СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА ИЗ ВОЗДУШНОЙ СРЕДЫ Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии, и предназначено для обнаружения микобактерий туберкулеза в воздушной среде помещений лечебно-профилактических учреждений.

Вопрос определения микобактерий туберкулеза в воздухе чрезвычайно актуален. В настоящее время признано, что наиболее вероятным путем трансмиссии туберкулезной инфекции является воздушно-капельный путь. Микобактерий могут содержаться в частицах или капельках, образующихся при чихании, кашле или разговоре людей, страдающих ларингеальной или легочной формой туберкулеза. Возможно также возникновение вторичного инфекционного аэрозоля, когда выделяемые больными туберкулезом капельки слизи, содержащие микобактерии, оседают на белье и различных поверхностях, а также адсорбируются на пылевых частицах, которые поднимаются в воздух и длительно циркулируют в воздушных потоках. Постоянно перемещающиеся естественные воздушные потоки способны поддерживать во взвешенном состоянии такие частички в течение длительных промежутков времени и переносить их как внутри помещения, так и по всему зданию (Игнаткин В.И., Медведева И.М., Дорожкова И.Р. и др. // Нозокомиальная туберкулезная инфекция. «Весь Мир», 2001.С.33). Следовательно, воздушная среда помещений противотуберкулезного учреждения является ключевым фактором передачи в возникновении нозокомиального туберкулеза у сотрудников, поэтому особый интерес представляет микобактериальная загрязненность воздушной среды этих подразделений (М.Н.Зуева // Нозокомиальная туберкулезная инфекция. «Весь Мир», 2001. С.32, А.С.Корначев // Особенности эпидемического процесса туберкулеза в Уральском федеральном округе: характеристика угроз территориального и внутрибольничного распространения и меры их минимизации. «Издательство Тюменского государственного университета». 2005. С.99-122).

Достоверное выявление микобактерий туберкулеза в воздушной среде позволит осуществлять инфекционный контроль для предотвращения внутрибольничного распространения туберкулеза в ЛПУ разного профиля.

Известен способ выявления микобактерий туберкулеза из воздушной среды - седиментационный метод Прессмана - включающий размещение на различной высоте чашек Петри с физиологическим раствором на 5-7 дней, после чего содержимое чашек подвергают центрифугированию. Осадок обрабатывают 5% раствором щавелевой кислоты и засевают на среды с кровяным агаром. По росту колоний судят о наличии микобактерий в воздухе (Г.И.Карпухин. Бактериологическое исследование и обеззараживание воздуха. М.: Медгиз, 1962, с.47).

Недостатком способа является невозможность определения степени загрязнения микобактериями воздушной среды всего помещения, т.к. осаждение пылевых и аэрозольных частиц с адсорбированными бактериями происходит локально (в зонах наиболее высокой вероятности контаминации воздуха).

Известен также способ улавливания микроорганизмов из определенного объема воздуха путем направленного ударного действия воздушной струи с помощью аппарата Кротова непосредственно на плотные питательные среды, такие как мясопептонный агар, Сабуро, ЖСА без предварительной обработки исследуемого материала. Затем пробы инкубируются в течение 24 часов и пересеваются на селективные питательные среды для дальнейшей идентификации микроорганизмов (Г.И.Карпухин. Бактериальное исследование и обеззараживание воздуха. М.: Медгиз, 1962, с.64-67). Все исследования общей обсемененности помещений с помощью аппарата Кротова (путем направленного ударного действия воздушной струи) предполагают отбор проб воздуха непосредственно на плотные питательные среды без предварительной обработки полученного материала, вследствие чего не удается достоверно выделить МВТ вследствие обильного роста неспецифической микрофлоры воздуха (стрептококки, стафилококки, энтеробактерии, протей и др.).

