Изобретение относится к пищевой, косметической, биотехнологической и медицинской промышленности, в частности, используется для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.
В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, длительной антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим бифидобактерии.
В кишечнике человека, в основном, встречаются 5 видов бифидобактерий - B.bifidum, B.longum, B.adolescentis, B.breve и B.infantis. Из них с наибольшей частотой в биоценозе обнаруживаются виды B.bifidum и B.longum. Вид B.adolescentis чаще встречается у взрослых людей, а виды B.breve и B.infantis - преимущественно у детей грудного возраста.
Известны зарубежные моно- и комплексные препараты-эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видов B.bifidum, B.lonqum, B.adolescentis, B.breve (патент 2336886, патент 2411008, Франция; патент 637297, Швейцария; патент 2134179, патент 2421066, ФРГ; патент 05227946, патент 0430642, Япония; патент 4645667, США, патент 6063935, Япония, патент 5922375, США, патент 5902743, США, патент 6746672, США, патент 6548057, США). У нас в стране для приготовления бактерийных препаратов, биологически активных добавок, продуктов лечебно-диетического питания применяют отечественные штаммы бифидобактерий видов B.bifidum 1,791,792; B.lonqum B379M, Я-2, Я-4; B.adolescentis МС-42, Г 7513; B.breve 79-119; B.infantis 79-43 (авторское свидетельство №343588, патент РФ 1347221, патент РФ 849779, патент РФ 2108383, патент РФ 2152993, патент 863639, патент РФ 2120991, патент РФ 2078814, патент РФ 2111248).
Качество лечебных продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебного питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстановить его нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.
Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида B.bifidum 79-75 с высокой биологической активностью, устойчивостью к условиям внешней среды, обладающего стабилизирующим кислотообразованием во всем температурном диапазоне развития клеток, антагонистически активного по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, сквашивающего молоко и быстро размножающегося на искусственных питательных средах.
Штамм Bifidobacterium bifidum 79-75 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка грудного возраста и депонирован в Государственной коллекции нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №247.
Заявляемый штамм может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, например квас, пиво и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например соки, напитки и т.п., заквасок для приготовления кисломолочной продукции и биологически активных добавок к пище. Штамм Bifidobacterium bifidum 79-75 может широко использоваться так же для производства гигиенических и косметических средств, например кремов, лосьонов, салфеток, мыла, присыпок, тампонов, питательных масок, гелей, женских прокладок, косметического молочка, различных пудр и т.д.
Кроме того, штамм Bifidobacterium bifidum 79-75 может быть использован при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других средств.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма Bifidobacterium bifidum 79-75, который может быть использован в качестве биологически активного вещества в составе кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Штамм Bifidobacterium bifidum 79-75 обладает биологически и технологически значимыми свойствами, такими как высокая кислотообразующая активность и способность наращивать микробную биомассу в короткие сроки культивирования. Штамм Bifidobacterium bifidum 79-75 антагонистически активен по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Это позволит использовать штамм Bifidobacterium bifidum 79-75 в качестве биологически активного компонента в составе различных пробиотических средств, обеспечивающих нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов, и расширит арсенал аналогичных средств.
Культурально-морфологические свойства штамма.
Клетки представляют собой гр+ полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2х концах, в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Отдельно выросшие колонии на печеночной питательной среде имеют удлиненную форму колоний. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 12-24 часам культивирования.
Физико-биохимические свойства штамма.
Бесспоровый, неподвижный анаэроб. Оптимальная температура выращивания 38,0±0,5°C. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L + молочной кислот, без образования газа, закисляя среду выращивания до pH 4,3-3,9, ферментирует лактозу, фруктозу, галактозу, сахарозу. Не ферментирует сорбит, арабинозу, салицин, инозит, инулин, целлобиозу, ксилозу, маннозу, манит. Штамм сквашивает молоко к 24-36 ч.
Штамм Bifidobacterium bifidum 79-75 обладает антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре (Таблица 1).
Штамм активно наращивает микробную массу при росте на гидролизатно-молочной среде (ГМ), Бифидум-среде (БФ), продуцируя кислоты (Таблица 2).
Штамм максимально накапливает микробную массу к 12-24 часам, достигая в 1 мл lg 8-9 микробных клеток, активно продуцирует кислоты.
