящему изобретению, можно удобно составлять для введения с любым фармацевтически приемлемым носителем(ями). Например, комплексы можно составлять с приемлемой средой, такой как вода, забуференный физиологический раствор, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), диметилсульфоксид (DMSO), масла, детергенты, суспендирующие средства или их подходящие смеси. Концентрация наночастиц в выбранной среде может варьировать, и среду можно выбирать исходя из желаемого пути введения фармацевтического препарата. Кроме случаев, когда любая традиционная среда или средство является несовместимым с наночастицами, подлежащими введению, его применение в фармацевтическом препарате предусматривается.

Дозу и режим дозирования наночастиц по настоящему изобретению, которые подходят для введения конкретному пациенту, может определять врач с учетом возраста, пола, веса, общего состояния здоровья пациента и специфического состояния, по причине которого вводятся наночастицы, и его тяжести. Врач может также принимать в расчет путь введения, фармацевтический носитель и биологическую активность наночастиц.

Выбор подходящего фармацевтического препарата будет также зависеть от выбранного способа введения. Например, наночастицы настоящего изобретения можно вводить посредством прямой инъекции или внутривенно. В этом случае, фармацевтический препарат включает наночастицу, диспергированную в среде, которая совместима с местом инъекции.

Наночастицы по настоящему изобретению можно вводить любым способом. Например, наночастицы по настоящему изобретению могут вводиться, без ограничения, парентерально, подкожно, перорально, местно, пульмонально, ректально, вагинально, внутривенно, внутрибрюшинно, интратекально, интрацеребрально, эпидурально, внутримышечно, внутрикожно или интракаротидно. В конкретном варианте осуществления наночастицы вводятся внутривенно или пнутрибрюшинно. Фармацевтические препараты для инъекции известны в уровне техники. Если в качестве способа введения наночастицы выбирается инъекция, должны приниматься меры, чтобы удостовериться, что достаточные количества молекул или клеток достигли их целевых клеток для оказания биологического эффекта. Формы дозировки для перорального введения включают, без ограничения, таблетки (например, покрытые и непокрытые, жевательные), желатиновые капсулы (например, мягкие или твердые), леденцы, пастилки, растворы, эмульсии, суспензии, сиропы, эликсиры, порошки/гранулы (например, восстанавливаемые или диспергируемые), жевательные резинки и шипучие таблетки. Лекарственные формы для парентерального введения включают, без ограничения, растворы, эмульсии, суспензии, дисперсии и порошки/гранулы для восстановления. Лекарственные формы для местного введения включают, без ограничения, кремы, гели, мази, целебные мази, пластыри и трансдермальные системы доставки.

Фармацевтические композиции, содержащие наночастицу по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента в однородной смеси с фармацевтически приемлемым носителем, можно получать в соответствии с традиционными методиками составления фармацевтических препаратов. Носитель может принимать целый ряд форм, в зависимости от требуемой для введения формы препарата, например, внутривенный, пероральный, для прямой инъекции, интракраниальный и интравитреальный.

Фармацевтический препарат настоящего изобретения можно составлять в форме единиц дозирования для простоты введения и однородности дозировки. Используемая в данном документе форма единиц дозирования относится к физически дискретной единице фармацевтического препарата, подходящей для пациента, подвергающегося лечению. Каждая дозировка должна содержать количество активного ингредиента, рассчитанное так, чтобы производить требуемый эффект, в сочетании с выбранным фармацевтическим носителем. Процедуры определения подходящей единицы дозирования хорошо известны специалистам в данной области.

Единицы дозирования можно пропорционально увеличивать или уменьшать исходя из веса пациента. Подходящие концентрации для облегчения конкретного патологического состояния можно определять с помощью расчетов по кривой дозировка-концентрация, как известно из уровня техники.

В соответствии с настоящим изобретением подходящую единицу дозирования для введения наночастицы можно определить с помощью оценки токсичности молекул или клеток на животных моделях. Мышам можно вводить различные концентрации наночастиц в фармацевтических препаратах, и минимальные и максимальные дозировки можно определять на основании благоприятных результатов и побочных эффектов, наблюдаемых как результат лечения. Подходящую единицу дозирования также можно определить с помощью оценки эффективности лечения наночастицами в комбинации с другими стандартными лекарственными средствами. Единицы дозирования наночастицы можно определять отдельно или в комбинации с любым лечением в соответствии с обнаруженным эффектом.

Фармацевтический препарат, содержащий наночастицы, можно вводить с подходящими интервалами, например, по меньшей мере дважды в день или больше до тех пор, пока патологические симптомы уменьшатся или смягчатся, после чего дозировку можно снизить до поддерживающего уровня. Подходящий интервал в конкретном случае обычно будет зависеть от состояния пациента.

Настоящее изобретение охватывает способы лечения заболевания/расстройства, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей наночастицу по настоящему изобретению и, в частности, по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение также охватывает способы, где субъекта лечат посредством ех vivo терапии. В частности, способ включает извлечение клеток из субъекта, in vitro воздействие/контакт клеток с наночастицами по настоящему изобретению и возврат клеток субъекту. В конкретном варианте осуществления клетки включают макрофаг. Другие способы лечения заболевания или расстройства могут комбинироваться со способами по настоящему изобретению, могут вводиться совместно с композициями по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также охватывает доставку наночастицы по настоящему изобретению в клетку in vitro (например, в культуре). Наночастица может доставляться в клетку в по меньшей мере одном носителе.

IV. Определения

"Фармацевтически приемлемый" указывает на одобрение регуляторным органом федерального правительства или правительства штата или на то, что он перечислен в Фармакопее США или других общепризнанных фармакопеях для применения у животных и, конкретнее, у людей.

"Носитель" относится к, например, разбавителю, вспомогательному веществу, консерванту (например, тимеросал, бензиловый спирт), антиоксиданту (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), солюбилизатору (например, Tween 80, Polysorbate 80), эмульгатору, буферу (например, Tris HC1, ацетатному, фосфатному), противомикробному средству, объемообразующему веществу (например, лактоза, маннит), наполнителю, вспомогательному средству или переносчику, с которым вводится активное средство по настоящему изобретению. Фармацевтически приемлемые носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, в том числе происходящие из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения. В качестве носителей, в частности, для инъецируемых растворов можно применять воду или водные солевые растворы, а также водные растворы декстрозы и глицерина. Подходящие фармацевтические носители описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, PA); Gennaro, A. R., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott, Williams and Wilkins); Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y.; и Kibbe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, Washington.

Используемое в данном документе выражение "лечить" относится к любому типу лечения, которое приносит пользу пациенту, пораженному заболеванием, в том числе к улучшению состояния пациента (например, одного или нескольких симптомов), к задержке прогрессирования состояния и т.д. В конкретном варианте осуществления лечение ретровирусной инфекции приводит в результате по меньшей мере к подавлению/снижению числа инфицированных клеток.

"Терапевтически эффективное количество" соединения или фармацевтической композиции относится к количеству, эффективному для предупреждения, подавления, лечения или уменьшения симптомов конкретного расстройства или заболевания. Лечение микробной инфекции (например, I-IIV-инфекции) в данном документе может относиться к терапии, облегчению и/или предупреждению микробной инфекции, ее симптома(ов) или склонности к ней.

Используемое в данном документе выражение "терапевтическое средство" относится к химическому соединению или биологической молекуле, в том числе, без ограничения, нуклеиновым кислотам, пептидам, белкам и антителам, которые могут применяться для лечения состояния, заболевания или расстройства или уменьшения симптомов состояния, заболевания или расстройства.

Используемое в данном документе выражение "малая молекула" относится к веществу или соединению, имеющему относительно низкую молекулярную массу (например, меньше 4000, меньше 2000, в частности, меньше 1 кДа или 800 Да). Как правило, малые молекулы являются органическими, но не являются белками, полипептидами или нуклеиновыми кислотами, хотя они могут представлять собой аминокислоты или дипептиды.

Используемое в данном документе выражение "противомикробные средства" указывает на вещество, которое убивает или подавляет рост микроорганизмов, таких как бактерии, грибы, вирусы или простейшие.

Используемое в данном документе выражение "противовирусное средство" относится к веществу, которое разрушает вирус или супрессирует репликацию (размножение) вируса.

Используемое в данном документе выражение "высокоактивная противоретровирусная терапия" (HAART) относится к терапии HIV с помощью различных комбинаций терапевтических средств, таких как нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы протеазы HIV и ингибиторы слияния.

Используемое в данном документе выражение "амфифильный" означает способность растворяться как в воде, так и в липидах/неполярных средах. Как правило, амфифильное соединение содержит гидрофильную часть и гидрофобную часть. "Гидрофобный" обозначает предпочтение неполярных сред (например, гидрофобное вещество или фрагмент легче растворяется в неполярных растворителях, таких как углеводороды, или смачивается ими, чем водой). Используемое в данном документе выражение "гидрофильный" означает способность растворяться в воде.

Используемое в данном документе выражение "полимер" обозначает молекулы, образованные из химического объединения двух или более повторяющихся элементарных звеньев или мономеров. Выражение "блок-сополимер", в самом простом случае, относится к конъюгатам по меньшей мере из двух различных полимерных сегментов, где каждый полимерный сегмент включает два или более смежных элементарных звена одинаковой природы.

"Антитело" или "молекула антитела" представляет собой любой иммуноглобулин, в том числе антитела и их фрагменты (например, scFv), которые связываются со специфичным антигеном. Используемый в данном документе термин антитело или молекула антитела предполагает интактную молекулу иммуноглобулина, иммунологически активные части молекулы иммуноглобулина и слияния иммунологически активных частей молекулы иммуноглобулина.

Используемое в данном документе выражение "иммунологически специфичный" относится к белкам/полипептидам, в частности антителам, которые связываются с одним или несколькими эпитопами белка или соединения, представляющего интерес, но которые по сути не распознают и не связывают другие молекулы в образце, содержащем смешанную популяцию антигенных биологических молекул.

Следующие примеры обеспечивают иллюстративные способы осуществления настоящего изобретения на практике и ни в коей мере не предусматривают ограничение объема настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

Существует огромная необходимость в ослаблении репликации вируса в тканях-убежищах, а именно, в центральной нервной системе (ЦНС) (Rao et al. (2009) Expert Opin. Drug Deliv., 6:771-784; Varatharajan et al. (2009) Antivir. Res., 82:A99-A109). Один способ достижения таких целей заключается в применении подходов доставки составленных в наночастицы лекарственных средств (Mallipeddi et al. (2010) Int. J. Nanomed., 5:533-547; Wong eb al. (2010) Adv. Drug Deliv. Rev., 62:503-517; Nowacek et al. (2009) Nanomed., 4:557-574; das Neves et al. (2010) Adv. Drug Deliv. Rev., 62:458-477). Действительно, составленные в наночастицы соединения положительно воздействуют на фармакокинетику и фармакодинамику противоретровирусной терапии (ART), при этом одновременно снижают вторичные клеточную и тканевую токсичности (Chirenje et al. (2010) Expert Rev. Anti-Infect. Ther., 8:1177-1186; Destache et al. (2009) BMC Infect. Dis., 9:198; Dou et al. (2006) Blood 108:2827-2835; Dou et al. (2009) J. Immunol., 183:661-669; Mahajan et al. (2010) Curr. HIV Res., 8:396-404; Parikh et al. (2009) J. Virol., 83:10358-10365; Yang et al. (2010) Bioorg. Med. Chem., 18:117-123). К тому же, опосредованный клеткой транспорт составленных в наночастицы лекарственных средств показал перспективу улучшения доставки лекарственных препаратов в больные органы, в частности, центральную нервную систему (Dou et al. (2009) J. Immunol., 183:661-669). Система основана на способностях макрофагов, происходящих из крови, к поглощению составленных в наночастицы материалов, хранению их во внутриклеточных компартментах и прохождению через стенки кровеносных сосудов для доставки лекарственных средств к очагам активного заболевания. В добавление к их фагоцитарной, очищающей, антигенпрезентирующей и секреторной функциям, макрофаги также служат убежищами вируса, переносчиками для транспорта вируса и резервуарами для непрерывной репликации HIV-1 (Benaroch et al. (2010) Retrovirology 7:29; Kuroda et al. (2010) J. Leukoc. Biol., 87:569-573; Le Douce et al. (2010) Retrovirology 7:32; Persidsky et al. (2003) J. Leukoc. Biol., 74:691-701).

Системы доставки лекарственных средств могут использовать моноциты-макрофаги для доставки противоретровирусной терапии (ART) при HIV-1 инфекции (Uou et ai. (2009) J. Immunol., 183:661-669; Dou et al. (2007) Virology 358:148-158; Nowacek et al. (2010) J. Neuroimmune Pharmacol., 5:592-601; Nowacek et al. (2009) Nanomedicine 4:903-917). При этом составленные в наночастицы лекарственные средства состоят из кристаллов противоретровирусного лекарственного средства и включают индинавир (IDV), ритонавир (RTV), атазанавир (ATV) и эфавиренз (EFV). Для каждого парентерального лекарственного средства крупные кристаллы можно дробить на наночастицы (NP) с помощью мокрого размола в присутствии поверхностно-активных веществ. Эти составленные в микронаночастицы противоретровирусные лекарственные средства называются "nanoART." Затем для поглощения nanoART и медленного высвобождения их в течение длительных периодов времени могут применяться макрофаги. Структура и композиция составленных в наночастицы лекарственных средств оказывает существенные эффекты на стабильность, клеточные взаимодействия, эффективность и цитотоксичность (Caldorera-Moore et al. (2010) Expert Opin. Drug Deliv., 7:479-495; Doshi et al. (2010) J. R. Soc. Interface 7:3403-3410; Huang et al. (2010) Biomaterials 31:438-448; Zolnik et al. (2010) Endocrinology 151:458-465).

В данном документе оптимизацию платформ на основе макрофагов, происходящих из моноцитов (MDM), для основанной на клетках доставки nanoART для терапевтических улучшений осуществляют посредством улучшения получения, свойств и фармакодинамики. Мокрый размол использовали при разработке, поскольку он применялся ранее для производства кристаллических наночастиц из слабо растворимых в воде лекарственных средств и его масштаб можно расширять для клинического применения (Tanaka et al. (2009) Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 57:1050-1057; Hu et al. (2004) Drug Dev. Ind. Pharm., 30:233-245).

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Получение и определение характеристик nanoART

Ритонавир (RTV) (Shengda Pharmaceutical Co., Чжэдзян, Китай) и эфавиренз (EFV) (Hetero Labs LTD., Хайдарабад, Индия) получили в форме свободного основания. Свободные основания сульфата индинавира (IDV) (Longshem Co., Шанхай, Китай) и сульфата атазанавира (ATV) (Gyma Laboratories of America Inc., Уэстбери, Нью-Йорк) получили с применением 1Н раствора NaOH. Применяемые в данном исследовании поверхностно-активные вещества включали: полоксамер-188 (Р188; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), поливиниловый спирт (PVA) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), 1,2-дистеароил-фосфатидилэтаноламин-метил-полиэтиленгликоль конъюгат-2000 (mPEGzoooDSPE) (Genzyme Pharmaceuticals LLC., Кембридж, Массачусетс), додецилсульфат натрия (SDS) (Bio-Rad Laboratories,Геркулес, Калифорния) и 1,2-диолеилокси-З-триметиламмонийпропан (DOTAP) (Avanti Polar Lipids Inc., Алабастер, Алабама). Для получения каждой наносуспензии поверхностно-активные вещества суспендировали в 10 мМ буферном растворе HEPES (рН 7,8) в следующих 5 комбинациях (вес/объем): (1) только 0,5% Р188; (2) 0,5% PVA и 0,5% SDS; (3) 0,5% Р188 и 0,5% SDS; (4) 0,3% Р188 и 0,1% mPEG2oooDSPE и (5) 0,5% Р188, 0,2% mPEGzoooDSPE и 0,1% DOTAP. Затем к растворам поверхностно-активных веществ добавили лекарственное средство в форме свободного основания (ATV, EFV, IDV или RTV; 0,6% по весу). Суспензию перемешивали с применением роторно-статорной мешалки Ultra-turrax® T-18 до тех пор, пока не образовалась гомогенная дисперсия. Затем смесь перенесли в мельницу для мокрого размола NETZSCH MicroSeries (NETZSCH Premier Technologies, LLC, Экстон, Пенсильвания) вместе с 50 мл 0,8 мм мелющего тела (керамические гранулы оксида циркония). Образец обрабатывали в течение 30 минут - 1 часа при скоростях в диапазоне от 600 до 4320 оборотов в минуту до тех пор, пока не был достигнут требуемый размер частиц. Для определения размера частиц, полидисперсности и поверхностного заряда 20 мкл наносуспензии разбавили в 50 раз дистиллированной/деионизированной водой и проанализировали с помощью динамического рассеяния света с применением Malvern Zetasizer Nano 30 Series Nano-ZS (Malvern Instruments Inc., Уэстборо, Массачусетс). После того как был достигнут требуемый размер, образцы центрифугировали и полученный в результате осадок ресуспендировали в соответствующем растворе поверхностно-активного вещества вместе с 9,25% сахарозы для регуляции тоничности. Конечную концентрацию лекарственного средства определили с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Выделение и культивирование человеческих моноцитов

Человеческие моноциты, полученные с помощью лейкафереза от доноров, серонегативных в отношении HIV-1 и гепатита, очистили с помощью противоточного элютриационного центрифугирования. Моноциты культивировали в DMEM с 10% термоинактивированной объединенной человеческой сывороткой, 1% глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл ципрофлоксацина и 1000 Ед./мл рекомбинантного человеческого колониестимулирующего фактора макрофагов при концентрации 1×10⁶ клеток/мл при 37°С (Gendelman et al. (1988) J. Exp. Med., 167:1428-1441).