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения микобактерий туберкулеза из воздушной среды [патент РФ 2221047]. Способ предусматривает отбор пробы воздуха с помощью аппарата ПУ-1Б (пробоотборное устройство), представляющего собой модификацию аппарата Кротова, выпускаемого серийно ЗАО "Химко" и предназначенного для отбора проб биологических аэрозолей при проведении санитарного контроля атмосферного воздуха и воздуха различных помещений (в том числе медицинских учреждений, предприятий пищевой, фармацевтической промышленности, на транспорте, в культурных центрах и т.п.) путем направленного ударного действия струи на чистую поверхность стерильной чашки Петри с последующим смывом с поверхности ватным тампоном, смоченным в физиологическом растворе. Затем тампон помещают в пробирку с 10%-ным раствором фосфорнокислого натрия трехзамещенного, инкубируют в термостате при температуре 37°C в течение 18-24 часов, центрифугируют, отмывают осадок от раствора фосфорнокислого натрия трехзамещенного в стерильной дистиллированной воде, проводят засев на питательную среду Левенштейна-Иенсена и инкубируют до появления роста.

Отбор проб воздуха производят на чистые чашки Петри, предварительно простерилизованные при 2,0 атм (132°C) в течение 20 минут. Объем исследуемой пробы воздуха - 250 литров. Прибор устанавливают на высоте 1,0 м от пола (зона дыхания сидящего или лежащего человека) в геометрическом центре палаты. После забора проб воздуха чашки Петри переносят в лабораторию, где производят смыв с их поверхности ватным тампоном, смоченным в физиологическом растворе. Затем тампон помещают в пробирку с 10%-ным раствором фосфорнокислого натрия трехзамещенного, инкубируют в термостате при температуре 37°C в течение 18-24 часов, центрифугируют, отмывают материал от раствора фосфорнокислого натрия трехзамещенного в стерильной дистиллированной воде и засевают общепринятым способом на среду Левенштейна-Иенсена, инкубируют до появления роста.

Недостатки этого способа заключаются в том, что струя воздуха, попадая на гладкую поверхность чашки Петри, отталкивается от этой поверхности, и, тем самым, снижает достоверность выявления микобактерий туберкулеза из воздушной среды.

Исследуемый материал с поверхности чашки Петри собирается ватным тампоном и подвергается последующей обработке. При этом происходит фиксация МБТ на ватном тампоне, что приводит к количественным потерям микобактерий туберкулеза на 70-75%, вследствие адсорбции микобактерий на вате [патент РФ №2180690]. Последующие операции способа (обработка тампонов концентрированным 10%-ым раствором фосфорнокислого натрия трехзамещенного, их центрифугирование, отмывание осадка стерильной дистиллированной водой) также приводят к потерям микобактерий и дополнительному загрязнению исследуемого материала посторонней микрофлорой [патент РФ №2180690] и, следовательно, к снижению достоверности выявления микобактерий туберкулеза.

Кроме того, отмывание материала стерильной дистиллированной водой не останавливает действие обрабатывающего раствора (щелочи), вследствие чего частично будут изменяться свойства питательной среды, что также снижает достоверность выявления микобактерий туберкулеза из воздушной среды.

В основу изобретения положена задача повышения достоверности выявления микобактерий туберкулеза из воздушной среды.

Поставленная задача решается тем, что в способе выявления микобактерий туберкулеза из воздушной среды, предусматривающем отбор пробы воздуха путем направленного ударного действия струи на дно чашки Петри, обработку пробы раствором фосфорнокислого натрия трехзамещенного, инкубирование в течение 24 часов, центрифугирование, нейтрализацию осадка, посев на питательную среду и повторное инкубирование до появления роста, обработку пробы раствором фосфорнокислого натрия трехзамещенного, ведут путем предварительного помещения на дно чашки Петри пластины из поролона, смоченной в 4-6 мл 5% раствора фосфорнокислого натрия трехзамещенного, с последующим инкубированием чашки Петри с поролоновой пластиной, перед центрифугированием поролоновую пластину отжимают в центрифужную пробирку, нейтрализацию осадка осуществляют 1%-ным раствором лимонной кислоты в соотношении 1:1, а посев проводят на питательную среду "Новая" [патент РФ №2364629 и Методика определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам на среде "Новая", Екатеринбург, 2004 г. [http://umiif.m/umiif/files/texts/2004_metodik.pdf].

