ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЕТИДОВ И ДРУГИХ ПРИРОДНЫХ ПРОДУКТОВ Российский патент 2011 года по МПК C07D498/18 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен аналог 17-десметилрапамицина, имеющий структуру, представленную в формуле изобретения, или его фармацевтически приемлемое производное.

Также изобретение относится к способам получения и выделения аналога 17-десметилрапамицина. Аналоги 17-десметилрапамицина применяют в приготовлении медикамента для лечения рака. Также предложена фармацевтическая композиция на основе аналогов 17-десметилрапамицина для лечения рака и аутоиммунных нарушений. Получаемые соединения являются более стабильными в растворе, более устойчивы к метаболической атаке и обладают улучшенной биодоступностью. 8 н. и 17 з.п. ф-лы, 8 ил., 8 табл.

1. Аналог 17-десметилрапамицина, имеющий следующую формулу:

где x представляет -СН₂-;
R₁ представляет =O или (Н,Н);
R₂ представляет ОН или ОМе;
R₃ представляет Н, ОН или ОМе;
R₄ представляет структурный фрагмент, выбранный из группы С,

в котором волнистая линия указывает на положение присоединения фрагмента,
R₇ представляет Н или ОН, и
R₈ представляет Н, ОН, или галоген;
R₅ и R₆ каждый является Н,
или его фармацевтически приемлемое производное.

2. Соединение по п.1, где R₄ представляет структурный фрагмент С, как определено в п.1, где R₇ представляет Н или ОН и R₈ представляет Н, ОН, Сl или F.

3. Соединение по п.2, где R₄ представляет структурный фрагмент C(i)

где R₇ представляет Н или ОН и R₈ представляет Н, ОН, или галоген.

4. Соединение по п.1, где, когда R₅ представляет ОН, тогда R₆ представляет Н, и когда R₆ представляет ОН, тогда R₅ представляет Н.

5. Соединение по п.1, где R₂ представляет ОН.

6. Соединение по п.1, где R₁ представляет (Н, Н), R₂ представляет ОН, R₃ представляет Н, R₄ представляет структурный фрагмент C(i), как определено в п.3, за исключением того, что R₇ и R₈ оба представляют ОН, и x представляет СН₂.

7. Соединение по п.1, где R₁ представляет (Н, Н), R₂ представляет ОН, R₃ представляет Н, R₄ представляет структурный фрагмент C(i), как определено в п.3, за исключением того, что R₇ и R₈ оба представляют Н, и x представляет СН₂.

8. Соединение по п.1, где R₁ представляет (Н, Н) или =O, R₂ представляет ОН или ОМе, R₃ представляет ОН или ОМе, R₄ представляет структурный фрагмент C(i), как определено в п.3, за исключением того, что R₇ представляет ОН и R₈ представляет Н или ОН, и x представляет СН₂.

9. Соединение по п.1, где R₁ представляет =O, R₂ представляет ОН или ОМе, R₃ представляет Н, ОН или ОМе, R₄ представляет структурный фрагмент C(i), как определено в п.3, за исключением того, что R₇ представляет ОН и R₈ представляет F или Сl, и x представляет СН₂.

10. Соединение по п.1, где R₁ представляет =O, R₂ представляет ОН, R₃ представляет ОМе, R₄ представляет структурный фрагмент C(i), как определено в п.3, за исключением того, что R₇ представляет ОН и R₈ представляет Н, и x представляет СН₂.

11. Соединение по п.1, где R₁ представляет =O, R₂ представляет ОН, R₃ представляет ОН, R₄ представляет структурный фрагмент C(i), как определено в п.3, за исключением того, что R₇ представляет ОН и R₈ представляет Н, и x представляет СН₂.

12. Соединение по п.1, где R₁ представляет =O, R₂ представляет ОН, R₃ представляет ОМе, R₄ представляет структурный фрагмент C(i), как определено в п.3, за исключением того, что R₇ представляет ОН, и x представляет СН₂.

13. Соединение по любому из пп.1-12 для применения при лечении рака.

14. Применение соединения по любому из пп.1-12 в приготовлении медикамента для лечения рака.

15. Фармацевтическая композиция для лечения рака и аутоиммунных нарушений, включающая соединение по любому из пп.1-12 и фармацевтически приемлемый носитель.