Электронная микроскопия

Образцы клеток фиксировали 3% глутаральдегидом в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) и дополнительно фиксировали 1% тетраоксидом осмия в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 1 часа. Затем образцы обезводили в серии спиртов возрастающей концентрации и заключили в Ероп 812 (Electron Microscopic Sciences, Форт Вашингтон, Пенсильвания) для сканирующей электронной микроскопии. Для трансмиссионной электронной микроскопии тонкие срезы (80 нм) окрасили уранилацетатом и цитратом свинца и наблюдали под трансмиссионным электронным микроскопом Hitachi H7500-1 (Hitachi High Technologies America Inc., Шаумбург, Иллинойс).

Поглощение и высвобождение NanoART

Для изучения поглощения и высвобождения nanoART применили модифицированную версию ранее опубликованного способа (Nowacek et al. (2009) Nanomedicine 4:903-917). После 7 дней дифференциации MDM обработали 100 мкМ nanoART. Поглощение nanoART оценивали без замены среды в течение 8 часов. Прикрепленные MDM промыли фосфатно-солевым буфером (PBS) и собрали посредством соскабливания в PBS. Клетки осадили центрифугированием при 950хg в течение 10 минут при 4°С. Клеточные осадки кратковременно обработали ультразвуком в 200 мкл метанола и центрифугировали при 20000хg в течение 10 минут при 4°С. Метанольный экстракт хранили при -80°С. Для изучения удержания клеткой и высвобождения nanoART на MDM воздействовали 100 мкМ nanoART в течение 8 часов, промыли 3 раза PBS и добавили свежую не содержащую nanoART среду. MDM культивировали в течение 15 дней, при этом через день заменяли половину среды. В дни 1, 5, 10 и 15 после обработки nanoART MDM собирали, как описано в отношении поглощения клеткой. Как экстракты клеток, так и среду хранили при -80°С до ВЭЖХ-анализа, как описано ранее (Nowacek et al. (2010) J. Neuroimmune Pharmacol., 5:592-601).

Микроскопия живых клеток

MDM окрасили с применением раствора для мечения клеток Vybrant® DiO (Invitrogen Corp., Карлсбад, Калифорния) и жизнеспособные MDM идентифицировали с помощью зеленой флуоресценции. NP метили с помощью лиссамин родамин В 1,2-дигексадеканоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина триэтиламмониевой соли (rDHPE; Invitrogen Corp., Карлсбад, Калифорния) с помощью добавления флуоресцентного фосфолипида в оболочку из поверхностно-активного вещества. NP, помеченные rDHPE, проявляли красную флуоресценцию. С учетом количества добавленной метки число помеченных фосфолипидных молекул представляло собой очень малую фракцию общего материала оболочки и внесло минимальный вклад в толщину фосфолипидной оболочки. Это подтверждалось измерениями размера, не показавшими значимых отличий в размерах nanoART, составленных с rDHPE-фосфолипидом или без него. Отличия не обнаруживались в поглощении или высвобождении лекарственного средства, составленного с флуоресцентным фосфолипидом, по сравнению с немечеными частицами. Фотоснимки получали каждые 30 секунд с применением Nikon TE2000-U (Nikon Instruments Inc., Мелвилл, Нью-Йорк) с помощью конфокального микроскопа с разверткой поля, лазерным возбуждением 488 нм (зеленый) и 568 нм (красный) и 60х объективом.

Противоретровирусная активность NanoART

MDM обрабатывали 100 мкМ nanoART в течение 8 часов, промыли для удаления излишка лекарственного средства и инфицировали hiv-iada при множественности инфицирования 0,01 инфекционных вирусных частиц/клетка (Gendelman et al. (1988) J. Exp. Med., 167:1428-1441) в дни 10 и 15 после обработки nanoART. После инфицирования вирусом клетки культивировали в течение десяти дней с заменой половины среды через день. Образцы среды собрали на день 10 для измерения продукции вирионов-потомков, оцениваемой с помощью активности обратной транскриптазы (RT) (Kalter et al. (1991) J. Immunol., 146:298-306). Параллельные анализы на экспрессию инфицированными клетками антигена р24 HIV-1 осуществляли с помощью иммунного окрашивания.

Активность обратной транскриптазы

Образцы среды (10 мкл) смешали с 10 мкл раствора, содержащего 100 мМ Tris-HCl (рН 7,9), 300 мМ КСl, 10 мМ DTT и 0,1% нонил феноксилполиэтоксилэтанола-40 (NP-40). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 15 минут. На данном этапе в каждую лунку добавили 25 мкл раствора, содержащего 50 мМ Tris-HCl (рН 7,9), 150 мМ КСl, 30 мМ DTT, 15 мМ MgCl₂, 0,05% NP-40, 10 мкг/мл поли(А), 0,250 Ед./мл олиго d(T)12-18 и 10 мКи/мл ³H-ТТР, и инкубировали при 37°С в течение 18 часов. После инкубации в каждую лунку добавили 50 мкл охлажденной 10% трихлоруксусной кислоты (ТСА), содержимое лунок собрали на стекловолоконные фильтры и провели их оценку на включение ³H-ТТР с помощью Р-сцинтилляционной спектроскопии (Kalter et al. (1991) J. Immunol., 146:298-306).

Иммуногистохимия

Через десять дней после инфицирования HIV-1 клетки фиксировали 4% параформальдегидом, забуференным фосфатным буфером, в течение 15 минут при комнатной температуре (RT). Фиксированные клетки блокировали 10% BSA вес./1% Triton Х-100 (в PBS) в течение 30 минут при комнатной температуре и инкубировали с моноклональными антителами мыши к р24 HIV-1 (1:100, Dako, Карпинтерия, Калифорния) в течение 3 часов. Связывание р24 антителом выявляли с применением системы Dako EnVision™+, HRP-меченого полимера-вторичного антитела к мыши, и окраски диаминобензидином (Nowacek et al. (2010) J. Neuroimmune Pharmacol., 5:592-601; Nowacek et al. (2009) Nanomedicine 4:903-917). Клеточные ядра перекрашивали гематоксилином. Фотоснимки получали с применением микроскопа Nikon TE300 с 40х объективом.

Цитотоксичность

Для определения эффекта обработки nanoART на жизнеспособность клеток MDM обрабатывали 100 мкМ nanoART в течение 8 часов, промыли PBS и оценили жизнеспособность с применением анализа с МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифепилтетразолия бромид). При примененных концентрациях обработки не обнаружили влияния на жизнеспособность клеток для какого-либо из составов.

Эффективность NanoART

Площадь под кривой (AUC) определяли на протяжении 8 часов поглощения лекарственного средства MDM, 15 дней высвобождения лекарственного средства MDM (уровни для клетки и средние уровни) и 15 дней противоретровирусной эффективности (активность RT в супернатанте из MDM, инфицированных HIV). Балльную оценку поглощения и высвобождения рассчитывали как взвешенное относительно десяти соотношение каждого состава в зависимости от наилучшей AUC для каждого родительского лекарстЕюнного средства/экспериментального параметра. Балльную оценку противоретровирусной активности определяли из взвешенных относительно десяти соотношений AUC обратной активности RT для каждого родительского лекарственного средства. AUC определяли из уровня каждого лекарственного средства или активности RT в зависимости от времени. В пределах каждого родительского лекарственного средства состав с наночастицами, который давал самую высокую AUC для поглощения, удержания клеткой или высвобождения в среду, оценивали как 10, ив то же время, состав, который давал самую низкую активность RT, оценивали как 10. Остальным составам в пределах каждой группы родительского лекарственного средства давали балльную оценку, как пропорцию относительно наилучшей оценки 10, исходя из отношения AUC/АиСнаилучшая. Балльные оценки из каждого параметра для каждого состава с наночастицами лекарственного средства усреднили для получения среднего конечной балльной оценки для каждого состава. Составы со средними конечными балльными оценками в пределах верхних 2 квартилей каждой родительской группы лекарственного средства предназначали для продолжающегося тестирования (GO), тогда как оценивания для составов со средними в пределах нижних 2 квартилей прерывали (NOGO).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Получение и определение характеристик nanoART

21 состав nanoART, которые состояли из кристаллов лекарственного средства с наноразмерами из противоретровирусных лекарственных средств в форме свободных оснований, покрытых тонким слоем фосфолипидного поверхностно-активного вещества. Пять различных комбинаций поверхностно-активных веществ применялось для каждого лекарственного средства для обеспечения в целом 5 составов для каждого лекарственного средства. Для определения эффекта размера на поглощение и высвобождение клеткой, а также на противоретровирусную эффективность получали добавочные составы RTV с более крупными частицами с применением поверхностно-активных веществ Pl88/mPEG₂₀₀₀DSPE. Для всех составов определили характеристики, исходя из их физических свойств, в том числе оболочки, размера, заряда и формы. Составы имели аналогичный размер и находились в диапазоне от 233 нм (состав IDV M1005) до 423 нм (состав RTV M2005) со средним размером 309 нм (таблица 1). Распределения размера частиц не отличались от того, что известно для липосомальных или других составленных в наночастицы составов лекарственных средств, полученных с помощью способов мокрого размола (Takatsuka et al. (2009) Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 57:1061-1067; Van Eerdenbrugh et al. (2007) Int. J. Pharm., 338:198-206). Чтобы оценить однородность размера частиц для каждого состава, измерили полидисперсность каждого состава. Индексы полидисперсности (PDI) находились в диапазоне от 0,180 (состав RTV M2004) до 0,301 (состав ATV M3004), что указывает на то, что хотя большинство частиц были близки к рассчитанному среднему размеру, в пределах каждого состава существовало разнообразие размеров. Добавочный состав RTV-Pl88/mPEG₂₀₀₀DSPE (M2006) с размером 540 нм приблизительно в два раза превышал размер М2002 (265 нм). Для каждого состава также определяли дзета-потенциал. Самыми отрицательно заряженными составами были те, которые содержали в качестве поверхностно-активных веществ Р188 и SDS (M1004, M2004, M3004 и М4004). Добавление DOTAP придало положительный заряд составам М1003, М2003, МЗООЗ и М4003. Остальные комбинации поверхностно-активных веществ придавали составам разную степень отрицательного заряда. Морфология частиц варьировала в зависимости от лекарственного средства; однако все составы с одинаковым лекарственным средством имели аналогичную форму (фиг.1). Частицы IDV и EFV имели полигональные формы с зазубренными краями. Составы ATV напоминали длинные тонкие палочки с гладкими краями, тогда как составы RTV напоминали более короткие и более толстые палочки с гладкими краями. Трансмиссионная электронная микроскопия подтвердила внутриклеточное включение nanoART и продемонстрировала, что структурная целостность nanoART сохраняется внутри клеток.

Лекарственное средство ^а Состав Поверхностно-активное вещество Размер (нм)^b PDI^c Дзета-потенциал (мB) IDV М1001 Р188 302 0,259 -10,46 М1002 P188,mPEG₂₀₀₀-DSPE 332 0,269 -35,63 М1003 Р188, mPEG₂₀₀₀₀-DSPE, 340 0,264 26,64 DOTAP М1004 P188,SDS 252 0,286 -40,58 М1005 PVA,SDS 233 0,273 -7,47 RTV М2001 Р188 347 0,235 -13,52 М2002 Р188, mPEG₂₀₀₀-DSPE 265 0,258 -23,69 М2003 Р188, mPEG₂₀₀₀-DSPE, 375 0,272 21,65 DOTAP М2004 Р188, SDS 360 0,18 -36,70 М2005 PVA, SDS 423 0,21 -31,96 М2006 Р188, mPEG₂₀₀₀-DSPE 540 0,192 -25,47 ATV М3001 Р188 281 0,288 -15,31 М3002 Р188, mPEG₂₀₀₀-DSPE 269 0,241 -26,52 М3003 Р188, mPEG₂₀₀₀-DSPE, 280 0,237 25,85 DOTAP М3004 Р188, SDS 296 0,301 -42,63 М3005 PVA, SDS 260 0,287 -8,18 EFV М4001 Р188 311 0,273 -13,60 М4002 Р188, mPEG₂₀₀₀-DSPE 325 0,281 -32,47 М4003 Р188, mPEG₂₀₀₀-DSPE, 331 0,235 23,29 DOTAP М4004 Р188, SDS 315 0,259 -41,38 М4005 PVA, SDS 290 0,241 -15,25

Таблица 1: Физико-химические характеристики nanoART.

^a Сокращения, применяемые в таблице: ATV: атазанавир; DOTAP: (1-олеоил-2-[6-[(7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-ил)амино]гексаноил]-3-триметиламмония пропан); DSPE: 1,2-дистеароил-фосфатидил-этаноламин; EFV: эфавиренз; IDV: индинавир; Р188: полоксамер 188 (также называемый Pluronic™ F68); PVA: поливинилспирт; RTV: ритонавир; SDS: додецилсульфат натрия. ^b Размеры частиц и ^с индексы полидисперсности (PDI) определяли с помощью динамического рассеяния света (DLS); представлены z-средние диаметры. Получали по меньшей мере 4 повторения для каждого показания и показания варьировали меньше чем на 2%.

Поглощение па по ART

После определения характеристик физических свойств составов, их тестировали in vitro на РК и клеточное процессирование с помощью MDM. Поглощение nanoART в MDM показало, что >95% абсолютного поглощения происходит к 8 часам для большинства nanoART (Dou et al. (2006) Blood 108:2827-2835; Dou et al. (2007) Virology 358:148-158; Nowacek et al. (2010) J. Neuroirranune Pharmacol., 5:592-601; Nowacek et al. (2009) Nanomedicine 4:903-917). Следовательно, все эксперименты по поглощению проводили в течение 8 часов и количество лекарственного средства, содержавшегося в клетках к этому времени, считали максимумом. Для всех составов IDV скорость поглощения была аналогичной, и 85% максимального поглощения происходило к 4 часам (фиг.2А). К 8 часам уровни лекарственного средства в клетке находились в диапазоне от 10,7 до 16,7 мкг/10⁶ клеток для М1004 и М1002, соответственно. Для всех составов RTV скорость поглощения была также аналогичной (фиг.2В). К 4 часам произошло приблизительно 80% максимального поглощения. Максимальные уровни RTV в клетках к 8 часам находились в диапазоне от 18,2 до 27,0 мкг/10⁶ клеток для М2005 и М2004, соответственно. В отличие от IDV и RTV скорость поглощения у составов ATV отличалась, и уровни в клетках к 4 часам находились в диапазоне от 65% до 90% максимума (фиг.2С). Максимальное количество поглощения NanoART происходило для всех составов ATV в 8 часов. Максимальные уровни ATV в клетках у составов колебались в широких пределах, и находились в диапазоне от 8,6 до 37,1 мкг/10⁶ клеток для М3005 и М3001, соответственно. Для всех составов EFV скорость поглощения была аналогичной; и максимальное поглощение для большинства происходило к 1 часу (фиг.2D). Для составов EFV наблюдался узкий диапазон максимального уровня в клетках, от 0,5 до 1,5 мкг/10⁶ клеток для М4003 и М4005, соответственно. Поглощение лекарственного средства визуализировали в реальном времени с применением конфокального формирования изображений живых клеток. В этих экспериментах MDM, меченные зеленым, обработали меченными красным М3001 или М3005, и фотоснимок получали каждые 30 секунд в течение 4 часов. Полученные в результате видеозаписи подтвердили ВЭЖХ-измерения поглощения лекарственного средства. MDM накапливали частицы М3001 при гораздо большей скорости и в больших количествах, чем частицы М3005, на что указывает множество красных NP в цитоплазме. Фигура 3 иллюстрирует AUC для концентраций лекарственного средства в MDM на протяжении 8 часов инкубации. AUC (общие концентрации лекарственного средства в мкг/10⁶ клетках) оценивали для всех составов nanoART. Эти значения применили для балльного оценивания поглощения составов nanoART на фигуре 4.