При этом диаметр пластины из поролона равен диаметру дна чашки Петри, а ее толщина составляет 4-6 мм

Таблица 1 № п/п Перечень мероприятий Известный (патент №2221047) Заявляемый 1. Отбор пробы воздуха на сухие чашки Петри на поролоновую пластину, смоченную в 5 мл 5%-ного раствора раствором фосфорнокислого натрия трехзамещенного 2. Объем исследуемой пробы воздуха 250 литров 250 литров 3. Забор пробы смыв с внутренней поверхности чашки Петри ватным тампоном, смоченным в физиологическом растворе Чашка Петри с поролоновой пластиной с адсорбированными микобактериями 4. Обработка пробы 10% раствором фосфорнокислого натрия трехзамещенного 5% раствором фосфорнокислого натрия трехзамещенного 5. Инкубация материала при температуре 37°С в течение 24 часов при температуре 37°С в течение 18-24 часов 6. Обогащение центрифугируют ватный тампон при скорости 2000 оборотов в 1 мин в течение 15 мин отжимают пластину и исследуемый материал центрифугируют при скорости 2000 оборотов в 1 мин в течение 20 мин 7. Нейтрализация осадка отмывание в стерильной дистиллированной воде нейтрализация 1% раствором лимонной кислоты 8. Посев на питательную среду Левенштейна-Иенсена. "Новая" 9. Повторная инкубация в термостате при температуре 37°С С еженедельным просмотром до появления роста до 3-х месяцев С еженедельным просмотром до появления роста до 3-х месяцев

В таблице 1 представлена сравнительная технология исследования проб воздуха по известному и заявляемому способам

Отбор пробы воздуха непосредственно на поверхность пластины из поролона, смоченной в 5 мл 5%-ного раствора фосфорнокислого натрия трехзамещенного, помещенной в чашки Петри, позволяет избежать потери МБТ, связанной с манипуляциями с тампоном и по переносу исследуемого материала (смыв ватным тампоном, смоченным изотоническим раствором хлорида натрия с последующим перенесением материалов в пробирку с раствором фосфорнокислого натрия трехзамещенного), что повышает достоверность выявления микобактерий туберкулеза из воздушной среды.

В способе по патенту РФ 2221047 тампон для обработки от посторонней микрофлоры помещают в пробирку с 10%-ным раствором фосфорнокислого натрия трехзамещенного. Такую концентрацию обрабатывающего раствора обычно используют при выявлении микобактерий из патологического материала, полученного от больных (Приказ МЗ РФ от 21.03.03 г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»).

Так как известно, что количество микроорганизмов в воздушной среде заведомо меньше, чем в патологическом материале, концентрация обрабатывающего раствора в этом случае может быть снижена. Снижение концентрации раствора фосфорнокислого натрия трехзамещенного до 5% обеспечивает более щадящую обработку, что позволяет уменьшить потерю микробных клеток в 1,3-1,5 раза, данная концентрация раствора достаточна для деконтаминации сопутствующей микрофлоры, что также повышает достоверность результата.

Нейтрализация осадка 1% лимонной кислотой необходима для приостановления действия обрабатывающего раствора (щелочи), вследствие чего не будут изменяться свойства среды и, следовательно, достоверность выявления микобактерий туберкулеза из воздушной среды также повысится.

Посев на среду «Новая» позволяет сократить сроки роста микобактерий в 1,6-1,7 раза, а входящий в состав бактерицидный краситель - малахитовый зеленый в комплексе диметилсульфоксидом обладает оптимальным противомикробным действием на сопутствующие микроорганизмы и не вызывают выраженного угнетающего действия на микобактерии, повышая достоверность выявления микобактерий туберкулеза из воздушной среды.

Диаметр поролоновой пластины, равный диаметру чашки Петри, и ее толщина 4-6 мм выбраны из условия полного впитывания обрабатывающего раствора фосфорнокислого натрия трехзамещенного.

Способ выявления микобактерий туберкулеза из воздушной среды осуществляют следующим образом.