16. Способ получения аналога 17-десметилрапамицина по п.1, где упомянутый способ включает:
(а) замену метилмалонил-КоА-специфичного АТ-домена модуля 10 PKS рапамицина малонил-КоА-специфичным АТ-доменом;
(б) экспрессию рекомбинантной PKS рапамицина в клетке-хозяине, выбранной из S. hygroscopicus, S. hygroscopicus sp., S. hygroscopicus var. ascomyceticus, Streptomyces tsukubaensis, Streptomyces coelicolor, Saccharopolyspora erythraea, Amycolatopsis mediterranei и Actinoplanes sp. N902-109;
(в) культивацию клетки-хозяина в таких условиях, когда продуцируется 17-десметилрапамицин или его аналог, включая при необходимости снабжение экзогенными предшественниками, где экзогенные предшественники выбирают из циклогексанкарбоновой кислоты, 3-метилциклогексанкарбоновой кислоты, 3,4-дигидроксициклогексанкарбоновой кислоты, циклогептанкарбоновой кислоты, 3-фтор-4-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты, 4-фтор-3-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты, 3-хлор-4-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты и 4-хлор-3-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты;
(г) при необходимости выделение соединения, продуцированного таким способом.

17. Способ по п.16, где метилмалонил-КоА-специфичный АТ-домен модуля 10 заменен малонил-КоА-специфичным АТ-доменом из кластера рапамицина.

18. Способ по п.17, где малонил-КоА-специфичный АТ-домен выбирают из кластера рапамицина.

19. Способ по п.18, где малонил-КоА-специфичный АТ-домен происходит из модуля 2 рапамицина.

20. Способ по любому из пп.16-19, где способ включает дополнительные этапы:
(а) выделение АТ-мишени, подлежащего введению как единого фрагмента ДНК с подходящими фланкирующими участками связывания рестриктаз,
(б) амплификацию и выделение районов последовательности ДНК, гомологичных фланкирующим последовательностям АТ-мишени, с использованием подходящих участков связывания рестриктаз,
(в) лигирование вместе трех фрагментов ДНК, описанных в (а) и (б), с получением в фазе с рамкой считывания последовательности левосторонней (LHS) гомологии с последующим донорным АТ-доменом с последующей правосторонней (RHS) гомологией,
(г) введение полной последовательности из (в) в вектор для введения в клетку-хозяина для получения конечной плазмиды, где упомянутая плазмида включает:
(I) oriT для конъюгации,
(II) один или более маркеров устойчивости,
(III) чувствительный к температуре ориджин репликации, так что интегранты можно будет отбирать путем культивации при 37°С и
(IV) ориджин репликации Е. coli,
(д) трансформацию клетки-хозяина путем конъюгации с применением конечной плазмиды, как описано в (г) выше,
(е) отбор трансформированных клеток по устойчивости к соответствующему антибиотику,
(ж) получение первичных интегрантов путем культивации при 37°С с селекцией с помощью антибиотиков,
(з) скрининг вторичных рекомбинантов путем выращивания в отсутствие антибиотика, также при 37°С,
(и) идентификацию нужного штамма по способности продуцировать целевой продукт и
(к) при необходимости подтверждение генетики штамма с помощью стандартных способов.

21. Способ по п.16, в котором клетку-хозяина выбирают из S.hygroscopicus MG7-9, S. hygroscopicus MG2-10, Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491, S. hygroscopicus NCIMB 40319, S. hygroscopicus ATCC29253, Actinoplanes sp. N902-109, Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475 ATCC 14891, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678 ATCC 55087, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA6678, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 55276, Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC 14891, Streptomyces tsukubaensis No.9993 FERM BP-927, Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. DSM 4137, Streptomyces sp DSM 7348, Micromonospora n.sp. A92-306401 DSM 8429, Streptomyces sp MA6858 ATCC 55098, Actinoplanes sp. N902-109 FERM BP-3832, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 55276.