Удержание клеткой и высвобождение NanoART

После 8-часового периода загрузки nanoART MDM культивировали в течение еще 15 дней в среде, не содержащей лекарственное средство, для изучения как удержания клеткой nanoART, так и высвобождения лекарственного средства в среду. Замены половины среды происходили через день на протяжении 15-дневного периода для облегчения высвобождения лекарственного средства. Для всех составов IDV профили удержания клеткой и клеточного высвобождения были аналогичными (фиг.5). Приблизительно 90% того, что содержалось внутри клеток после загрузки, высвобождалось в течение первых 24 часов; однако для всех составов IDV уровни лекарственного средства были низкими, но обнаруживаемыми внутри клеток вплоть до дня 15 (таблица 2). Концентрация IDV в среде постоянно снижалась от дня 1 до дня 10 (фиг.5). Для Ml 001 низкие, но обнаруживаемые количества лекарственного средства обнаруживались в среде вплоть до дня 15; однако IDV не обнаруживался в среде ко дню 15 для всех остальных составов IDV. Для всех составов RTV профили удержания клеткой и клеточного высвобождения также были аналогичными (фиг.5). В отличие от IDV только 20% RTV, содержавшегося внутри клеток после загрузки, высвободилось в течение первых 24 часов, и лекарственное средство все еще обнаруживалось внутри клеток для всех составов RTV на день 15 (таблица 2). Концентрация RTV в среде снижалась постоянно от дня 1 до дня 15, с уровнями все еще превышающими 6 мкг/мл на день 15 для всех составов RTV. В отношении составов IDV и RTV профили удержания клеткой были аналогичными для всех составов ATV (фиг.5); однако абсолютное количество лекарственного средства варьировало в зависимости от уровня загрузки к 8 часам. В течение первых 24 часов приблизительно 4 мкг/10⁶ клеток ATV высвобождалось для всех составов, независимо от начальных уровней в клетке после загрузки. Однако после этого начального всплеска высвобождения лекарственного средства, клетки удерживали лекарственное средство и только небольшие количества высвобождались с течением времени. После 15 дней клетки, загруженные М3001 и М3004, все еще удерживали больше 50% начального количества лекарственного средства (таблица 2). Профили уровней лекарственного средства в среде после высвобождения ATV из клеток, загруженных nanoART, снова были почти идентичными для всех составов (фиг.5). На день 5 содержание ATV внутри среды было больше 1,5 мкг/мл для всех составов, кроме М3005, и оставалось 0,25-1,1 мкг/мл вплоть до дня 15. Для всех составов EFV профили и количества как для удержания клеткой, так и для высвобождения также были аналогичными (фиг.5). Как наблюдали для составов IDV приблизительно 90% EFV, который присутствовал внутри клеток во время нуль, высвободилось в течение первых 24 часов; однако на день 15 лекарственное средство все еще обнаруживалось внутри клеток для всех составов EFV (таблица 2). Концентрации EFV в среде постоянно снижались от дня 1 до дня 15 (фиг.5), с низкими уровнями обнаруживаемого лекарственного средства вплоть до дня 15 для всех составов EFV (таблица 2).

Лекарственное Состав средство Уровни в клетках (мкг/10 клеток) Уровни в среде (мкг/мл) 5 дней 15 дней 5 дней 15 дней М1001 0,29±0,01^a 0,22±0,01 4,99±0,90 0,32±0,18 М1002 0,34±0,06 0,26±0,02 6,65±1,79 n.d.^b IDV М1003 0,32±0,01 0,14±0,01 5,60±0,79 n.d. М1004 0,30±0,01 0,11±0,05 3,28±0,12 n.d. М1005 0,30±0,03 0,09±0,11 6,66±0,88 n.d. М2001 10,06±0,70 0,88±0,23 8,69±0,48 7,52±0,53 М2002 15,23±1,34 0,48±0,15 10,92±0,24 8,79±1,13 М2003 12,28±0,15 0,89±0,11 10,11±0,52 6,92±0,17 RTV М2004 16,43±2,32 1,96±1,62 12,61±0,55 9,70±1,40 М2005 9,96±4,46 0,42±0,26 12,34±0,85 8,00±1,64 М2006 13,48±1,36 0,52±0,14 11,09±0,13 6,16±0,68 М3001 33,72±1,56 20,72±1,89 0,85±0,09 1,07±0,20 М3002 20,00±2,61 10,77±0,92 1,58±0,93 0,60±0,12 ATV м3003 15,18±1,86 3,92±0,10 1,47±0,27 0,60±0,10 М3004 29,57±0,22 17,51±4,15 0,77±0,18 0,64±0,05 М3005 6,87±1,26 0,88±0,55 2,40±0,53 0,29±0,16 М4001 0,07±0,02 0,003±0,001 0,74±0,07 0,13±0,003 М4002 0,07±0,002 0,003±0,0008 0,90±0,10 0,13±0,01 EFV М4003 0,04±0,007 0,003±0,001 0,58±0,12 0,10±0,02 М4004 0,06±0,0004 0,003±0,0005 0,78±0,07 0,12±0,01 М4005 0,17±0,04 0,02±0,0004 2,38±0,22 0,20±0,04

Таблица 2: Высвобождение ART.

Данные выражены как среднее ± SEM, N=3. ^b n.d.: не обнаруживаемые (предел обнаружения 0,02 мкг/мл).

Противоретровирусная эффективность

Для определения действенности nanoART в подавлении репликации HIV MDM заражали HIV-1_ADA в 1, 5, 10 и 15 дни после обработки nanoART. После заражения HIV MDM продолжали культивировать и образцы среды собирали через 10 дней для анализа RT. Все составы IDV обеспечивали низкую, но аналогичную противоретровирусную эффективность. Репликация HIV снижалась приблизительно на 20%, если заражение вирусом происходило на день 15 после обработки nanoART (фиг.6). Напротив, все составы EFV обеспечивали почти полную защиту от HIV-инфекции вплоть до заражения в день 15 после обработки nanoART несмотря на относительно небольшое количество лекарственного средства, которое оставалось внутри клеток. Составы RTV и ATV продемонстрировали широкий спектр подавления HIV. При заражении вирусом в день 15 подавление находилось в диапазоне от 25% до 60% для составов RTV (M2002 и М2004, соответственно) и от 20% до 80% для составов ATV (M3005 и М3001, соответственно). Интересно, что активность RT прямо коррелировала с количеством лекарственного средства, оставшегося в клетках для составов ATV и EFV, с коэффициентом корреляции 0,92 для каждой группы лекарственного средства.

Экспрессию антигена р24 HIV-1 применили для сопоставления активности RT и пролиферации HIV. Для каждого вида противоретровирусного лекарственного средства, составы с наилучшими и наихудшими показателями, как определяется по поглощению, удержанию клеткой, высвобождению лекарственного средства и активности RT, тестировали для целей сравнения. Такими составами были М1004 и М1002 (IDV), М2004 и M2002 (RTV), М3001 и M3005 (ATV) и М4005 и М4003 (EFV). MDM, загруженные nanoART, заражали HIV-1_ADA в 1, 5, 10 и 15 дни после обработки nanoART и затем тестировали на присутствие антигена р24 в 10 день после заражения. Эмпирическая оценка экспрессии антигена р24 продемонстрировала постепенное увеличение HIV-инфекции с течением времени (отмечается по усиливающемуся коричневому окрашиванию) для всех nanoART. Однако состав с наилучшими показателями каждого лекарственного средства, т.е. М1004, М2004, М3001 и М4005, сдерживал увеличение экспрессии р24 в большем диапазоне, чем состав с наихудшими показателями, т.е. М1002, M2002, M3005 и М4003 (фиг.7). Особенно интересно, что все составы EFV супрессировали вирусную инфекцию вплоть до заражения в день 15. Экспрессия р24 для всех составов nanoART отражала уровень активность RT.

Система балльного оценивания nanoART

Все составы с наночастицами оценивали на поглощение в MDM и высвобождение из них, а также на их противоретровирусную активность в MDM, инфицированных HIV-1. Составы с наночастицами в пределах каждого экспериментального параметра оценивали и ранжировали на основании состава с наилучшими показателями в рамках каждой группы родительского лекарственного средства (фиг.4). Данные ранжировали на основании суммарных баллов (общий) и средних конечных баллов. Заключение "Go" давали составам с оценками в пределах верхних 2 медианных квартилей, тогда как обозначение "No Go" давали таковым с балльной оценкой в нижних 2 медианных квартилях. Однако обозначение "по до" никоим способом не указывает, что такие составы нельзя или не следует применять для терапевтических или иных целей, обозначение указывает только, что другие составы были более предпочтительны на основании настоящих анализов и результатов. Составы IDV M1002 и М1005 имели самые высокие средние конечные баллы и таким образом получили заключение "Go". Для составов RTV общие средние баллы М2003 и М2005 (7,3) также представляли собой медиану; таким образом, только двум составам (М2004 и М2006) дали обозначение "Go". Для составов ATV "Go" обозначили М3001 и М3002. Явное разделение в оценке, 7,5 по сравнению с 5,1, наблюдали между составами ATV "Go/No Go". Один состав EFV, М4005, получил наивысшую оценку каждого протестированного параметра и имел конечный средний балл 10. Следующий конечнрэ1Й балл для составов EFV (M4002) составил приблизительно половину, 5,1 (M4005). Хотя для этих двух составов разница в среднем конечном балле была значительной, оба получили решение "Go".

Изготовили 21 состав nanoART из 4 противоретровирусных лекарственных средств, для оценки nanoART определили характеристики и испытали в in vitro испытательной системе с MDM. Тип лекарственного средства, оболочка из поверхностно-активного вещества и форма продемонстрировали существенные эффекты на поглощение частиц, высвобождение лекарственного средства и противоретровирусные ответы, в то время как заряд и размер частицы оказывали несущественные эффекты. Эффект оболочки из поверхностно-активного вещества существенно варьировал у типов лекарственного средства. Для четырех из пяти составов IDV, RTV и EFV тесты были аналогичными. Комбинацию поверхностно-активных веществ P188/mPEG₂₀₀₀DSPE обозначили как "GO''-состав для всех испытанных лекарственных средств, за исключением ATV.

Форма частиц имела влияние на показатели nanoART. Частицы IDV и EFV были округлыми с неправильными краями и показали сниженное поглощение клеткой. Напротив, RTV и ATV были палочковидной формы, с гладкими, правильными краями. Палочки RTV были короче с более гладкими углами, в то время как ATV представляли собой более длинные палочки с более острыми краями. Наиболее эффективное поглощение частиц наблюдалось у М3001, состава ATV, что позволяет предположить, что более длинные палочки захватываются наиболее быстро. Эти результаты согласуются с исследованиями, которые проверяли эффект формы частиц на кинетику фагоцитоза в макрофагах и обнаружили, что сферические частицы захватывались медленнее, чем короткие палочки, и что длинные палочки захватывались быстрее, чем короткие палочки (Huang et al. (2010) Biomaterials 31:438-448; Chithrani et al. (2006) Nano Lett., 6:662-668; Gratton et al. (2008) Proc. Nati Acad. Sci., 105:11613-11618).

Одним из наиболее важных факторов, которые воздействуют на показатели nanoART, была химическая природа родительского лекарственного средства. Все составы ATV продемонстрировали хорошую РК, но относительно слабую противоретровирусную эффективность. При этом, несмотря на низкое поглощение EFV nanoART, они проявили наилучшие противоретровирусные эффективности. Интересно, что растворимость ATV в форме свободного основания более чем в 300 раз превышает растворимость других лекарственных средств в форме свободных оснований (ATV: 4-5 мг/мл в сравнении с IDV: 15 мкг/мл, EFV: 9 мкг/мл или RTV: 1-2 мкг/мл) (Wishart et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36:D901-D906; Wishart et al. (2006) Nucleic Acids Res., 34:D668-D672), и, вероятно, на поглощение и высвобождение составов с наночастицами ATV наибольшее влияние оказывает оболочка из поверхностно-активного вещества. NanoART могут состоять из до 99% чистого кристалла лекарственного средства и, как результат, конкретные противоретровирусные лекарственные средства могут лучше подходить для доставки, опосредованной клетками MDM, нежели другие. При сравнении противоретровирусной активности всех составов nanoART в пределах одной группы лекарственного средства, хорошим прогностическим параметром эффективности является то, сколько лекарственного средства содержится внутри клеток. Для составов nanoART с EFV и ATV установили сильную корреляцию (0,92) между тем, сколько лекарственного средства содержалось внутри клеток и степенью защиты от HIV-инфекции. Клетки, содержавшие больше лекарственного средства, обеспечивались более высоким уровнем защиты, независимо от того, сколько лекарственного средства присутствовало в среде. В дни 5 и 15 количество лекарственного средства, присутствующего в среде для всех составов лекарственного средства, превышало уровни ECso для активности против HIV, сообщаемые для множества линий HIV и типов клетки-хозяина (1,7-25 нМ, EFV; 35-200 нМ, RTV; 5-29 нМ IDV; 2-5 нМ ATV) (Robinson et al. (2000) Antimicrob. Agents Chemother., 44:2093-2099). Кроме того, уровни в среде на день 5 для всех лекарственных средств были эквивалентны терапевтическим уровням в человеческой плазме (1,8-4,1 мкг/мл, EFV; 3,5-9,6 мкг/мл RTV; 0,15-8,0 мкг/мл IDV и 0,3-2,2 мкг/мл, ATV (Shannon et al., Haddad и Winchester's Clinical Management of Poisoning and Drug Overdose, 4th ed. Saunders Elsevier, Philadelphia, PA, 2007; von Hentig efc al. (2008) J. Antimicrob. Chemother., 62:579-582). Вместе эти результаты указывают на то, что nanoART в первую очередь проявляют свои противоретровирусные эффекты внутри клетки.

Хотя количество nanoART, содержавшихся внутри MDM, является важным показателем степени защиты от HIV-1 инфекции, он не является единственным определяющим фактором. Некоторые из nanoART лекарственных средств были высокоэффективными при очень малом количестве, тогда как другие, присутствовавшие в клетках в больших количествах, были менее эффективны. Например, на день 15, уровни IDV в клетках, обработанных nanoART, были необнаруживаемыми; однако же, HIV-1 инфекция все еще была снижена до приблизительно 20%. Напротив, количество EFV, содержавшегося в клетках после обработки nanoART, было крайне низким для всех составов, однако, клетки были практически полностью защищены от HIV-инфекции. К тому же, клетки, обработанные ATV nanoART, имели уровни лекарственного средства более чем в 1000 раз превышающие таковые для клеток, обработанных EFV nanoART, но оставались инфицированы HIV в разной степени. Возможное объяснение этого феномена таково, что не все nanoART направленно перемещаются через клетку одинаковым способом и могут храниться в различных внутриклеточных компартментах. Если это действительно так, это позволяет предположить, что местоположение nanoART внутри клетки может быть настолько же важным, как и то, сколько лекарственного средства действительно попадает в клетку. Например, если nanoART локализуется в том же эндосомальном компартменте, в котором происходит репликация HIV, может потребоваться лишь небольшое количество лекарственного средства для полного подавления репликации вируса. С другой стороны, nanoART, которые хранятся в компартменте, отделенном от того, где происходит репликация HIV, могут быть менее эффективными, даже если и присутствуют в больших количествах. Важность внутренних механизмов, внутриклеточного направленного перемещения и внутриклеточного хранения наноматериалов для их биологических эффектов уже была продемонстрирована (Jiang et al. (2008) Nat. Nanotechnol., 3:145-150; Vallhov et al. (2007) Nano Lett., 7:3576-3582; Slowing et al. (2006) J. Am. Chem. Soc., 128:14792-14793).