Отбор пробы воздуха осуществляется путем направленного ударного действия струи воздуха с помощью аппарата ПУ-1Б на поролоновую пластину толщиной 5 мм, смоченную в 5 мл 5%-ного раствора фосфорнокислого натрия трехзамещенного, помещенную в чашки Петри. Форма поролоновой пластины точно соответствует внутреннему размеру чашки Петри. Объем исследуемой пробы воздуха - 250 литров (переключатель «250»). При переносе прибора из одного помещения в другое рабочую поверхность дезинфицируют 70% спиртом. Прибор устанавливают на высоте 1,0 м от пола (зона дыхания сидящего или лежащего человека) в геометрическом центре палаты. После забора проб воздуха чашки Петри доставляют в лабораторию. Пробы вместе с содержимым инкубируют в термостате в течение 18-24 ч, затем пробы аккуратно переносятся путем отжима поролоновых пластин по центрифужным пробиркам (для каждой пробы своя пробирка) и центрифугируют исследуемый материал при скорости 2000 оборотов в 1 мин в течение 20 мин, пипеткой отсасывают надосадочную жидкость, осадок нейтрализуют 1%-ным раствором лимонной кислоты (в соотношении 1:1) и засевают в пробирки с питательной средой "Новая" (для каждой пробы своя пробирка) и повторно инкубируют до появления роста.

Данным способом был проведен отбор проб воздуха в экспериментальных условиях и в терапевтическом отделении ГБУЗ СО «Противотуберкулезный диспансер». Аналогичные результаты были получены при толщине поролоновой пластины 4 мм и 6 мм, смоченной, соответственно в 4 и 6 мл 5% раствора фосфорнокислого натрия трехзамещенного.

В условиях эксперимента было выполнено 120 исследований. В качестве модели загрязнения воздушной среды использовали суспензии М. smegmatis и лабораторного штамма H37Ra, приготовленные по 10 стандарту мутности ГКИ в разведениях: 10 стандарт (10⁹), 10², 10¹, 10^-1, 10^-2 микробных клеток/мл. Полученные суспензии распыляли в закрытой камере объемом 1,7 м³ с помощью флакона-распылителя с экспозицией 60 минут.

Данные по результатам исследования в эксперименте представлены в таблицах 2,3.

В таблице 2 представлена сравнительная оценка выявления М. smegmatis способом, описанным в патенте РФ №2221047 и предложенным способом

Проведенные исследования показали, что при распылении в камере взвеси аэрозоля микобактерий M.smegmatis в концентрации 10⁹ микробных тел/мл число выросших колоний на среде Левенштейна - Йенсена при использовании способа по патенту РФ №2221047 и заявляемого составило соответственно 20,0±1,1 и 28,0±1,1. При заявляемом способе на среде «Новая» выросло соответственно 21,0±1,1 и 35,0±1,3 колоний. При использовании способа по патенту РФ №2221047 рост микобактерий на питательных средах обнаруживался при распылении взвеси в концентрации 100 микробных клеток/мл, тогда как предложенный метод позволяет определить рост микобактерий на питательных средах при распылении взвеси в концентрации 10 микробных клеток/мл. Таким образом, при распылении в камере взвеси аэрозоля микобактерий M.smegmatis концентрации в 10⁹ микробных клеток/мл с использованием предложенного способа число выросших колоний на среде Левенштейна - Йенсена было в 1,4 раза больше, чем при использовании способа по патенту РФ №2221047 а на среде «Новая» - в 1,7 раза. В среднем, при использовании заявляемого способа для выявления микобактерий, в зависимости от используемой среды, достоверность выявления микобактерий из воздушной среды повысилась в 1,6 -1,7 раза.

В эксперименте со штаммом H₃₇Ra прослеживается та же закономерность. Результаты исследований представлены в таблице 3.

В таблице 3 представлена оценка эффективности выделения микобактерий H₃₇Ra способом, описанным в патенте РФ №2221047 и заявляемым способом.

Заявляемый способ позволяет определить рост микобактерий на питательных средах при распылении взвеси в концентрации 100 микробных клеток/мл. Проведенные исследования показали, что при распылении в камере взвеси аэрозоля в концентрации 10⁹ микробных тел/мл H₃₇Ra число выросших колоний на среде Левенштейна - Йенсена при использовании известного способа и заявляемого составило 14,0±1,1 и 25,0±1,1 соответственно. При использовании известного и предложенного способа на среде «Новая» выросло, соответственно, 16,0±1,1 и 38,0±1,3 колоний МБT. Используя способ, описанный в патенте РФ №2221047, получают рост микобактерий на питательных средах при распылении взвеси в концентрации 100 микробных клеток/мл, тогда как заявляемый способ позволяет определить рост микобактерий на питательных средах при распылении взвеси в концентрации 10 микробных клеток/мл.

