СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ ПЫЛИ ПОМЕЩЕНИЙ Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/06 G01N1/10 

Изобретение относится к области экологии, а именно к получению первичной характеристики микробного сообщества пыли помещений, и может быть использовано для проведения экологического мониторинга жилых и производственных помещений с целью одновременного количественного определения общей бактериальной обсемененности и получения культуральных, морфологических, тинкториальных и гемолитических характеристик микробного сообщества образцов пыли помещений.

Известен способ определения бактериальной обсемененности чашечным методом путем последовательного использования набора специальных сред и культивирования в анаэробных и аэробных условиях (Инструкция по бактериологическому контролю комплекса санитарно-гигиенических мероприятий в лечебно-профилактических учреждениях. Приказ №720 МЗ СССр от 31 июля 1978 г. Приложение 2. Методические указания МУК 4.2.734-99. Микробиологический мониторинг производственной среды. МЗ России. Москва, 1999 г. Goh I., Obbard J.P., Viswanathan S., Huang Y. Airborne bacteria and fungal spores in the indoor environment. A case study in Singapore. Acta biotechnol., 2000, 20, 1, 67-73).

Однако для проведения скрининговых исследований микробной обсемененности пыли помещений последовательное использование нескольких специальных питательных сред в разных условиях культивирования значительно увеличивает трудозатраты и время, требуемое для получения качественных характеристик бактериальной флоры.

Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является разработка способа, который предполагает использование для проведения экологического мониторинга определения бактериальной обсемененности пыли помещений посев образца пыли только на одну питательную среду и одновременное получение качественных и количественных характеристик микробного сообщества.

Техническим результатом заявленного способа является достижение эффективности, простоты и удобства в определении общей бактериальной обсемененности пыли помещений.

Для достижения указанного технического результата способ определения бактериальной обсемененности пыли помещений включает сбор образцов пыли стерильным ватным тампоном с 10-20 см² любой поверхности или на стерильном хлопчатобумажном фильтре при обработке пылесосом, помещение навески пыли или ватного тампона в 1 мл стерильного физиологического раствора, экстрагирование в течение 30-60 минут при комнатной температуре при перемешивании, отбор надосадочной жидкости, приготовление из надосадочной жидкости кратных разведении экстракта, посев полученных разведении в тиогликолевую среду и модифицированную тиогликолевую среду, приготовленную путем добавления к 10 мл тиогликолевой среды дефибринированной крови в количестве 0,2-0,4 мл, культивирование в течение 10 дней при температуре 37°С, ежедневный визуальный контроль и последующее определение наиболее вероятного числа количества микробных клеток.

Определение наиболее вероятного числа количества микробных клеток рассчитывают по статистической таблице Мак-Креди, составленной на основе данных о ростовых свойствах микроорганизмов, а тинкториальные свойства бактериального сообщества образца пыли определяют микроскопированием мазков перемешанной культуральной массы, окрашенных по Граму.

Приготовление тиогликолевой среды. Навеску среды для контроля стерильности тиогликолевой среды (тиогликолевая среда ФС 42-326-ВС-92: гидролизат казеина ферментативный - 15 г, экстракт кормовых дрожжей - 5 г, натрий хлористый - 2,5 г, глюкоза - 5 г, тиогликолят натрия - 0,5 г, цистеин гидрохлорид - 0,75 г, агар-агар микробиологический - 0,75 г, натрий углекислый - 0,8 г, вода дистиллированная - до 1 л, pH 7,0) растворяют при нагревании в дистиллированной воде, разливают по 10 мл в стерильные пробирки, стерилизуют. Для приготовления модифицированной среды для выявления присутствия гемолитических микроорганизмов к 10 мл готовой стерильной тиогликолевой среды при температуре 37-40°С прибавляют 0,2-0,4 мл дефибринированной крови (животного или человека), перемешивают круговыми движениями до получения однородно окрашенного раствора.

Сбор образцов пыли может быть осуществлен стерильным ватным тампоном с 10-20 см² любой поверхности или собран на стерильном хлопчатобумажном фильтре при обработке поверхности пылесосом.

Приготовление разведении экстрактов образцов пыли. Навеску пыли или ватный тампон помещают в стерильную пробирку, прибавляют известный объем стерильного физиологического раствора, проводят экстракцию в течение 30-60 минут при комнатной температуре при перемешивании, отбирают надосадочную жидкость, из которой готовят разведения экстракта.

Посев каждого разведения проводят в три параллельные пробирки с приготовленной средой, причем для посева минимального разведения используют пробирки с модифицированной средой.

Визуальный контроль позволяет сделать заключение о присутствии в микробном сообществе бактерий с различными типом дыхания, характером роста, способностью к газообразованию, гемолитическими свойствами.

Наиболее вероятное число количества микробных клеток (НВЧК) определяют по таблице Мак-Креди.