В данном случае, двумя факторами, имевшими относительно меньший эффект на показатели nanoART, были размер и заряд. В других исследованиях было показано, что размер наночастиц может сильно влиять на функцию, однако в настоящем исследовании нельзя было увидеть явных различий в показателях nanoART, исходя только из размера частиц (Jiang et al. (2008) Nat. Nanotechnol., 3:145-150; Vallhov et al. (2007) Nano Lett., 7:3576-3582; Ferrari, M. (2008) Nat. Nanotechnol., 3:131-132). Это отсутствие эффекта размера могло быть связано с подобием в размерах nanoART, которые находились в диапазоне от 233 нм до 423 нм и, в основном, не варьировали больше чем на 100 нм. Исключением было сравнение общих показателей М2006 и М2002; оба были покрыты одинаковой комбинацией поверхностно-активного вещества, но они отличались по размеру приблизительно в 2 раза. М2002, который имел наихудшие показатели среди всех составов nanoART с RTV, имел приблизительно половину размера М2006, показатели которого были вторыми наилучшими. Из этого следует, что более крупные частицы nanoART могут иметь лучшие показатели, чем более мелкие, и, в соответствии с результатами других исследований, что предполагаемые более; крупные nanoART (ближе по размеру к 1 мкм) могут захватываться MDM более эффективно с продолженным высвобождением лекарственного средства. Заряд частицы также имел более ограниченные эффекты на показатели nanoART. Большинство частиц имело сильный отрицательный заряд (<-15,0 мВ), несколько имело относительно слабые заряды (от -15 мВ до 0 мВ) и несколько имело сильные положительные заряды (>20 мВ). Было показано, что сильно заряженные NP захватываются лучше, чем таковые со слабыми или нейтральными зарядами (Roser et al. (1998) Eur. J. Pharm. Biopharm., 46:255-263). Состав nanoART, который имел наилучшие показатели для каждого исследованного лекарственного средства, имел сильный отрицательный заряд, тогда как таковые со слабыми отрицательными зарядами (<-8,2), ранжировались в нижние два. Наблюдалась тенденция, что положительно заряженные частицы ранжировались в центр своих групп. Этот результат убедительно указывает, что заряженные nanoART имеют лучшие показатели, чем таковые с нейтральным зарядом.

Перекомпоновка традиционных лекарственных препаратов ART в nanoART и применение макрофагов в качестве переносчиков предлагает несколько преимуществ в лечении HIV-1 инфекции в том числе: (i) пролонгированшэ1е концентрации лекарственного средства в плазме; (ii) медленное и постоянное высвобождение лекарственного средства; (iii) адресная доставка лекарственного средства в места активной инфекции и (iv) сниженную токсичность. Как исследования in vitro, так и исследования in vivo продемонстрировали, что загрузка макрофагов nanoART значительно улучшает поиск тканей-мишеней и эффективность противоретровирусных лекарственных препаратов, в тоже время одновременно снижая цитотоксичность. Фактически, in vivo исследования с применением кристаллических противоретровирусных NP показали терапевтическую пользу и отмечается, что при введении in vivo, эти типы NP, вероятно, захватываются макрофагами.

ПРИМЕР 2

Кристаллические противоретровирусные наночастицы (nanoART) значительно увеличивают интервалы дозирования лекарственного средства, снижают концентрации лекарственного средства для введения, облегчают доступ лекарственного средства в убежища вируса, сокращают неблагоприятные побочные эффекты и улучшают пригодность лекарственного средства для инфицированных индивидуумов. Последнее адресовано пациентам, показывающим неудовлетворительное соблюдение режима терапии, имеющим ограниченную абсорбцию пероральных лекарственных средств или мало возможностей получать необходимые лекарственные препараты. Моноциты и макрофаги, происходящие из моноцитов (MDM), применяемые для переноса nanoART, обладают превосходной стабильностью, меньшей токсичностью и сильной противоретровирусной эффективностью по сравнению с несоставленными лекарственными средствами (Dou et al. (2006) Blood 108:2827-2835; Dou et al. (2007) Virology 358:148-158; Nowacek et al. (2009) Nanomed. 4:903-917). Действительно, MDM, загруженные nanoART, способны пересекать биологические барьеры в ответ на передачу сигнала цитокинами, доставлять лекарственное(ые) средство(а) непосредственно в инфицированные ткани и существенно снижать репликацию вируса (Dou et al. (2009) J. Immunol., 183:661-669). Исследования на животных подкрепили in vitro результаты и продемонстрировали, что клинически релевантные количества лекарственного средства присутствуют как в сыворотке, так и тканях вплоть до 3 месяцев после однократного введения (Baert et al. (2009) Eur. J. Pharm. Biopharm., 72:502-508; Van't Klooster et al. (2010) Antimicrob. Agents Chemother., 54:2042-2050).

В данном примере изучалась внутриклеточная локализация nanoART от точки начального поглощения до конечного высвобождения. Наблюдали, что после быстрой клатрин-зависимой интернализации частицы лекарственного средства проходят сортировку в пути рециркуляции и, в силу этого, избегают деградации. Лекарственное средство высвобождалось интактным из MDM, и у него не снижалась противоретровирусная эффективность. Что интересно, пути направленного перемещения частиц параллельны тем, которые наблюдались для эндоцитозной сортировки HIV. Такие параллели между внутриклеточным эндоцитозным местом локализации HIV и nanoART обеспечивают добавочное преимущество в ограничении вирусной репликации. В своей совокупности, результаты исследований указывают на опосредованную макрофагами доставку лекарственного средства как на возможный метод лечения для более эффективной и упрощенной схемы приема лекарственного средства для HIV-инфицированных людей.

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Антитела и реактивы

Антитело (Аb) козы к Rabll и Rab7, вместе с человеческими siRNA к Rab8, Rabll и Rabl4, приобрели в Santa Cruz Biotechnology (Калифорния, США). Реактив доставки siRNA silenceMag и магнитные планшеты приобрели у Oz Biosciences (Марсель, Франция). Аb кролика к ассоциированному с мембраной лизосомы белку 1 (LAMP1) приобрели у Novus Biologicals (Колорадо, США). Аb кролика к антигену 1 ранней эндосомы (ЕЕА1), клатрину, Rab8 и Rabl4 приобрели у Cell Signaling Technologies (Массачусетс, США). Конъюгат pHrhodo-декстран для фагоцитоза, родамин фаллоидин, фаллоидин Alexa Fluor® 488 и 647, трансферрин (Tfn) конъюгированный с Alexa Fluor® 594, антитело к кролику с Alexa Fluor® 488, 594, 647, антитело к мыши с Alexa Fluor® 488, 594, 647, антитело к козе с Alexa F'.luor® 488, раствор против выцветания ProLong® Gold с 4', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) все приобрели у Molecular Probes (Орегон, США). Дайносор и индометацин приобрели у Sigma-Aldrich (Миссури, США).

Изготовление и определение характеристик RTV-NP

Наночастицы ритонавира (RTV-NP) получили с помощью гомогенизации высокого давления с применением гомогенизатора Avestin C-5 (Avestin, Inc., Онтарио, Канада), как описывалось ранее (см. выше и Nowacek et al. (2009) Nanomed., 4:903-917). Поверхностно-активные вещества, применяемые для покрытия кристаллов лекарственного средства, включали полоксамер 188 (Р188; Spectrum Chemicals, Калифорния, США), 1,2-дистеароил-фосфатидилэтаноламинметил-полиэтиленгликоль 2000 (mPEG₂₀₀₀-DSPE) и 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP), приобретенные у Avanti Polar Lipids, Inc. (Алабама, США). Для покрытия кристаллов лекарственного средства с наноразмерами, каждое поверхностно-активное вещество составляли из (вес./об. %) Р188 (0,5%), mPEG₂₀₀₀-DSPE (0,2%) и DOTAP (0,1%). Наносуспензии составляли при слегка щелочном рН 7,8 с применением либо 10 мМ фосфата натрия, либо 10 мМ HEPES в качестве буфера. Тоничность регулировали с помощью глицерина (2,25%) или сахарозы (9,25%). Лекарственное средство в форме свободного основания добавили к раствору поверхностно-активного вещества с получением концентрации приблизительно 2% [отношение вес к объему (%)]. Раствор перемешивали в течение 10 минут с применением роторно-статорной мешалки Ultra-Turrax™ T-18 (IKA® Works Inc. [Северная Каролина, США]) для снижения размера частиц. Суспензию гомогенизировали при 20000 psi в течение приблизительно 30 проходов или до тех пор, пока не достигали требуемого размера частиц. Размер измеряли с применением прибора для определения рассеяния света HORIBA LA 920 (HORIBA Instruments Inc., Калифорния, США). Для определения полидисперсности и дзета-потенциала 0,1 мл суспензии развели в 9,9 мл 10 мМ HEPES, рН 7,4, и анализировали с помощью динамического рассеяния света с применением Malvern Zetadsizer Nano Series (Malvern Instruments Inc., Массачусетс, США). Получали по меньшей мере четыре повторения для каждого показания, и показания варьировали меньше 2%. После того как достигался требуемый размер, образцы центрифугировали и образующийся в результате осадок ресуспендировали в растворе поверхностно-активного вещества, содержащего 9,25% сахарозы для регуляции тоничности. Размер и форму частиц определяли с помощью сканирующей электронной микроскопии, как описано ниже. RTV-NP метили флуоресцентной меткой с применением раствора для мечения клеток 1,1'диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндодикарбоцианинперхлората (DiO) Vybrant™ (Ex: 484 hm; Em: 501 нм) или 3,3'-диоктадецилоксакарбоцианинперхлората (DiD; Ex: 644 нм; Em: 665 нм; Invitrogen [Калифорния, США]). Частицы пометили при комбинировании 1 мл суспензии RTV-NP с 5 мкл красителя и смешивании в течение ночи. После центрифугирования при 20000хg, частицы промывали 5% человеческой сывороткой, содержащей среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM) до тех пор, пока не удалили весь излишек красителя (по меньшей мере пять промывок). Конечное содержание лекарственного средства составов определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Выделение и культивирование человеческих моноцитов

Человеческие моноциты получили с помощью лейкафереза от доноров, серонегативных в отношении HIV и гепатита, и очистили посредством противоточного элютриационного центрифугирования, следуя разрешению экспертного совета организации в Медицинском центре Университета Небраски. Получали цитоспины, окрашенные по Райту, и чистоту клеток оценивали с помощью иммуномечения с антителом к CD68 (клон КР-1). Моноциты культивировали при концентрации 1×10⁶ клетки/мл при 37°С в увлажненной атмосфере (5% CO₂) в DMEM, дополненной 10% термоинактивированной объединенной человеческой сывороткой, 1% глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл ципрофлоксацина и 1000 Ед./мл рекомбинантного человеческого колониеобразующего фактора макрофагов (MCSF), щедрый дар от Pfizer Inc. (Массачусетс, США). Чтобы индуцировать дифференциацию в макрофаги, моноциты культивировали в течение 7 дней в присутствии MCSF.

Поглощение и высвобождение RTV-NP

Макрофаги, происходящие из моноцитов (2×10⁶ на лунку), культивировали с RTV-NP при 100 мкМ. Поглощение частиц оценивали без замены среды в течение 24 часов со сбором клеток в указанные моменты времени. Прикрепленные MDM собирали с помощью трехкратной промывки 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) после соскабливания клеток в 1 мл PBS. Образцы центрифугировали при 950хд в течение 10 минут при 4°С и супернатант удаляли. Осадки клеток обработали ультразвуком в 200 мкл метанола и центрифугировали при 10000xq в течение 10 минут при 4°С. Метанольные экстракты хранили при -80°С до тех пор, пока не проводили ВЭЖХ-анализ. После начального 12-часового воздействия RTV-NP на протяжении 2-недельного периода оценивали высвобождение лекарственного средства из MDM с заменой половины среды через день. Образцы среды сохраняли вместе с повторными отборами клеток и хранили при -80°С до тех пор, пока стало можно провести ВЭЖХ-анализ. Суспензии клеток, экстрагированные метанолом, центрифугировали при 21800хg при 4°С в течение 10 минут. Образцы среды оттаивали и из них удаляли белки добавлением метанола. Образцы центрифугировали при 21800хg при 4°С в течение 10 минут; супернатанты испаряли до сухости под вакуумом и ресуспендировали в 75 мкл 100% метанола. Три повторности по 20 мкл образцов обработанных сред или клеток оценивали с помощью ВЭЖХ с применением колонки YMC Pack Octyl C8 (Waters Inc. [Массачусетс, США]) с защитным картриджем C8. Подвижная фаза, состоящая 47% ацетонитрила/53% 25 мМ КН₂РO₄, рН 4,15, закачивалась при 0,4 мл/мин, с детектированием в УФ/видимом свете при 212 нм. Уровни RTV в клетках и среде определяли сравнением площадей пиков с таковыми для стандартной кривой свободного лекарственного средства (0,025-100 мкг/мл), полученной в метаноле.

Иммуноцитохимия и конфокальная микроскопия

Для иммунофлуоресцентной окраски клетки трижды промыли PBS и фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) при комнатной температуре в течение 30 минут. Клетки обработали блокирующим/пермеабилизирующим раствором (0,1% Triton, 5% альбумина бычьей сыворотки [BSA] в PBS) и блокировали 50 мМ NH₄Cl в течение 15 минут. Клетки однократно промыли 0,1% Triton в PBS и последовательно инкубировали с первичным и вторичным Аb при комнатной температуре. Для MDM, окрашенных несколькими Аb, неспецифичное перекрестное связывание вторичными АЬ тестировали перед иммунным окрашиванием. Избегали применения вторичных Аb, происходящих или распознающих одинаковых хозяев. Предметные стекла покрывали реактивом против выцветания ProLong Gold с DAPI и получали фотоснимки с применением 63х масляно-иммерсионного объектива в конфокальном микроскопе LSM 510 (Carl Zeiss Microimaging, Inc., Нью-Йорк, США).

Визуализация компартментов рециклирования

Макрофаги, происходящие из моноцитов, выращенные на луночных предметных стеклах, покрытых поли-d-лизином, обеднили в отношении человеческой сыворотки с помощью инкубации в бессывороточной DMEM в течение 3 часов. Клетки инкубировали вместе с 1 мкМ Alexa 594-Tfn и 100 мкМ DiO-мечеными RTV-NP в течение 4 часов. Неинтернализированные частицы удаляли с помощью трех последовательных промывок PBS. Клетки фиксировали 4% PFA и получали фотоснимки с применением 63х масляно-иммерсионного объектива конфокального микроскопа LSM 510 (Carl Zeiss Microimaging, Inc.).

Выявление подкисленных компартментов

Макрофаги, происходящие из моноцитов, подвергали воздействию pHrhodo™, конъюгированного с гранулами декстрана, и 100 мкМ DiO-меченых RTV-NP при 37°С в течение 4 часов. Неинтернализированные частицы удаляли с помощью трехкратной промывки в сбалансированном солевом растворе Хенкса, рН 7,4, с последующей фиксацией 4% PFA и визуализацией. Интенсивность флуоресценции красителя pHrhodo™ при различных уровнях рН (3,0-8,5) определили предварительно с применением флуоресцентного планшет-ридера М5 (Molecular Devices [Калифорния, США]).

Подавление поглощения RTV-NP

Макрофаги, происходящие из моноцитов, промыли трижды в PBS и инкубировали в бессывороточной среде в течение 30 минут. Затем на клетки воздействовали 100 мкМ дайносора, 100 мкМ индометацина и комбинацией обоих в течение 30 минут в бессывороточной среде или оставляли необработанными. Клетки однократно промыли бессывороточной средой, и 100 мкМ DiD-меченных RTV-NP, восстановленных бессывороточной средой, добавили вместе со свежими ингибиторами к MDM на 3 часа при 37°С. Клетки трижды промыли PBS и механически отделили с применением шпателей для клеток. Клетки фиксировали в 4% PFA в течение 30 минут и анализировали на поглощение RTV-NP с помощью проточной цитометрии. Данные получали на проточном цитометре FACSCalibur™ с применением программного обеспечения CellQuest (BD Biosciences, Калифорния, США). Повторные эксперименты проводили для ВЭЖХ-анализов на содержание лекарственного средства.

Электронная микроскопия

Образцы фиксировали 3% глутаральдегидом в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) и дополнительно фиксировали в 1% тетраоксиде осмия в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 1 часа. Образцы обезводили в серии спиртов возрастающей концентрации и заключили в Ероп 812 (Electron Microscopic Sciences [Пенсильвания, США]) для сканирующей электронной микроскопии. Тонкие срезы (80 нм) окрасили уранилацетатом и цитратом свинца и наблюдали в трансмиссионный электронный микроскоп (Hitachi H7500-I; Hitachi High Technologies America Inc. [Иллинойс, США]).

Обогащение эндоцитозных компартментов

Для обогащения RTV-NP-ассоциированных компартментов RTV-NP пометили 0,01% красителем бриллиантовый голубой R-250 (Thermo-Fisher Scientific, Массачусетс, США) в течение 12 часов при комнатной температуре. Излишек красителя удалили пятью промывками в PBS и с пятью последующими центрифугированиями при 20000хд в течение 10 минут. Затем к MDM добавили 100 мкМ RTV-NP на 12 часов при 37°С. Клетки промыли трижды в PBS, и поглощение RTV-NP визуализировали с применением светлопольных настроек на микроскопе Nikon Eclipse TE300 (Nikon Instruments, Inc. [Нью-Йорк, США]). Клетки отделили в гомогенизационный буфер (100 мМ сахарозы, 10 мМ раствор имидазола, рН 7,4), с последующими 15 движениями гомогенизатора Даунса. Остатки клеток и ядра удалили центрифугированием при 500хд в течение 10 минут. Супернатант смешали в равных отношениях с 60% сахарозой, 10 мМ раствором имидазола, рН 7,4, с доведением концентрации сахарозы до 30%, с последующим наслаиванием 60, 35, 20 и 10% градиента сахарозы и центрифугирования при 100000хg при 4°С в течение 1 часа. Границу раздела между слоями сахарозы 10-20 и 35-60%, содержащую обогащенные эндоцитозные компартменты (голубые), собрали. Осадки собрали центрифугированием при 100000хg при 4°С в течение 30 минут, и сахарозу удалили трехкратной промывкой в PBS. Затем осадки обрабатывали для протеомного анализа, описываемого ниже.