Таким образом, предлагаемый штамм В. bifidum 79-75 технологичен, поскольку размножается в различных питательных средах с накоплением производственной биомассы с высокой концентрацией бифидобактерий; обладает кислотообразующей активностью, а так же антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.
Кисломолочные, ферментированные, неферментированные пищевые продукты, гигиенические, косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, содержащие штамм В.bifidum 79-75, могут найти широкое применение в пищевой, медицинской, биотехнологической и косметической промышленности.
Способность штамма В.bifidum 79-75 наращивать биомассу в питательной среде в короткие сроки культивирования, кислотообразующая активность, антагонистическая активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, а так же другие полезные для организма человека свойства, характерные для вида В.bifidum, делают возможным использование штамма в составе различных корригирующих средств лечебно-профилактического назначения.
Пример 1. Использование штамма В.bifidum 79-75 в составе биологически активных добавок.
1 пассаж: лиофилизированный штамм В.bifidum 79-75 в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10-9. Инкубируют при температуре 38,0±0,5°C до образования видимого роста в последних разведениях.
2 пассаж: выросшую культуру из 10-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38,0±0,5°C в течение 12-24 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза.
3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 38,0±0,5°C до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 108/мл.
В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 108/ мл, содержанием бифидобактерий. При высушивании биомассы с защитными средами (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко или другие) получают сухую биологически активную добавку с содержанием бифидобактерий не менее 107/ мл.
Пример 2. Использование штамма В.bifidum 79-75 для приготовления ферментированных и неферментированных пищевых продуктов.
1 пассаж: лиофилизированный штамм В.bifidum 79-75 в количестве 0,1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10-9. Инкубируют при 38,0±0,5°C до образования видимого роста в последних разведениях.
2 пассаж: выросшую культуру из 10-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38,0±0,5°C в течение 12-24 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза.
3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 38,0±0,5°C до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 108/мл.
Получение ферментированного или неферментированного пищевого продукта: выросшую биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки, пиво, квас и пр.) в количестве до 10% от объема, перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 106/ мл.
Пример 3. Использование штамма В.bifidum 79-75 для приготовления кисломолочного продукта.
1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10-9. Инкубируют при 38,0±0,5°C до образования видимого роста в последних разведениях. Или сухую лиофилизированную биомассу бифидобактерий вносят в количестве 1-2 дозы в пробирку с 30 мл питательной среды. Культивируют при температуре 38,0±0,5°C до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 107/мл.
2 пассаж: выросшую культуру штамма В. bifidum 79-75 из последних разведений или из пробирки с выросшей биомассой вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 38,0±0,5°C до получения биомассы с содержанием бифидобактерий не менее 108/мл.
3 пассаж: полученную биомассу штамма В.bifidum 79-75 в объеме до 10% вносят в стерильное молоко, культивируют до образования сгустка (кисломолочный продукт). Количество пассажей №2 может быть увеличено в зависимости от объема производства.
Пример 4. Использование штамма В.bifidum 79-75 для получения бактерийных препаратов.
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38,0±0,5°C до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 108 в 1 мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, флаконы и другие емкости, замораживают при температуре минус 35-45°C и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10 живых клеток бифидобактерий. Данное содержание бифидобактерий согласуется с научно-технической документацией на аналогичный бифидосодержащий препарат - “Бифидумбактерин сухой” и является достаточным для использования полученного средства в качестве препарата - эубиотика.
Пример 5. Использование штамма В.bifidum 79-75 для получения гигиенических и косметических средств.
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 37-38 градусов по Цельсию до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 108 в 1 мл, высушивают методом распыления или лиофилизации.
Полученную биомассу бифидобактерий штамма В.bifidum 79-75 вводят в состав питательного крема в количестве не более 1% к объему.
Штамм Bifidobacterium bifidum 79-75 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка грудного возраста и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора» под регистрационным номером 247. Штамм активно размножается в питательных средах различного состава с накоплением производственной биомассы в короткие, 12-24 ч, сроки культивирования с высокой концентрацией бифидобактерий. Штамм Bifidobacterium bifidum 79-75 обладает кислотообразующей активностью, антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, заквашивает молоко. Это позволяет использовать штамм Bifidobacterium bifidum 79-75 для получения бифидосодержащей продукции. 2 табл.
Штамм Bifidobacterium bifidum, используемый для получения бифидосодержащей продукции, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора», регистрационный № 247.