Итак, при распылении в камере взвеси аэрозоля микобактерий H₃₇Ra концентрации 10⁹ микробных клеток/мл с использованием предложенного способа число выросших колоний на среде Левенштейна - Йенсена было в 2,08 раза больше, чем при использовании известного способа, а на среде «Новая» - в 2,38 раза. В среднем, при использовании предложенного способа достоверность выявления микобактерий из воздушной среды, в зависимости от используемой питательной среды, повысилась в 1,3-1,8 раза.

Таким образом, проведенные исследования по выявлению загрязнения микобактериями воздушной среды с использованием способа по патенту РФ №2221047 и заявляемого способа показали, что достоверность выявления микобактерий из воздушной среды (аспирационным методом) повышается почти в 2 раза при использовании заявляемого способа. Вместе с тем, заявляемый способ позволяет выявить микобактерий при их меньших концентрациях в воздухе, чего нельзя добиться способом по патенту РФ №2221047.

Результаты исследования воздушной среды в терапевтическом отделении ГБУЗ СО «Противотуберкулезный диспансер» представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, результаты исследования в терапевтическом отделении ГБУЗ СО «Противотуберкулезный диспансер» подтверждают ту же тенденцию, что и в случае проб воздуха, из 15 параллельно взятых проб воздуха положительные результаты зафиксированы в 13 случаях, используя заявляемый способ, и в 9 случаях по способу, предложенному в патенте РФ №2221047.

Таблица 4 № п/п Объект исследований Рост колоний M.tuberculosis Заявляемый способ Способ по патенту РФ №2221047 1. Ординаторская - - 2. Кабинет старшейм/с - - 3. Процедурный кабинет. Зона проведения в/м инъекций + - 4. Процедурный кабинет. Зона проведения в/в инъекций + - 5. Палата №1 + - 6. Палата №3 + + 7. Палата №5 + + 8. Палата №9 + + 9. Палата №10 + + 10. Палата №13 + + 11. Палата №15 + + 12. Пост м/с + - 13. Коридор + + 14. Коридор + + 15. Туалет + +

Предложенный способ достоверен, прост, доступен, эффективен и позволяет провести отбор около 20 проб воздуха за 1 час.

Заявляемый способ выделения МБТ из воздушной среды может найти применение для контроля эффективности дезинфекции воздуха в противотуберкулезных учреждениях, а также для обнаружения МБТ в воздухе тех лечебно-профилактических учреждений, куда по тем или иным причинам госпитализируются больные туберкулезом до перевода в специализированный стационар.

Изобретение относится к микробиологии и предназначено для обнаружения микобактерий туберкулеза в воздушной среде помещений лечебно-профилактических учреждений. Способ предусматривает отбор пробы воздуха путем направленного ударного действия струи на расположенную в чашке Петри поролоновую пластину, смоченную в 4-6 мл 5% раствора фосфорнокислого натрия трехзамещенного с последующим инкубированием чашки Петри с поролоновой пластиной в течение 18-24 часов. Центрифугирование исследуемого материала с последующим отделением надосадочной жидкости и нейтрализацией осадка 1%-ным раствором лимонной кислоты в соотношении 1:1 с последующим посевом нейтрализованного осадка на питательную среду «Новая» и культивированием до появления роста. При этом диаметр пластины из поролона равен диаметру дна чашки Петри, а ее толщина составляет 4-6 мм. Изобретение позволяет повысить достоверность выявления микобактерий из воздушной среды. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ выявления микобактерий туберкулеза из воздушной среды, предусматривающий отбор пробы воздуха путем направленного ударного действия струи на расположенную в чашке Петри поролоновую пластину, смоченную 4-6 мл 5%-ного раствора фосфорнокислого натрия трехзамещенного, инкубирование в течение 18-24 ч, центрифугирование с последующим отделением надосадочной жидкости, нейтрализацию осадка 1%-ным раствором лимонной кислоты в соотношении 1:1 и посев на питательную среду «Новая».

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что диаметр пластины из поролона равен диаметру дна чашки Петри, а толщина ее составляет 4-6 мм.