Иммунное выделение эндоцитозных компартментов проводили, как описано ранее, с некоторыми модификациями (Basyuk et al. (2003) Dev. Cell 5:161-174). MDM (400×10⁶ клеток) обрабатывали 100 мкМ RTV-NP в течение 6 часов. Клетки трижды промыли в PBS для удаления внеклеточных RTV-NP и затем соскоблили в гомогенизационный буфер (10 мМ HEPES-KOH, рН 7,2, 250 мМ сахарозы, 1 мМ EDTA и 1 мМ Мg(ОАс)₂). Затем клетки разрушили 15 движениями в гомогенизаторе Даунса. Ядра и неразрушенные клетки удалили с помощью центрифугирования при 400хg в течение 10 минут при 4°С. Парамагнитные гранулы с белком A/G (20 мкл взвеси; Millipore), конъюгированные с антителами к ЕЕА1, лизосома-ассоциированным LAMP1 и Rabll (связывание в 10% BSA в PBS в течение 12 часов при 4°С), инкубировали с супернатантами. На клеточные лизаты также воздействовали только гранулами для испытания специфичности связывания. После 24 часов инкубации при 4°С, ЕЕА1+, LAMP1+ и Rab11+ эндоцитозные компартменты промыли и собрали на магнитном сепараторе (Invitrogen). Содержание RTV-NP каждого компартмента определяли с помощью ВЭЖХ, как описано выше.

Протеомыый и масс-спектрометрический анализы

Эндоцитозные компартменты солюбилизировали в лизирующем буфере, рН 8,5 [30 мМ TrisCl, 7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% (вес./об.) 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфоната, 20 мМ дитиотериола и смесь ингибиторов протеазы IX (Sigma)], с помощью пипетирования. Белки осаждали с применением набора 2D Clean up и количественно оценивали с помощью 2D Quant (GE Healthcare [Висконсин, США]) по инструкциям производителя. Образцы прогоняли в гелях Bis-Tris 4-12% и 7% Tris-глицин (Invitrogen) для разделения низко- и высокомолекулярных белков. За электрофорезом следовала фиксация в 10% метаноле, 7% уксусной кислоте в течение 1 часа и окраска кумасси при комнатной температуре в течение 24 часов. Полоски вырезали вручную с последующим трипсиновым расщеплением в геле (10 нг/пятно трипсина [Promega, Висконсин, США]) в течение 16 часов при 37°С. Экстракцию и очистку пептидов с применением μС18 ZipTips® (Millipore, Массачусетс, США) проводили на системах для расщепления белка и получения масс-спектров Ргоргер™ (Genomic Solutions, Мичиган, США).

Экстрагированные пептиды фракционировали на микрокапиллярной колонке RP-Cis (New Objectives, Inc. [Массачусетс, США]) и их последовательности устанавливали с применением системы жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ProteomeX System с масс-спектрометром LTQ-Orbitrap, Thermo-Fisher Scientific) в конфигурации наноспрея. Выполняли поиск полученных спектров в сравнении с базой данных белков NCBI.fasta, ограниченной до подмножества человеческих белков, с применением информационно-поисковой системы SEQUEST (программное обеспечение BioWorks 3.1SR от Thermo-Fisher Scientific). Параметры поиска TurboSEQUEST® устанавливались следующим образом: граница генерирования Dta на 10000, допуск массы предшественника для генерирования Dta на 1,4, поиск Dta, допуск для пептида на 1,5 и допуск фрагментарных ионов на 1,00. Состояние заряда установили на "авто". Базу данных nr.fasta загрузили с и применили для создания 'внутренней' индексированной human.fasta.idx (ключевые слова: Homo sapiens, человек, примат). Белки с двумя или более уникальными пептидными последовательностями (р<0,05) рассматривали как в высшей степени заслуживающие доверия.

Обработка siRNA и вестерн-блоттинг

siRNA комбинировали с магнитными гранулами, и MDM трансфицировали, как указано в инструкциях производителя, а затем культивировали в течение добавочных 72 часов, чтобы достичь максимального нокдауна белка. Удаление белка подтверждали с помощью вестерн-блоттинга. Образцы белка количественно оценили с применением стандартов Pierce 660-nm Protein Assay и Pre-diluted Protein Assay BSA для калибрования кривой (Thermo Scientific [Иллинойс, США]). Из каждого образца белка 10-15 мкг загрузили и осуществили электрофорез на геле 4-12% Bis-Tris NuPAGE® Novex (Invitrogen); гель перенесли на поливинилиденфторидную мембрану (Bio-Rad Laboratories [Калифорния, США]). Мембрану блокировали 5% порошковым молоком/5% BSA в PBS-T и затем провели испытание с первичным Аb, с последующим вторичным Ab. Полоски белков различали с применением хемилюминисцентного субстрата SuperSignal® West Pico (Pierce [Иллинойс, США]). MDM, трансфицированные siRNA, затем обработали 100 мкМ RTV-NP с последующим сбором клеток и повторных образцов среды и провели анализ на лекарственное средство с помощью ВЭЖХ.

Высвобождение RTV-NP макрофагом и диссоциация на свободное лекарственное средство

Культуральную среду клеток собрали от MDM, загруженных RTVNP, через 18 часов после загрузки лекарственного средства в клетки. Интактные RTV-NP отделили от растворенного лекарственного средства центрифугированием при 100000хg на ультрацентрифуге Beckman TL-100 (Brea [Калифорния, США]) в течение 1 часа при 4°С. Образующиеся в результате супернатанты и осадки NP обработали для количественной оценки лекарственного средства с помощью ВЭЖХ.

Противоретровирусная активность RTV

Макрофаги, происходящие из моноцитов, обработали равными количествами RTV в несоставленном состоянии, растворенными в этаноле (конечная концентрация 0,01%), нативными RTVNP или высвобожденными RTV-NP в течение 12 часов и затем промыли. MDM, обработанные лекарственным средством, инфицировали HIVADA при множественности заражения 0,01 инфекционных вирусных частиц/клетку (Gendelman et al. (1988) J. Exp. Med., 167:1428-1441) на день 1 после обработки RTV-NP. После инфицирования вирусом, клетки культивировали в течение 10 дней с заменой половины среды через день. Образцы среды собрали через 10 дней после инфицирования для измерения продукции вирионов-потомков, оцениваемой по активности обратной транскриптазы (RT) (Kalter et al. (1991) J. Immunol., 146:3396-3404). Параллельные анализы на экспрессию антигена р24 HIV в инфицированных клетках провели с помощью иммунного окрашивания с применением моноклонального антитела мыши к р24 (Dako [Калифорния, США]) в тот же день, что и отбор образцов среды.

Анализ RT

В 96-луночном планшете образцы среды (10 мкл) смешали с 10 мкл раствора, содержащего 100 мМ Tris-HCl (pH 7,9), 300 мМ КС1, 10 мМ дитиотреитола, 0,1% нонил феноксилполиэтоксилэтанола-40 (NP-40) и воду. Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 15 минут и в каждую лунку добавили 25 мкл раствора, содержащего 50 мМ Tris-HCl (pH 7,9), 150 мМ КСl, 5 мМ дитиотреитола, 15 мМ MgCl₂, 0,05% NP-40, 10 мкг/мл поли(А), 0,250 Ед./мл олиго d(Т)12-18 и 10 мкКи/мл тимидинтрифосфата, меченного тритием; планшеты инкубировали при 37°С в течение 18 часов. После инкубации в каждую лунку добавили 50 мкл холодной 10% ТСА; содержимое лунок собрали на стекловолоконные фильтры и их оценивали в отношении включения тимидинтрифосфата, меченного тритием, с помощью р-сцинтилляционной спектроскопии с применением TopCount NXT™ (PerkinElmer Inc. [Массачусетс,США]) (Kalter et al. (1991) J. Immunol., 146:3396-3404).

Иммуногистохимия и количественная оценка р24-окрашивания HIV-1

Всего через 10 дней после инфицирования HIV-1 клетки фиксировали 4% PFA, забуференным фосфатным буфером, в течение 15 минут при комнатной температуре. Фиксированные клетки блокировали 10% BSA в PBS, содержащем 1% Triton Х-100, в течение 30 минут при комнатной температуре и инкубировали с моноклональными антителами мыши к р24 HIV-1 (1:100, Dako) в течение 3 часов при комнатной температуре. Связывание р24 Аb выявляли с применением системы Dako KnVision™+ HRP-меченный полимер вторичное Аb к мыши и окраской диаминобензидином. Клеточные ядра перекрашивали гематоксилином в течение 60 секунд. Фотоснимки получали с применением микроскопа Nikon TE300 с 40х объективом. Количественную оценку иммунного окрашивания осуществляли денситометрией с применением Image-Pro Plus, v.4.0 (Media Cybernetics Inc. [Мэриленд, США]). Экспрессию р24 количественно оценили путем определения положительной площади (показатель) в виде процентной доли общей площади фотоснимка на микроскопическое поле.

Статистические анализы

Количественную оценку иммунного окрашивания проводили с помощью программного обеспечения ImageJ, используя дополнительные модули JACoP (rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) для вычисления коэффициентов колокализации Пирсона. Сравнение проводили на трех-пяти наборах фотоснимков, полученных при одинаковых оптических настройках. Графики и статистические анализы получали с применением программного обеспечения Excel и Prism (GraphPad Software, Inc. [Калифорния, CILIA]). Значимые отличия в уровнях лекарственного средства в исследованиях поглощения и высвобождения определяли с помощью двухфакторного ANOVA, с последующим тестом множественного сравнения Бонферрони. Значимые отличия в активности RT, плотности р24 и содержании лекарственного средства в экспериментах с siRNA определяли с помощью однофакторного ANOVA, с последующим тестом множественного сравнения Дуннета. Двусторонние t-тесты Стьюдента применяли для всех остальных данных, и, если не указано иное, «усы» показывают ±стандартную ошибку среднего (SEM). Результаты считались значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение характеристик и in vitro фармакокинетика RTV-NP

NP ритонавира представляли собой типичный состав nanoART и, в силу этого, применялись для анализов локализации частиц в клетке и высвобождения. RTV-NP состояли из кристаллов лекарственного средства из RTV в форме свободного основания, покрытых тонким слоем фосфолипидных поверхностно-активных веществ тРЕС₂₀₀₀-DSРЕ, Р188 и DOTAP. Физические свойства (размер, форма и дзета-потенциал) частиц показаны на фигуре 8А. Р188 и mPEG₂₀₀₀-DSPE увеличивали стабильность частицы, тогда как оболочка из DOTAP наделяла положительным зарядом поверхности. Индекс полидисперсности составил 0,196, что указывает на то, что хотя большинство RTV-NP имели рассчитанный средний измеренный размер, вся популяция частиц была гетерогенной. Следует отметить, что только Р188, P188/mPEG₂₀₀₀-DSPE или P188/mPEG₂₀₀₀-DSPE-DOTAP не влияли на поглощение RTV-NP клеткой. Сканирующая электронная микроскопия обнаружила гладкую палочковидную морфологию RTV-NP и подтвердила измерения и распределение размеров (фигура 8В).

Оценили основанную на клетках фармакокинетику поглощения и высвобождения RTV-NP в MDM. На клетки воздействовали 100 мкМ RTV-NP в DMEM и оценивали с помощью ВЭЖХ поглощение лекарственного средства. Эту концентрацию лекарственного средства выбрали, исходя из предварительных наблюдений, которые продемонстрировали, что она имела ограниченную клеточную токсичность и сильную противоретровирусную эффективность, при анализе посредством анализа с (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом, желтый тетразол) и активности RT, соответственно. Интернализацию RTV-NP в MDM наблюдали в 30 минут, и пика она достигала к 4 часам (фигура 8С). Интернализованные частицы обнаруживали в MDM вплоть до 15 дня (фигура 8D). Для анализа механизма попадания RTV-NP в макрофаги применяли химические блокаторы, чтобы ингибировать попадание в клетку, опосредованное клатрином и кавеолами. После предварительной обработки 100 мкМ дайносора (препятствует образованию ямки, покрытой клатрином, посредством ингибирования динамина) или индометацина (ингибитор кавеол) в течение 1 часа на MDM воздействовали флуоресцентными RTV-NP. Проточная цитометрия и ВЭЖХ-анализы продемонстрировали, что интернализация RTV-NP происходит через ямки, окаймленные клатрином (фигуры 8Е и 8F).

Протеомний анализ идентифицирует эндоцитозыые компартменты, содержащие RTV-NP

Визуализация MDM, нагруженных RTV-NP, с помощью трансмиссионной электронной микроскопии подтвердила поглощение интактных частиц в обособленные цитоплазматические везикулы (фигура 9А). Затем исследовали внутриклеточное распределение RTV-NP внутри MDM. RTV-NP пометили красителем бриллиантовый голубой R-250 и добавили к MDM на 12 часов. MDM разрушили механически и эндоцитозные компартменты, содержащие RTV-NP (голубые), собрали как голубые полоски в градиенте сахарозы (фигура 9В). Масс-спектрометрические анализы фракций идентифицировали 38 белков, ассоциированных с обособленными эндосомальными популяциями (фигуры 10). На основании их постулируемой внутриклеточной локализации белки классифицировали на белки ямок, окаймленных клатрином, ранних эндосом (ЕЕ), рециркулирующих эндосом (RE), мультивезикулярных телец, поздних эндосом (LE) и лизосом (L). Белки были распределены преимущественно в ранних и рециркулирующих эндоцитозных компартментах клетки (ЕЕ [24%] и RE [22%]) (фигура 9С). Эти данные указывают на роль рециркулирующих компартментов во внутриклеточной сортировке RTV-NP.

Конфокальная микроскопия внутриклеточного распределения RTV-NP

Для дополнительных подкрепленных доказательствами результатов протеомных исследований проводили конфокальную микроскопию, чтобы визуализировать и количественно оценить внутриклеточное распределение RTV-NP в ранних (ЕЕА1), рециркулирующих (Rab8, 11, 14) и деградирующих эндоцитозных компартментах (поздние деградирующие эндосомы [Rab7]) и L (LAMP1). MDM обработали RTV-NP, меченными флуоресцентной меткой либо DiD, либо DiO, в течение 12 часов и затем произвели иммунное окрашивание на эндоцитозные компартменты, идентифицированные с помощью протеомного анализа (фигура 11). Конфокальная визуализация показала точечный паттерн распределения NP на всем протяжении цитоплазмы и перинуклеарной области, при этом они локализуются преимущественно совместно с ЕЕ и RE (фигура 11А-Н). Количественная оценка перекрывания флуорофоров с применением тестов колокализации Пирсона показала значимое накопление (р<0,001) RTV-NP в ЕЕА1+ (9,5±0,4% [среднее ± SEM]; n=41) ранних эндосомах и Rab8+ (12,8±0,2%; n=56), Rab11+ (31,0±0,6%; n=33) и Rab14+ (22,8±0,5%; n=189) RE по сравнению с деградирующими компартментами, такими как Rab7 LE (4,1±0,4%; n=47) и L (5,0±0,9%; n=28; фигура 11G). Эти данные указывают, что частицы в человеческих MDM скорее подвергаются эндоцитозной рециркуляции, чем деградации.

Нарушение эндоцитозной рециркуляции с помощью siRNA и брефелдина А блокирует высвобождение RTV-NP

Для подтверждения пути рециркуляции для направленного перемещения RTV-NP, Rab8, 11 и 14 супрессировали посредством siRNA. MDM, на которые воздействовали siRNA и DiD-меченными RTV-NP, анализировали с помощью конфокальной микроскопии относительного распределения в клетке и с помощью ВЭЖХ относительно удержания (клеточные лизаты) и высвобождения (культуральная среда) лекарственного средства. Вестерн-блоттинги с применением необработанных MDM и тех, на которые воздействовали либо скремблированной, либо целевой siRNA подтвердили сайленсинг Rab белков (фигура 12С). Конфокальная микроскопия обнаружила, что в MDM, обработанных siRNA, распределение RTV-NP было значительно изменено по сравнению с необработанными MDM или MDM, обработанными скремблированными последовательностями (фигуры 11 и 12А). Обработанные клетки демонстрировали уменьшенное совместное распределение Rab8, 11 и 14 с RTV-NP, утрату точечного распределения в цитоплазме и скопление частиц рядом с ядром (фигура 12А). ВЭЖХ-анализы указывали, что клетки, обработанные siRNA к Rab11 и Rab14, удерживали больше лекарственного средства (фигура 12D) и высвобождали меньше лекарственного средства (фигура 12Е) в среду, чем необработанные MDM, MDM, обработанные скремблированной siRNA и siRNA к Rab8. Обработка брефелдином A (BFA; дезинтегратор рециркуляции и секреторной активности) давала подобные результаты, что приводило к скоплению RTV-NP в перинуклеарной области (фигура 12В). ВЭЖХ-анализы показали, что MDM, обработанные BFA, сохраняли больше лекарственного средства и высвобождали меньше лекарственного средства, чем необработанные клетки и клетки, обработанные скремблированной siRNA (фигура 12D и 12Е). Следовательно, значительно меньше RTV-NP обнаруживали в культуральной среде клеток, обработанных BFA. Вместе эти данные демонстрируют пути эндоцитозной рециркуляции как для внутриклеточного направленного перемещения, так и для высвобождения RTV-NP.