22. Способ получения аналога 17-десметилрапамицина, где упомянутый способ включает:
(а) получение рекомбинантного штамма, содержащего биосинтетический кластер, который кодирует рекомбинантную поликетидсинтазу рапамицина, в котором метилмалонил-КоА-специфичный АТ-домен модуля 10 PKS рапамицина заменен малонил-КоА-специфичным АТ-доменом, и
(б) подачу неприродных исходных кислот культуре упомянутого рекомбинантного штамма в условиях, подходящих для продукии поликетида, где неприродные исходные кислоты выбирают из циклогексанкарбоновой кислоты, 1-циклогексенкарбоновой кислоты, 3-циклогексенкарбоновой кислоты, 3-метилциклогексанкарбоновой кислоты, циклогептанкарбоновой кислоты, (1R*, 3R*, 4R*)-3,4-дигидроксициклогексанкарбоновой кислоты, этилового эфира (1R*, 5R*)-5-гидроксициклогекс-3-енкарбоновой кислоты, этилового эфира (1R*, 4R*)-3-фтор-4-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты, 3-(цис/транс)-метилциклогексанкарбоновой кислоты, 4-фтор-3-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты, 3-хлор-4-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты и 4-хлор-3-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты.

23. Способ получения аналога 17-десметилрапамицина, где упомянутый способ включает:
(а) получение рекомбинантного штамма, содержащего биосинтетический кластер, который кодирует рекомбинантную поликетидсинтазу рапамицина, в котором метилмалонил-КоА-специфичный АТ-домен модуля 10 PKS рапамицина заменен малонил-КоА-специфичным АТ-доменом,
(б) дополнительно, удаление или инактивацию одного или более из вспомогательных генов рапамицина, выбранных из rapI, rapJ, rapK, rapL, rapM, rapN, rapO и rapQ, и
(в) культивирование штамма, полученного таким образом, при необходимости, в присутствии экзогенного предшественника, если требуется, для получения аналога 17-десметилрапамицина.

24. Способ получения аналога 17-десметилрапамицина, где упомянутый способ включает:
(а) получение рекомбинантного штамма, содержащего биосинтетический кластер, который кодирует рекомбинантную поликетидсинтазу рапамицина, в котором метилмалонил-КоА-специфичный АТ-домен модуля 10 PKS рапамицина заменен малонил-КоА-специфичным АТ-доменом,
(б) дополнительно, удаление или инактивацию одного или более из вспомогательных генов рапамицина, выбранных из rapI, rapJ, rapK, rapL, rapM, rapN, rapO и rapQ,
(в) повторное введение всех или части вспомогательных генов рапамицина in-trans для комплементации или для частичной комплементации делеции,
(г) культивацию штамма, полученного таким образом, при необходимости, в присутствии экзогенного предшественника, если требуется, для получения аналога 17-десметилрапамицина.

25. Способ получения аналога 17-десметилрапамицина, где упомянутый способ включает:
(а) получение рекомбинантного штамма, содержащего биосинтетический кластер, который кодирует рекомбинантную поликетидсинтетазу рапамицина, в котором метилмалонил-КоА-специфичный АТ-домен модуля 10 PKS рапамицина заменен малонил-КоА-специфичным АТ-доменом,
(б) дополнительно, удаление или инактивацию одного или более из вспомогательных генов рапамицина, выбранных из rapI, rapJ, rapK, rapL, rapM, rapN, rapO и rapQ,
(в) при необходимости повторное введение всех или части вспомогательных генов in-trans для комплементации или для частичной комплементации делеции,
(г) подачу неприродных исходных кислот упомянутому рекомбинантному штамму в условиях, подходящих для продукции поликетидов, где неприродные исходные кислоты выбирают из циклогексанкарбоновой кислоты, 1-циклогексенкарбоновой кислоты, 3-циклогексенкарбоновой кислоты, 3-метилциклогексанкарбоновой кислоты, циклогептанкарбоновой кислоты, (1R*, 3R*, 4R*)-3,4-дигидроксициклогексанкарбоновой кислоты, этилового эфира (1R*, 5R*)-5-гидроксициклогекс-3-енкарбоновой кислоты, этилового эфира (1R*, 4R*)-3-фтор-4-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты, 3-(цис/транс)-метилциклогексанкарбоновой кислоты, 4-фтор-3-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты, 3-хлор-4-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты и 4-хлор-3-гидроксициклогексанкарбоновой кислоты.