Приготовление мазков. Мазки готовят из тщательно перемешанной культуральной массы из пробирок с минимальными разведениями, окрашивают по Грамму. При микроскопировании определяют тинкториальные свойства смешанной культуры - присутствие грамположительных и грамотрицательных кокковидных и палочковидных бактерий.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение бактериальной обсемененности пыли жилого помещения

Стерильным ватным тампоном была собрана пыль с 10 см² поверхности плинтуса. Тампон поместили в стерильную пробирку, прибавили 1 мл стерильного физиологического раствора. После 30 минут перемешивания приготовили пятикратные разведения экстракта, провели посев по 100 мкл каждого разведения в три параллельные пробирки с таогликолевой средой и по 100 мкл минимального разведения в три параллельные пробирки с модифицированной тиогликолевой средой, приготовленной путем прибавления к 10 мл тиогликолевой среды 0,2 мл дефибринированной крови. Культивировали в течение 10 дней в аэробных условиях при температуре, равной 37°С. Визуальный контроль позволил выявить присутствие в микробном сообществе образца пыли, в основном аэробных микроорганизмов, поскольку в верхней части столбика среды отмечалось сильное помутнение, на поверхности - пленочный рост, на высоте 1 см от поверхности среды отмечались 2-11 рыхлых столбиков, нижняя часть среды была прозрачной. Газообразования не было выявлено, как и гемолиза. Микроскопическое исследование смешанной культуры показало присутствие кокковидных и палочковидных полиморфных бактерий грамотрицательных и грамположительных. Общая обсемененность составляла 150 НВЧК/см².

Пример 2. Определение бактериальной обсемененности пыли, собранной с матраца

Образец пыли собран на стерильный хлопчатобумажный фильтр при обработке поверхности пылесосом. Навеску пыли с массой, равной 5 мг, поместили в стерильную пробирку, прибавили 1 мл стерильного физиологического раствора. После 60 минут перемешивания приготовили пятикратные разведения экстракта, провели посев по 100 мкл каждого разведения в три параллельные пробирки с тиогликолевой средой и по 100 мкл минимального разведения в три параллельные пробирки с модифицированной тиогликолевой средой, приготовленной путем прибавления к 10 мл тиогликолевой среды 0,4 мл дефибринированной крови. Культивировали в течение 10 дней в аэробных условиях при температуре, равной 37°С. Визуальный контроль позволил выявить присутствие в микробном сообществе образца пыли бактерий с разным типом дыхания - аэробным и анаэробным (поверхностный и придонный характер роста), поскольку на поверхности среды отмечался пленочный рост, в нижней части пробирке наблюдали гемолиз. Микроскопическое исследование смешанной культуры показало присутствие кокковидных и палочковидных полиморфных бактерий грамотрицательных и грамположительных. Общая обсемененность составляла 2×10⁵ НВЧК/г пыли.

Таким образом, заявленный способ одновременно определяет количество общей бактериальной обсемененности, культуральные, морфологические, тинкториальные и гемолитические характеристики микробного сообщества образцов пыли помещений, является простым, эффективным и удобным для рутинных исследований.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для проведения экологического мониторинга жилых и производственных помещений с целью одновременного количественного определения общей бактериальной обсемененности и получения культуральных, морфологических, тинкториальных и гемолитических характеристик микробного сообщества образцов пыли помещений. Способ предусматривает сбор образцов пыли стерильным ватным тампоном с 10-20 см² любой поверхности или на стерильном хлопчатобумажном фильтре пылесоса. Помещение образцов пыли в стерильный физиологический раствор с последующим экстрагированием в течение 30-60 минут при комнатной температуре и при перемешивании. Отбор надосадочной жидкости и приготовление из нее кратных разведении полученного экстракта. Посев полученных разведении в полужидкую тиогликолевую среду и модифицированную тиогликолевую среду, полученную путем добавления к тиогликолевой среде дефибринированной крови в заданном количестве. Культивирование в течение 10 дней при температуре 37°С и ежедневный визуальный контроль с последующим определением количества микробных клеток, которое рассчитывают по статистической таблице Мак-Креди, составленной на основе данных о ростовых свойствах микроорганизмов, а тинкториальные свойства бактериального сообщества образца пыли определяют микроскопированием мазков перемешанной культуральной массы, окрашенных по Граму.

1. Способ определения бактериальной обсемененности пыли помещений, включающий сбор образцов пыли стерильным ватным тампоном с 10-20 см² любой поверхности или на стерильном хлопчатобумажном фильтре при обработке пылесосом, помещение навески пыли или ватного тампона в 1 мл стерильного физиологического раствора, экстрагирование в течение 30-60 мин при комнатной температуре при перемешивании, отбор надосадочной жидкости, приготовление из надосадочной жидкости кратных разведении экстракта, посев полученных разведений в тиогликолевую среду и модифицированную тиогликолевую среду, приготовленную путем добавления к 10 мл тиогликолевой среды дефибринированной крови в количестве 0,2-0,4 мл, культивирование в течение 10 дней при температуре 37°С, ежедневный визуальный контроль и последующее определение наиболее вероятного числа количества микробных клеток.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что определение наиболее вероятного числа количества микробных клеток рассчитывают по статистической таблице Мак-Креди, составленной на основе данных о ростовых свойствах микроорганизмов, а тинкториальные свойства бактериального сообщества образца пыли определяют микроскопированием мазков перемешанной культуральной массы, окрашенных по Граму.