Перемещение интактных RTV-NP между эндоцитозными компартментами

Минимальное распределение RTV-NP в поздних деградирующих эндосомах и L приводит нас к вопросу, действительно ли лекарственное средство избегает путей деградации. Поскольку только поверхностно-активные вещества (а не кристаллы лекарственного средства) были помечены флуоресцентной меткой с помощью липофильных красителей DiD и DiO, исследовалось, перемещалась ли частица интактной. Клетки, на которые воздействовали RTV-NP, разрушали механически и ЕЕ, RE и L изолировали иммунным способом с применением парамагнитных гранул с белком A/G, конъюгированных с ЕЕА1, Rab11 и LAMP1 (фигура 13А). Эндоцитозные компартменты, связавшиеся с гранулами, собрали с помощью разделения в магнитном поле, сделали цифровые фотоснимки и затем анализировали с помощью ВЭЖХ на содержание лекарственного средства (фигура 13А). Что интересно, тонкий слой лекарственного средства (белый), покрывающий осадок гранул (коричневый), был легко различим на Rab11-эндосомах, выделенных иммунным способом, но не в других компартментах (фигура 13В). Согласно с конфокальными тестами совместной локализации, ВЭЖХ-анализ подтвердил присутствие лекарственных средств в Rab11-эндосомах и, что более важно, в значительно больших количествах по сравнению с ЕЕА1- или LAMP1-ассоциированными везикулами (фигура 13С). Эти результаты указывают, что части RTV-NP полимерная оболочка и кристалл лекарственного средства действительно подвергаются одинаковым путям сортировки (рециркуляции). Для определения того, сохраняются ли RTV-NP во время эндоцитозного направленного перемещения и высвобождаются ли интактными, RTV-NP, собранные из культуральных жидкостей через 24 часа после поглощения, фотографировали в дополнение к измерению содержания лекарственного средства. Чтобы избежать сбора исходных RTV-NP, MDM подвергали воздействию DiD-меченных RTV-NP в течение 12 часов, тщательно промывали (пять раз в 1 мл PBS), делали фотоснимки посредством флуоресцентной микроскопии, чтобы подтвердить присутствие только внутриклеточных частиц, и затем обеспечивали высвобождение лекарственного средства в течение 24 часов после поглощения. Фотоснимки с помощью сканирующей электронной микроскопии показывают, что высвобожденные RTV-NP являются интактными (фигура 14В) и показывают такие же размер и форму, как исходные частицы (фигура 14А). Однако высвобожденные частицы показывали шероховатые края и высвобождались в виде скоплений (фигура 14В), в отличие от нативных частиц, которые имели гладкие края и все были отдельно обособлены (фигура 14А). Поскольку высвобожденные RTV-NP идентифицировали в культуральных жидкостях клеток, определяли относительное количество лекарственного средства, присутствовавшего в форме частиц, по сравнению с растворенным свободным лекарственным средством. RTV в форме частиц отделили от растворенного RTV с помощью ультрацентрифугирования и определяли количественно с помощью ВЭЖХ. Как показано на фигуре 14С, из общего количества RTV, 32% растворено в культуральной среде, тогда как 68% присутствовали как интактные NP. Эти данные указывают, что большая часть лекарственного средства высвобождается из клетки в форме частиц.

Минимальное распределение вместе с подкисленными (деградирующими) компартментами, в соответствии с мечением с помощью конъюгированного с декстраном рН-чувствительного красителя (флуоресцирует ярко-красным при рН<5.5), позволяет предположить, что умеренная рН среда RE может сохранять целостность RTV-NP (фигура 11G). Кроме того, существенное перекрывание RTV-NP с Тfn+ - компартментами указывает, что быстрая рециркуляция к плазматической мембране может также вносить вклад в сохранение интактных частиц (фигура НЕ). Эти результаты указывают, что физические свойства и морфология RTV-NP не затрагиваются во время направленного перемещения внутри макрофага.

RTV-NP сохраняют противоретровирусную активность после высвобождения из клетки

Чтобы протестировать, сохранялась ли противоретровирусная активность после высвобождения частицы, на MDM воздействовали равными концентрациями нативных RTV-NP, высвобожденных RTV-NP и свободного лекарственного средства, за чем следовало заражение HIV-инфекцией. Противоретровирусные эффекты измеряли с помощью экспрессии р24 HIV и активности RT. Предварительная обработка свободными RTV не обеспечила защиту от инфицирования, тогда как нативные RTV-NP, так и высвобожденные RTV-NP были одинаково способны значимо (р<0.01) супрессировать репликацию HIV (р24-окрашивание) и образование многоядерных гигантских клеток (фигура 14D и 14F). Активность обратной транскриптазы значимо сдерживалась в MDM, на которые воздействовали исходными и высвобожденными RTV-NP, по сравнению с необработанными клетками и такими, на которые воздействовали свободным лекарственным средством (фигура 14Е). Эти результаты исследований демонстрируют, что эндоцитозная сортировка не затрагивала противоретровирусную эффективность RTV-NP и предполагает высокий потенциал макрофага как эффективного переносчика для доставки частицы, загруженной лекарственным средством.

Пересоставление лекарственных средств ART в нанокристаллы для транспорта с помощью мононуклеарных фагоцитов (МР; моноциты и тканевые макрофаги) улучшает клиническую эффективность лекарственного средства. Действительно, приспособление МР в качестве переносчиков для доставки лекарственного средства в убежища HIV, защищенные биологическими барьерами, служит как для упрощения схем дозирования лекарственного средства, так и для улучшения их терапевтического индекса. Лекарственные препараты ART нерастворимы в воде и, таким образом, могут образовывать стабильные кристаллы в водных растворах. В силу их фагоцитарной и мигрирующей функций МР могут легко захватывать чужеродный материал и переходить в области микробной инфекции и воспаления. Будучи загруженными NP лекарственного средства, эти клетки доставляют лекарственное(ые) средство(а) в места действия, которые иначе были бы недоступны из-за наличия либо физических, либо биохимических барьеров. МР являются идеальными кандидатами для транспорта nanoART, поскольку эти клетки являются целями для HIV и могут действовать в качестве как резервуаров вируса, так и переносчиков. Примечательно, что составы с наночастицами были разработаны для химиотерапии рака и для ряда микробных инфекций (например, Biyth et al. (2010) Cochrane Database Syst. Rev.2:CD006343; Chu et al. (2009) Curr. Med. Res. Opin., 25 25:3011-3020; Pagano et al. (2010) Blood Rev.24:51-61; Destache et al. (2009) BMC Infect. Dis., 9:198; Destache et al. (2010) J. Antimicrob. Chemother., 65:2183-2187; Beduneau et al. (2009) PLoS ONE 4:e4343; Brynskikh et al. (2010) Nanomed., 5:379-396; Gorantia et al. (2006) J. Leukoc. Biol., 80:1165-1174; Liu et al. (2008) J. Neurо immune 1., 200:41-52). Кроме того, идея, что мигрирующую функцию МР можно приспособить для терапевтической пользы, имеет практический смысл, поскольку эти самые клетки представляют собой цели и носители вируса, показывают устойчивые фагоцитарные возможности и легко мигрируют в участки непрерывного вирусного роста и воспаления. Примечательно, что взаимодействие между nanoART и макрофагами является важным, если необходимо достигнуть терапевтической трансляции. Что интересно, большинство RTV-NP содержались внутри компартментов, что обеспечивает защищенную среду и дает частицам возможность высвобождаться интактными с сохраненной противоретровирусной активностью. Что важно, эндоцитозные компартменты RTV-NP зеркально отражают таковые, используемые в жизненном цикле HIV. Эти результаты убедительно указывают, что опосредованная клетками доставка активного лекарственного средства является эффективной.

На основании ограниченной цитотоксичности можно реализовать устойчивые высокие уровни противоретровирусного лекарственного средства в целевых для вируса тканях (в том числе лимфоидной системе и ЦНС), как это наблюдается при переносах адоптивных клеток. Для широкого применения в клинике синтез nanoART нужно будет увеличивать. Методики, такие как осаждение, гомогенизация и мокрый размол можно применять для получения nanoART с подходящими физической и химической стабильностью для достаточной загрузки лекарственным средством, подходящей осмолярности, вязкости и стерильности (Магге et al. (2010) Chem. Soc. Rev., 39:1183-1202; Muchow et al. (2008) Drug Dev. Ind. Pharm., 34:1394-1405; Takatsuka et al. (2009) Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 57:1061-1067).

В данном документе, демонстрируется, что NP преимущественно попадают в макрофаги через клатрин-опосредованный путь (Kumari et al. (2010) Cell Res. 20:256-275). Внутриклеточное распределение NP наблюдали в рециркулирующих эндосомальных компартментах. В действительности, иммуноцитохимические исследования колокализации продемонстрировали, что значительно больше RTV-NP было в RE, в частности, внутри Rab11+ - везикул, чем в остальных компартментах. Паттерн внутриклеточного распределения RTV-NP концентрировался в перинуклеарной области, что дополнительно подтверждает их локализацию в RE (Hattula et al. (2006) J. Cell Sci., 119:4866-4877; Junutula et al. (2004) Mol. Biol. Cell, 15:2218-2229; Lombard! et al. (1993) EMBO J. 12:677-682; Seaman, M.N. (2008) Cell Mol. Life Sci., 65:2842-2858). Хотя присутствие RTV-NP также наблюдали в LE; и L, из-за ограниченного перекрывания частиц с подкисленными везикулами, вероятно, что частицы, которые содержались внутри LE и L, не подвергались деградации, а перенаправлялись в рециркулирующие компартменты. Например, Rab9, который идентифицировали с помощью протеомного анализа, вовлекается в ретроградный транспорт LE, которые в конечном счете сливаются с сетью транс-Гольджи и упаковываются в RE (Barbero et al. (2002) J. Cell Biol., 156:511-518; Bonifacino et al. (2006) Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 7:568-579). Эти результаты позволили предположить, что RTV-NP избегали внутриклеточной деградации и преимущественно подвергались хранению внутри рециркулирующих компартментов для потенциального высвобождения на поверхности клетки. Функциональные исследования продемонстрировали, что удаление белков, причастных к направленному перемещению RE, ингибировало высвобождение лекарственного средства из клеток, содержащих RTV-NP. В частности, Rabll, маркер внутриклеточной рециркуляции (Hoekstra et al. (2004) J. Cell Sci., 117:2183-2192; Hsu et al. (2010) Curr. Opin. Cell Biol., 22:528-534; Jing et al. (2009) Histol. Histopathol. 24:1171-1180; Jones et al. (2006) Curr. Opin. Cell Biol. 18:549-557; Maxfield et al. (2004) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5:121-132; Sonnichsen et al. (2000) J. Cell Biol. 149:901-914; Zerial et al. (2001) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2:107-30 117), вероятно, облегчает как направленное перемещение, так и высвобождение частиц. Существуют два основных типа эндосомальной рециркуляция:

медленное и быстрое. Rab11 вместе с Rab9, каждый из которых идентифицирован в ходе протеомных анализов, как было установлено являются белками, которые принимают участие в медленной рециркуляции (Cayouette et al. (2010) Biochim. Biophys. Acta 1803:805-812; Sheff et al. (1999) J. Cell Biol. 145:123-139; Ullrich et al. (1996) J. Cell Biol. 135:913-924; van der Sluijs et al. (1992) EMBO J. 11:4379-4389). Кроме того, было показано, что Rabll играет роль в экзоцитозе тем, что он может контролировать прохождение материала из комплекса Гольджи через эндосомы и, наконец, к поверхности клетки, известное как медленная рециркуляция, в противоположность Rab8 и 14, которые управляют транзитом из комплекса Гольджи непосредственно к поверхности клетки, известным как быстрая рециркуляция (Chen et al. (2001) Methods Enzymol. 329:165-175; Larance et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:37803-37813). Этим можно объяснить различия, заметные в функциональных следствиях удаления белков Rab. Во всех случаях, удаление белков рециркуляции Rab, приводило к тому, что RTV-NP перераспределялись очень плотно возле ядра, что предполагает, что все эти белки вовлечены в направленное перемещение частиц. Однако удаление Rab8 не подавляло высвобождение лекарственного средства и удаление Rab14 только слегка снижало его. С другой стороны, удаление Rab11 имело очень значительный ингибиторный эффект, что предполагает, что хотя некоторые частицы могут высвобождаться быстро, первичный механизм, вероятно, включает медленную рециркуляцию к плазматической мембране посредством Rab11+ - везикул. Следует отметить, что Rabll был вовлечен в быструю рециркуляцию Tfn (Сох et al. (2000) Proc. Nati Acad. Sci. 97:680-685) и наблюдали заметное количество совместной локализации частиц с Tfn. Вероятно, быстрая рециркуляция RTV-NP происходила, так как удаление Rabll не полностью подавляло высвобождение лекарственного средства; однако, поскольку RTV-NP сохранялись в MDM на протяжении 2 недель, наиболее вероятно, что большинство частиц действительно рециркулируют медленно. Не связываясь с теорией, предложенный путь для внутриклеточного направленного перемещения RTV-NP от поглощения до высвобождения показан на фигуре 15. И наконец, известно, что Rab11 привлекает комплексы моторных белков как. на основе актина, так и на основе микротрубочек, которые транспортируют везикулы по нитям цитоскелета (Jordens et al. (2005) Traffic 6:1070-1077). Многие из этих белков также были идентифицированы в ходе протеомных анализов.

Вместе, эти данные вскрывают путь, в котором RTV-NP избегают внутриклеточной деградации и рециркулируют к плазматической мембране. Это продемонстрировали посредством визуальной идентификации интактных RTV-NP, которые были высвобождены из MDM, нагруженных частицами. Дополнительно продемонстрировано, что эти высвобожденные частицы сохраняли полную противоретровирусную активность. В связи с этим, MDM поглощают, удерживают, транспортируют и высвобождают интактные RTV-NP, которые подавляют репликацию HIV, что указывает на то, что макрофаги могут действовать как настоящие 'троянские кони' для nanoART, доставляя активное лекарственное(ые) средство(а) в места вирусной инфекции. Во-вторых, оказывается, что RTV-NP могут подавлять репликацию вируса путем внутриклеточного механизма, поскольку малое количество RTV-NP было способно полностью супрессировать репликацию вируса, тогда как эквивалентное количество свободного лекарственного средства не имело эффекта. Этот аспект взаимодействий NP-макрофаг поддерживает идею, что RTV-NP, подобно HIV, попадают в макрофаги через ямки, окаймленные клатрином (Vendeville eb al. (2004) Mol. Biol. Cell 15:2347-2360). Кроме того, значительная часть жизненного цикла вирусов проходит внутри RE (Murray et al. (2005) J. Virol. 79:11742-11751; Varthakavi et al. (2006) Traffic 7:298-307). Вместе, эти результаты исследований указывают на то, что RTV-NP могут не только попадать в клетку вместе с HIV, но также имеют одинаковые внутриклеточные места назначения что, таким образом, делает возможным нацеливание лекарственного средства на специфичные внутриклеточные компартменты. Это обеспечивает убедительное обоснование, почему nanoART, в широком смысле, могут иметь сильные противоретровирусные эффекты даже при очень низких внутриклеточных концентрациях. Прямое подавление репликации HIV на внутриклеточном уровне может, следовательно, увеличивать терапевтический индекс ART, таким образом, снижая количество лекарственного средства, необходимого для подавления репликации вируса.

ПРИМЕР 3

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Материалы и приборы

Полоксамер 188 (Р188; Pluronic® F68), полоксамер 407 (Р407; Pluronic® F-127) и фолиевую кислоту получили от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). N-гидроксисукцинимид, N,N'-дициклогексилкарбодиимид и триэтиламин приобрели у Acros Organics (Моррис Плейнс, Нью-Джерси). LH-20 получили от GE Healthcare (Пискатауэй, Нью-Джерси). Сульфат ATV приобрели у Gyma Laboratories из America Inc. (Вестбери, Нью-Йорк) и затем превратили в свободное основание с помощью экстракции триэтиламином. Все остальные реактивы и растворители, если не указано, приобрели у Fisher Scientific (Питтсбург, Пенсильвания) или Acros. ¹H и спектры фиксировали на ЯМР-спектрометре 500 МГц (Varian, Пало-Альто, Калифорния). Наносуспензии атазанавира получали либо с помощью мельницы для мокрого размола NETZSCH MicroSeries (NETZSCH Premier Technologies, LLC., Экстон, Пенсильвания), либо с помощью гомогенизатора высокого давления Avestin.

Синтез Р188 (FA-P188) и Р407 (FA-P407) с концевым фолатом

Синтез Р188 с концевым п-толуолсульфонилом (Tos-P188, 2). Р188 (8,4 г, 1 ммоль) обезводили с помощью совместного выпаривания с толуолом (3×50 мл) и затем растворили под аргоном в 20 мл безводного DCM вместе с DMAP (61 мг, 0,5 ммоль) и TEA (1,01 г, 10 ммоль). Реакционную смесь охладили до 0°С и добавили п-толуолсульфонила хлорид (1,9 г, 10 ммоль). После осуществления реакции в течение ночи при комнатной температуре смесь профильтровали, концентрировали и осадили в эфире. Затем сырой продукт экстрагировали DCM/рассолом, органический слой высушили над безводным сульфидом магния и затем концентрировали под пониженным давлением. Затем растворитель осадили в эфире с получением сырого продукта. Аналитически чистый продукт получали при дополнительной очистке с помощью колонки LH 20. Выход: 6,8 г. ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ (ppm) 7,78 (d, J=7,32 Гц), 7,48 (d, J=7,32 Гц), 4,11 (t, J=4,39 Гц), 3,64-3,37 (m), 1,04 (d, J=3,90 Гц).

Синтез Р188 с концевым азидом (азидо-Р188, 3). Tos-P188 (5,22 г, 0,6 ммоль) растворили в 20 мл DMF и затем добавили азид натрия (0,39 г, 6 ммоль). Реакцию проводили при перемешивании при 100°С в течение 2 дней. После фильтрации растворитель удалили под вакуумом. Сырой продукт растворили в дихлоридметане (20 мл) и экстрагировали рассолом(3×15 мл). Органический слой высушили над безводным сульфидом магния. После удаления органического растворителя сырой продукт дополнительно очистили с помощью колонки LH 20 с получением аналитически чистого продукта. Выход: 4,5 г. ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ (ppm) 3,65 (t, J-4,39 Гц), 3,61-3,38 (m), 1,04 (d/ J=3,90 Гц).

Синтез Р188 с концевым амином (амин-Р188, 4). N3-P188 (1,26 г, 0,15 ммоль) и 10 мг Pd/C (10% вес.) перемешивали в 10 мл абсолютного МеОН при комнатной температуре в течение 72 часов, в круглодонной колбе, в атмосфере Н₂. Реакционную смесь профильтровали через фильтровальную бумагу для отделения Pd/C и растворитель выпарили. Дополнительную очистку продукта провели с помощью осаждения из смеси дихлорметана/эфира при 0°С. Продукт профильтровали и высушили в вакууме с получением твердого вещества. Выход: 0,9 г. ¹Н ЯМР (DMSO- d₆) δ (ppm) 2,65 (t, J=4,39 Гц), 3,64-3,43 (m), 1,03 (d, J=3,90 Гц).

Синтез активного сложного эфира фолиевой кислоты (фолат-NHS, 6). 0,5 г фолиевой кислоты растворили в 10 мл DMSO с добавлением 0,25 мл триэтиламина. Добавили NHS (0,13 г) и DCC (0,23 г) с молярным отношением 1,1. Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в темноте. Побочный продукт, дициклогексилмочевину, удалили с помощью фильтрации. NHS-фолат, который находился в фильтрате, осадили диэтиловым эфиром и хранили в виде желтого порошка после нескольких промывок безводным эфиром и высушивания. Выход: 0,4 г. ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ (ppm) 8,66 (s, 1H), 8,16 (d, J=6,8 Гц, 1Н), 7,65 (d, J=7,80 Гц, 2H), 6,93 (t, J=5,85 Гц, 1H), 6,64 (d, J=7,80 Гц, 2H), 4,50 (d, J=5,85 Гц, 2H), 4,23 (m/ 1H), 2,83 (s/ 4H), 2,31 ((t, J=6,83 Гц, 2H)), 2,03 [т, 1H), 1,93 (m, 1H).

Синтез Р188 с концевым фолатом (FA-P188, 7). Амин-Р188 (0,84 г, 0,1 ммоль) растворили в 10 мл DMSO, в этот раствор медленно добавили фолат-NHS (322 мг, 0,6 ммоль) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение ночи в темноте. Сырой продукт осадили в эфир и дополнительно очистили с помощью колонки LH 20. Выход: 0,6 г. ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ (ppm) 8,66 (s), 7, 65 (d, J=8,78 Гц), 6, 92 (t, J=4,88 Гц), 6, 64 (d, J=8,78 Гц), 4,48 (d, J=5,37 Гц), 4,28 (m), 3,65 (t, J=4,39 Гц), 3,60-3,41 (m), 2,18 (b), 2,08-1,89 (m), 1,04 (d, J=5,85 Гц).

С применением процедур, аналогичных описанным выше, синтезировали дополнительный FA-P188 и Р407 с концевым фолатом (FA-P407) для настоящего исследования.

Получение и определение характеристик наносуспензий атазанавира с фолатом (FA-P188-ATV и FA-P407-ATV)

Для получения наносуспензий атазанавира с фолатом применяли следующие комбинации поверхностно-активных веществ: (1) только 0,5% Р188; (2) 0,05% FA-P188 и 0,45% Р188; (3) 0,1% FA-P188 и 0,4% Р188; (4) 0,15% FA-P188 и 0,35% Р188; (5) только 0,5% Р407; (6) 0,025% FA-P407 и 0,475% Р407; (7) 0,1% FA-P407 и 0,4% Р407; (8) 0,2% FA-P407 и 0,3% Р407, которые отдельно суспендировали в 10 мМ буферном растворе HEPES (рН 7,8). Затем в растворы поверхностно-активного вещества добавили ATV в форме свободного основания (1% по весу). Суспензии взбалтывали до гомогенных дисперсий с применением роторно-статорной мешалки Ultra-turrax® T-18. Для получения наносуспензий с помощью мокрого размола суспензию перенесли в мельницу для мокрого размола NETZSCH MicroSeries (NETZSCH Premier Technologies, LLC, Экстон, Пенсильвания) вместе с 50 мл 0,8 мм мелющего тела (керамические гранулы оксида циркония) и перемалывали от 30 минут до 1 часа при скоростях в диапазоне от 600 до 4320 оборотов в минуту с получением наносуспензий ATV с требуемым размером частиц. Для получения наносуспензий с помощью гомогенизации суспензию переместили в гомогенизатор высокого давления Avestin C5 и гомогенизировали при 20000 футах на квадратный дюйм в течение приблизительно 30 проходов или пока не достигался требуемый размер частиц. Размер частиц, полидисперсность и поверхностный заряд анализировали на Malvern Nano-Zetasizer (Malvern Instruments Inc., Уэстборо, Массачусетс). После достижения требуемого размера частиц образцы центрифугировали при 1000хg в течение 30 минут при 4°С. Образовавшийся в результате осадок дважды промыли 0,925% сахарозой и 0,5% раствором полимера и затем ресуспендировали в соответствующих растворах поверхностно-активного вещества, вместе с 0,925% сахарозой для регуляции тоничности исходя из состояния после гомогенизации. Концентрацию ATV в наносуспензиях определяли с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Поглощение, удержание и высвобождение наносуспензии FA-ATV в MDM

После 7 дней дифференциации макрофаги, происходящие из моноцитов (MDM), активировали 0 и 50 нг/мл LPS в течение 24 часов. Затем часть этих активированных MDM и неактивированных MDM обработали 100 мкМ FA-P188-ATV, содержащих 0%, 10% и 30% FA-P188. Другую часть этих MDM вначале обработали фолиевой кислотой и затем обработали 100 мкМ FA-P188-ATV, содержащих 0%, 10% и 30% FA-P188. Поглощение FA-P188-ATV оценивали в различные моменты времени без замены среды в течение 8 часов. Прикрепленные MDM промыли фосфатно-солевым буфером (PBS) и собрали посредством соскабливания в PBS. Клетки осадили центрифугированием при 950хg в течение 10 минут при 4°С. Осадки клеток кратковременно обработали ультразвуком в 200 мкл метанола и центрифугировали при 20000хg в течение 10 минут при 4°С. Метанольный экстракт хранили при -80°С до проведения ВЭЖХ-анализа (фигура 17). Поглощение FA-P407-ATV с помощью MDM оценивали с применением тех же способов, что и для FA-P188-ATV.

Противоретровирусная активность наносуспензии FA-ATV

MDM обработали 100 мкМ наносуспензии ATV в течение 8 часов, промыли для удаления излишка лекарственного средства и инфицировали HIV-1_ADA при множественности заражения 0,01 инфекционных вирусных частиц/клетку в дни 10 и 15 после обработки наносуспензиями ATV. После инфицирования вирусом клетки культивировали в течение десяти дней с заменой половины среды через день. Образцы среды собрали на день 10 для измерения продукции вирионов-потомков, оцениваемой с помощью активности обратной транскриптазы (RT). Параллельные анализы на экспрессию антигена р24 HIV-1 инфицированными клетками проводили с помощью иммунного окрашивания.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Синтез фолат-полоксамеров

Полоксамеры, декорированные фолатом, разработали и синтезировали с помощью следующих этапов для адресной доставки противоретровирусных средств в места HIV-инфекции (фигура 16). Коротко, после активации полоксамеров (Р188 и Р407, 1) избытком п-толуолсульфонила хлорида, тозилированный продукт (2) превратили в азидо-полоксамеры (3) путем проведения реакции с избытком азида натрия в DMF при 100°С в течение ночи, которые затем восстановили до амино-полоксамеров (4) с помощью трифенилфосфина. Наконец, фолиевую кислоту (5) активировали DCC/NHS, провели реакцию образовавшегося в результате активного сложного эфира (6) с амино-полоксамерами с получением требуемых фолат-полоксамеров (FA-P188 и FA-P407, 7). После очистки с помощью колонки LH-20 получали чистые FA-P188 и FA-P407 (приблизительно 2,5 г) для исследования поглощения, удержания, высвобождения у MDM и противоретровирусных исследований.

Составы с наночастицами, применяемые в данном исследовании, имели аналогичные размер, заряд и форму. Размер частицы находился в диапазоне от 281 нм для P188-ATV, полученных гомогенизацией (Н3001), до 440 нм для FA-P407-ATV, полученных с 5% FA-P407/95% P407 (Н3024) в качестве поверхностно-активных веществ (таблица 3). Все частицы были отрицательно заряженными. Составом с самым высоким зарядом был P188-ATV, полученный гомогенизацией (Н3001), и наименее отрицательно заряженным был состав, содержащий 20% FA-PISS/80% Р188 (Н3016). Все частицы были удлиненными палочкообразными (фиг.17) независимо от фолатной модификации полимера.

Обозначение состава Поверхностно-активное вещество^a Размер (нм)^b PDI^c Дзета-потенциал (мB)^d Н3001 Р188 314 0,2 -31,6 М3001 Р188 281 0,288 -15,31 Н3016 20%FA-P188/80% P188 385,9 0,242 -4,6 М3016 20%FA-P188/80% P188 332,1 0,195 -19,6 М3017 10%FA-P188/90% P188 372,0 0,225 -20,1 М3018 30%FA-P188/70% P188 379,0 0,185 -19,8 Н3019 P407 382,7 0,209 -10,1 Н3020 40% FA-P407/60% P407 364,8 0,207 -24,6 Н3022 20% FA-P407/80% P407 416,8 0,318 -11,5 Н3024 5% FA-P407/95% P407 440,3 0,318 -17,1

Таблица 3: Физико-химические характеристики составов с наночастицами атазанавира.

^а Сокращения, применяемые в таблице: Р188: полоксамер 188; P407: полоксамер 407. ^b Размеры частиц, ^с индексы полидисперсности (PDI) и ^dдзета-потенциал определяли с помощью динамического рассеяние света; представлены z-средние диаметры.

Поглощение и удержание наносуспензий ATV в MDM

Для определения того, может ли модификация фолатом полимерной оболочки нанокристаллов модифицировать, как составы с наночастицами процессировались MDM, определяли поглощение клеткой. Результаты показали, что экспрессия фолатного рецептора больше на активированных макрофагах, чем у неактивированных макрофагов. Поэтому, вначале определили, может ли на поглощение наносуспензий FA-ATV влиять активация культивируемых MDM. MDM активировали с помощью обработки 50 нг/мл LPS в течение 24 часов перед добавлением наносупензий ATV (с FA-полоксамером или без него). Поглощение составов с наночастицами определяли в 1 и 8 часов. Восемь часов принимали как максимальное поглощение, основываясь на предыдущих исследованиях, которые продемонстрировали, что >95% общего поглощения происходит к 8 часам для большинства наносуспензий ATV. Поглощение наносуспензий ATV, декорированных FA-P188, было приблизительно в 2 раза выше, чем поглощение наносуспензий ATV без FA-P188. На улучшенное поглощение не влияла процентная доля FA-P188 в наносуспензиях Р188-ATV (фиг.18А). Что интересно, улучшенное поглощение FA-P188-ATV не увеличивалось при активации MDM с помощью LPS (фиг.18В), что позволяет предположить, что активация с помощью LPS не увеличивает экспрессию фолатных рецепторов на поверхности клеток применяемых MDM. Для определения того, было ли улучшенное поглощение FA-P188-ATV опосредовано рецептором, в культуральную среду за 30 минут перед добавлением наносуспензий ATV добавили фолиевую кислоту (2,5 мМ). Результаты показали, что добавление избытка фолиевой кислоты блокировало улучшенное поглощение фолат-модифицированных наносуспензий ATV, и поглощение наносуспензий ATV с FA-P188 было аналогичным таковому наносуспензий ATV без FA-P188 (фиг.18С), что указывает на улучшенное поглощение и способность к нацеливанию наносуспензий FA-ATV.

Из-за высокого СМС-профиля Р188 составы с наночастицами FA-P188-ATV будут содержать значительное количество юнимеров FA-P188, которые не осуществляют операцию нацеливания наносуспензий ATV. По этой причине в качестве альтернативного наполнителя для составления ATV выбрали Р407, который имеет более низкий CMC. Этот полимер также модифицировали фолиевой кислотой для получения наносуспензий FA-Р407-ATV, и отличие в поглощении MDM наносуспензий ATV, содержащих различные процентные доли FA-P407, определяли при тех же условиях, что и FA-P188-ATV. Как показано на фигуре 19, поглощение составов с наночастицами ATV, содержащих 5, 20 или 40% FA-P407 (Н3020), было большим, чем поглощение немодифицированных наносуспензий P407-ATV и зависело от процента FA-P407. Поглощение состава, содержащего 40% FA-P407, было в 5 раз большим к 8 часам, чем поглощение состава с наночастицами ATV, содержащего только немодифицированный Р407.

Исходя из этих результатов, наносуспензий ATV, содержащие только Р188 (Н3001), 20% FA-P188 (Н3016), только Р407 (Н3019) или 40% FA-P407 (Н3020) отобрали для дальнейших исследований, чтобы прямо сравнить поглощение MDM на протяжении 8 часов и их удержание и высвобождение на протяжении 15 дней (фигура 20). Поглощение наносуспензий ATV, покрытых Р407, улучшилось в 2,3 раза, по сравнению с поглощением частиц, покрытых р188, после 8 часов (20,7 мкг/10⁶ клеток в сравнении с 8,8 мг/10⁶ клеток). Декорирование фолатом наносуспензий ATV увеличило поглощение MDM в 2,9 раз (Р188) или 1,6 раз (Р407) в сравнении с недекорированными наносуспензиями ATV. Профили удержания наносуспензий ATV на протяжении 15 дней были аналогичными для всех исследованных составов, но удержание наносуспензий FA-ATV в MDM было значительно выше такового для наносуспензий ATV, недекорированных FA. За первые 24 часа клеточного высвобождения MDM лишилось 24%, 37%, 17% и 13% лекарственного средства после загрузки Н3001, Н3019, Н3016 и Н3020, соответственно, и уровни ATV в клетке оставались относительно постоянными, и их высвобождение в среду было непрерывным вплоть до 15 дня после обработки для всех составов (фигура 20). Через 15 дней уровни лекарственного средства в клетке составляли от 67% (Н3001) до 100% (Н3016) уровней лекарственного средства в день 1. Эти результаты указывают, что эти составы имеют стабильный противоретровирусный эффект.

Противоретровирусная эффективность наносуспензий ATV

Чтобы определить противоретровирусную эффективность составов, наносуспензий ATV, содержащие только Р188 (Н3001), 20% FA-P188 (Н3016), только Р407 (Н3019) или 40% FA-P407 (Н3020) отобрали для этих исследований. MDM загружали наносуспензиями ATV в течение 8 часов и затем заражали вирусом hiv-iada через 1, 5, 10 или 15 дней после загрузки наносуспензиями ATV. Спустя десять дней после заражения вирусом определяли активность обратной транскриптазы в культуральной среде и р24+-окрашивание HIV-1. Вирусная инфекция HIV-1 подавлялась одинаково всеми составами.

Активность RT ингибировалась на 70-90%, если заражение вирусом происходило через 10 дней после обработки наносуспензиями ATV, и на более чем 70%, если заражение вирусом происходило через 15 дней после обработки наночастицами (фиг.21). Экспрессия антигена р24 подтвердила подавление вируса, наблюдаемое для активности RT (фиг.22). Небольшое р24+ - окрашивание (коричневый цвет) наблюдали у клеток, зараженных вирусом через 1 и 5 дней после обработки наносуспензиями ATV. Заражение вирусом в 10 и 15 дни после обработки наносуспензиями ATV, приводило к довольно явному р24-окрашиванию в этих клетках. Вместе эти результаты указывают, что наносуспензии ATV, декорированные фолат-модифицированными полоксамерами, обладали противовирусной эффективностью аналогичной таковой для частиц, покрытых немодифицированными полоксамерами.

ПРИМЕР 4

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Синтез активного сложного эфира (пентиноевой кислоты 2, 5-диоксо-пирролидин-1-ил сложного эфира, 9)

1,0 г (10 ммоль) 4-пентиноевой кислоты растворили в 40 мл СH₂Сl₂. Добавили 1,27 г (11 ммоль) N-гидроксисукцинимида (NHS) (см. фигуру 23). Затем добавили 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (EDC) (2,11 г, 11 ммоль). Реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь экстрагировали рассолом за 3 раза. Органический слой выпарили и высушили для получения чистого продукта. Выход: 1,5 г.

Синтез 2-бромэтил-О-α-D-маннопиранозида (11)

1,5 г Amberlite™ IR-120 суспендировали в 11,5 мл 2-бромэтанола (20,3 г; 0,164 моль). Смесь нагревали при 90°С в колбе, оснащенной холодильником. Спустя 30-40 минут одной порцией добавили приблизительно 1,5 г D-маннозы (0,0083 моль). Реакционную смесь перемешивали при тех же условиях в течение 3 часов и затем охладили до комнатной температуры и профильтровали. Растворитель удалили под вакуумом. Образующийся в результате липкий остаток растворили в метаноле и в колбу добавили 5 г силикагеля для получения суспензии. Растворитель удалили выпариванием при пониженном давлении. Поддержанную кремнеземом реакционную смесь загрузили на колонку, предварительно заполненную SiO₂, и предварительно элюировали этилацетатом и затем этилацетатом:метанолом, 19:1 (об./об.). Выход: 61%.

Синтез 2-азидоэтил-O-α-D-маннопиранозида (12)

0,46 г азида натрия (0,007 моль) и 1 г 2-бромэтил-O-α-D-маннопиранозида (0,0035 моль) растворили в 3 мл DW. Затем к смеси добавили 20 мл ацетона для образования слегка мутного раствора. Реакцию нагревали с обратным холодильником при перемешивании в течение 24 часов. Очистку реакционной смеси проводили с помощью колоночной хроматографии с этилацетатом:метанолом, 5:1 в качестве элюента.

Синтез F127 с концевым ацетиленом (ацетилен-F127, 14)

NH₂-F127 (2,56 г, 0,2 ммоль) растворили в 10 мл DCM, затем в этот раствор добавили 0,39 г (2 ммоль) пентиноевой кислоты 2,5-диоксо-пирролидин-1-ил сложного эфира. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 дней. Реакционный раствор концентрировали и затем осадили в эфире. Сырой продукт затем очистили с помощью колонки LH 20. Выход: 1,9 г.

Синтез F127 с концевой маннозой (манноза-F127, 15)

F127 с концевым ацетиленом (1,25 г, 0,1 ммоль), 2-азидоэтил-O-α-D-маннопиранозид (100 мг, 0,4 ммоль), стабилизирующее средство (8,7 мг, 20 мкмоль) и CuSO₄⋅5H₂O (5 мг, 20 мкмоль) растворили в 4 мл метанол/Н₂О при перемешивании. Для удаления кислорода барботировали аргон, затем в этот раствор капля за каплей добавили аскорбат натрия (40 мг, 0,2 ммоль) в 0,5 мл Н₂О. Реакционной смеси дали возможность перемешаться при комнатной температуре в течение 2 дней. Растворители удалили под вакуумом. Сырой продукт очистили с помощью колонки LH-20. Выход: 0,8 г.

Получение наносуспензий

Маннозу-F127 суспендировали в 10 мМ буферном растворе HEPES (рН 7,8). В растворы поверхностно-активного вещества затем добавили ATZ в виде свободного основания (0,1% по весу). Суспензии перемешивали до гомогенных дисперсий с применением роторно-статорной мешалки Ultra-turrax™ T-18. Затем смеси перенесли в мельницу для влажного размола NETZSCH MicroSeries вместе с 50 мл 0,8 мм мелющего тела (керамические гранулы циркония). Образец обрабатывали в течение приблизительно 1 часа при скоростях приблизительно 4 тыс. оборотов в минуту для получения NanoART с требуемым размером частиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Поглощение NanoART оценивали без замены среды в различные моменты времени. Прикрепленные MDM промыли фосфатно-солевым буфером (PBS) и собрали посредством соскабливания в PBS. Клетки осадили центрифугированием при 950хg в течение 10 минут при 4°С. Осадки клеток кратковременно обработали ультразвуком в 200 мкл метанола и центрифугировали при 20000хg в течение 10 минут при 4°С. Метанольный экстракт хранили при -80°С до ВЭЖХ-анализа. На фигуре 24 показано, что маннозные ATV nanoART захватываются макрофагом на более высоких уровнях, чем немеченные ATV nanoART.

ПРИМЕР 5

P188-ATV nanoART вводили NSG-мышам в день 0 и день 7. Уровни лекарственного средства в плазме анализировали в дни 1, 6 и 14 и уровни лекарственного средства в тканях анализировали в день 14. На основании химии сыворотки и гистопатологических оценок токсичность не проявлялась. Уровни в сыворотке через 7 дней после 2^ой 250 мг/кг дозы (400 нг/мл) превышали минимальный человеческий терапевтический уровень в сыворотке 150 нг/мл. Уровни ATV были самыми высокими в печени через 7 дней после 2^ой дозы (1650 нг/г, вес/250 мг/кг). Уровни ATV в селезенке, почках и легких были эквивалентными (140-150 нг/г, вес./250 мг/кг). Уровни ATV в головном мозге были на пределе количественной оценки. Обнаружили, что уровни в сыворотке и тканях были дозозависимыми.

Следующим шагом, исследовали, обеспечивает ли однократная обработка nanoATV/RTV, вводимыми PBL-восстановленным NSG-мышам перед заражением HIV-1, устойчивую доставку лекарственного средства в сыворотку и ткани и улучшенную противовирусную эффективность относительно эквивалентной дозы свободного лекарственного средства. Уровни лекарственного средства в сыворотке через 9 дней после обработки nanoART превышали в 2 log уровни после обработки свободными лекарственными средствами. А именно, nanoART (ATV, RTV или EFV) сохраняли значительно более высокие уровни в сыворотке, чем свободное лекарственное средство на протяжении периода времени 14 дней. Уровни лекарственного средства в тканях были в 100-1000-раз выше у мышей, обработанных nanoART, чем у мышей, обработанных свободным лекарственным средством. Подсчеты СD4+ - клеток не отличались у мышей, обработанных nanoART, в сравнении с обработанными свободным лекарственным средством. Обработка nanoART сдерживала р24+ HIV-1 в селезенке, что не наблюдалось при применении только свободного лекарственного средства.

Затем определили, будет ли nanoATV/RTV или nanoATV/RTV/EFV при введении 2 еженедельными дозами после инфицирования HIV-1 PBL-восстановленных NSG-мышей обеспечивать терапевтические уровни ATV в сыворотке, резервуарные уровни лекарственного средства в лимфатических тканях и противоретровирусную эффективность. Кратко, PBL вводили NSG-мышам в день -7. Мышей заражали HIV-1 в день -0,5. NanoART вводили в дни 0 и 7 (nanoATV/RTV 250 мг/кг или nanoATV/RTV/EFV 100 мг/кг). Уровни лекарственного средства в сыворотке проверяли в дни 1, 6 и 14 и уровни лекарственного средства в тканях анализировали в день 14 вместе с CD4+ - клетками и р24-окрашиванием или выявлением РНК.

У мышей, обработанных 2 дозами nanoART, достигались терапевтические уровни ATV в сыворотке. Уровни ATV в печени были в 2 раза выше, чем у нормальных NSG-мышей, обработанных аналогичной дозой nanoATV/RTV. Уровни ATV в селезенке были в log выше, чем уровни ATV в печени у обработаннрдгх мышей в отличие от нормальных NSG-мышей. Уровни ATV в головном мозге были на пределе количественной оценки. После обработки nanoART мышей, инфицированных HIV-1, отношения СD4+ - клеток и СD4+СD8+ - клеток были аналогичны таковым для неинфицированных мышей. Однако как nanoATV/RTV, так и nanoATV/RTV/EFV защищали от HIV-1-инфекции у этих мышей (обе терапии снижали уровни р24 до почти необнаруживаемых уровней).

Мышам также вводили наночастицы или свободное лекарственное средство в количестве только 10 мг/кг с помощью SC инъекции. Как видно из таблицы 4, эта низкая доза наночастиц привела к неожиданно высоким уровням концентрации лекарственного средства in vivo, превышающим таковые свободного лекарственного средства.

Время (часы) NP-P188, нг/мл SEM FD, нг/мл SEM ATV 0,25 14,35 1,80 1148,59 402,58 1 16,11 1,00 804,50 319,99 3 23,71 3,52 2061,60 111,86 6 41,58 3,52 2099,06 111,86 10 321,55 105,08 638,86 346,81 24 94,87 13,45 9,85 6,34 48 40,88 9,25 4,38 1,40 96 62,27 17,56 4,30 1,01 168 12,72 1,52 1,74 0,50 336 5,03 0,50 0,00 0,00 RTV 0,25 5,50 0,61 1079,63 507,61 1 12,87 1,60 492,03 199,43 3 57,53 8,74 710,50 59,60 6 106,73 8,74 551,30 59,60 10 170,10 22,97 69,08 17,18 24 356,03 71,31 5,91 1,71 48 437,00 58,29 2,36 0,80 96 752,33 177,24 4,94 1,57 168 2,59 0,97 2,21 0,43 336 <LLOQ 0,00 0,00 0,00 EFV 0,25 2,73 1,06 301,47 150,68 1 5,48 0,83 123,74 60,03 3 15,99 2,30 155,36 12,69 6 95,47 2,30 212,77 12,69 10 298,00 25,28 39,99 9,09 24 366,33 42,19 7,10 2,09 48 358,00 52,74 2,17 0,66 96 389,67 103,35 2,99 1,02 168 2,06 0,25 2,57 0,14 336 2,59 0,19 <LLOQ 0,00

Таблица 4: Концентрация в плазме ATV, RTV или EFV после введения 10 мг/мл лекарственного средства в виде наночастиц или свободного лекарственного средства (FD).

Наконец, определяли, обеспечивает ли nanoATV/RTV с фолат-модифицированным полимером в качестве наполнителя увеличенные уровни ATV лекарственного средства в сыворотке, увеличенные уровни ATV в лимфатических тканях и улучшенную терапевтическую эффективность. Фолат-Р407 ATV nanoART вводили PBL-восстановленным NSG-мышам, как описано выше, после заражения HIV-1. Уровни ATV в селезенке и легких были аналогичны таковым у животных, обработанных P188-nanoATV/RTV. Уровни ATV в почках, печени и головном мозге были в ~5 раз ниже, в ~5 раз выше и в ~10 раз выше, соответственно, у мышей, обработанных фолат-модифицированным nanoART, чем немодифицированным nanoART. Подсчет СD4+ - клеток и отношение СD4+/СD8+ - клеток увеличились до уровней, наблюдаемых у неинфицированных мышей. p24+ HIV-1-клетки и РНК в селезенке снизились до почти необнаруживаемых уровней у мышей, обработанных фолат-модифицированными nanoART.

Ряд публикаций и патентных документов цитируются на протяжении всего вышеизложенного описания, чтобы описать состояние области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Полное раскрытие каждого из этих цитируемых документов включается в данный документ посредством ссылки.

Хотя выше были описаны и приведены конкретные примеры определенных предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, не предполагается, что настоящее изобретение ограничивается такими вариантами осуществления. Различные модификации могут вноситься в него без отклонения от объема и сути настоящего изобретения, которые излагаются в следующей формуле изобретения.

Группа изобретений относится к области фармацевтики и представляет собой наночастицу для подавления ретровирусной инфекции, содержащую по меньшей мере одно терапевтическое средство и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, где указанная наночастица является кристаллической, где указанное поверхностно-активное вещество покрывает кристалл указанного терапевтического средства, где указанное терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из атазанавира (ATV), эфавиренза (EFV), индинавира (IDV) и ритонавира (RTV), где указанное поверхностно-активное вещество является амфифильным блок-сополимером, где указанная наночастица получена с помощью мокрого размола или гомогенизации высокого давления и где указанная наночастица содержит по меньшей мере 95% терапевтического средства; композицию для подавления ретровирусной инфекции; способ лечения или подавления HIV-инфекции. Изобретение обеспечивает устойчивую доставку лекарственного средства в сыворотку и ткани и улучшенную противовирусную эффективность относительно эквивалентной дозы свободного лекарственного средства. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 5 пр., 4 табл., 25 ил.

1. Наночастица для подавления ретровирусной инфекции, содержащая по меньшей мере одно терапевтическое средство и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, где указанная наночастица является кристаллической, где указанное поверхностно-активное вещество покрывает кристалл указанного терапевтического средства, где указанное терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из атазанавира (ATV), эфавиренза (EFV), индинавира (IDV) и ритонавира (RTV), где указанное поверхностно-активное вещество является амфифильным блок-сополимером, где указанная наночастица получена с помощью мокрого размола или гомогенизации высокого давления и где указанная наночастица содержит по меньшей мере 95% терапевтического средства.

2. Наночастица по п. 1, которая является палочкообразной или округлой.

3. Наночастица по п. 1, где диаметр составляет от 100 нм до 1 мкм.

4. Наночастица по п. 1, где указанный амфифильный блок-сополимер включает по меньшей мере один блок поли(оксиэтилена) и по меньшей мере один блок поли(оксипропилена).

5. Наночастица по п. 1, где указанное поверхностно-активное вещество связано по меньшей мере с одним нацеливающим лигандом.

6. Наночастица по п. 5, где указанный нацеливающий лиганд представляет собой макрофаг-нацеливающий лиганд.

7. Наночастица по п. 6, где указанный макрофаг-нацеливающий лиганд представляет собой фолат.

8. Наночастица по п. 1, где указанное терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из EFV, IDV и RTV.

9. Наночастица по п. 1, где указанное поверхностно-активное вещество является заряженным.

10. Наночастица по п. 9, где указанное поверхностно-активное вещество является отрицательно заряженным.

11. Наночастица по п. 1, где указанная наночастица содержит по меньшей мере 99% терапевтического средства.

12. Наночастица по п. 1, где указанная наночастица состоит из по меньшей мере одного терапевтического средства и по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества, необязательно связанного по меньшей мере с одним нацеливающим лигандом.

13. Композиция для подавления ретровирусной инфекции, содержащая по меньшей мере одну наночастицу по п. 1 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

14. Способ лечения или подавления HIV-инфекции у субъекта, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение указанному субъекту по меньшей мере одной композиции по п. 13, где терапевтическое средство представляет собой соединение против HIV.

15. Способ по п. 14, дополнительно включающий введение по меньшей мере одного дополнительного соединения против HIV.

16. Способ по п. 14, где указанное поверхностно-активное вещество связано с макрофаг-нацеливающим лигандом.

17. Способ по п. 16, где указанный макрофаг-нацеливающий лиганд представляет собой фолат.

18. Способ по п. 14, где указанную наночастицу вводят из расчета 10 мг/кг или меньше.