СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО ПРЕПАРАТА ИЗ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS С РАСШИРЕННЫМ СПЕКТРОМ СЕРОПОЗИТИВНЫХ ФРАКЦИЙ В РЕАКЦИИ ИММУНОБЛОТИНГА Российский патент 2011 года по МПК C12P21/00 A61K39/04 

Изобретение относится к области медицины и касается способа получения антигенов из Mycobacterium tuberculosis с целью использования их в диагностике туберкулеза методом иммуноблотинга. Результат изобретения может быть использован в клинической лабораторной диагностике, а также иммунологических и микробиологических исследованиях.

Туберкулез представляет собой важную социально-экономическую и медицинскую проблему во всем мире. Анализ сложившейся эпидемиологической ситуации показывает, что заболеваемость туберкулезом в нашей стране носит характер эпидемии [1, 2, 3, 4]. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в промежутке времени с 2000 по 2020 гг. туберкулезом в мире заболеет около 200 млн. человек, умрет около 35 млн. человек, будет инфицирован приблизительно 1 млрд. человек [5]. В связи с этим, одной из важных задач мировой медицины является разработка надежных (эффективных и специфических), простых в использовании, методов для быстрой диагностики туберкулеза.

Следует отметить, что диагностика туберкулеза весьма сложна. Обязательный диагностический минимум включает обследование с использованием физикальных, рентгенологических, микроскопических и бактериологических, а также иммунологических методов, методов туберкулиновых проб, клинических анализов крови и мочи.

В нашей стране при диагностике туберкулеза большое внимание уделяется культуральным методам. Однако культивирование с момента посева занимает 2-8 недель [6], что является существенным недостатком. Другим недостатком служит низкая эффективность диагностики, выявляющей не более 14% больных [7, 8]. За рубежом большее внимание уделяют микроскопии мазков (флуоресцентный метод). Однако и в этом случае наблюдается лишь 14% положительных результатов [9]. До недавнего времени наиболее чувствительными и широко применяемыми методами для выявления антител к Mycobacterium tuberculosis являлись реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) по Бойдену, агрегатагглютинации (РАГА), связывания комплемента (РСК). Используются для постановки диагноза и такие тесты, как иммунофлуоресценция, радиоиммунодиффузия и иммуноферментный анализ (ИФА).

Фактически серологические методы наиболее удобны для клинической и эпидемиологической работы в диагностике туберкулеза, так как для анализа используется легко доступный клинический материал: сыворотка или плазма крови человека. Однако эти методы, включая метод ИФА, не обладают достаточной диагностической чувствительностью [10]. Так, при использовании препарата, выделенного из клеточных стенок микобактерий H37Rv и содержащего антиген с молекулярной массой 38-42 кДа, противотуберкулезные антитела (ПТАТ) были выявлены только у 76,7% больных туберкулемой и у 70,0% больных инфильтративным туберкулезом [11]. При использовании антигенного комплекса с молекулярной массой 45/47 кДа чувствительность метода составила 40% [12].

На использованных в недавнем прошлом антигенных препаратах у лиц с установленным диагнозом - туберкулез, противотуберкулезные антитела (ПТАТ) обнаруживаются в 100% случаях только при фиброзно-кавернозном туберкулезе и при бактериовыделении (13). Однако пациенты с фиброзно-кавернозной формой заболевания составляют очень небольшую часть от общего количества больных туберкулезом. При очаговом туберкулезе ПТАТ обнаруживают только в 31% случаев, а при туберкулезе бронхов в 15,5% случаев [13]. Таким образом, по данным 2007 г. [14], ПТАТ выявляют у больных туберкулезом в среднем в 71% случаев.

При использовании отдельных рекомбинантных антигенов Mycobacterium tuberculosis, выявляемость ПТАТ в сыворотках больных туберкулезом, за исключением ВИЧ инфицированных пациентов, также невысока - около 60% [15]. Есть сведения, что использование набора значительного количества рекомбинантных антигенов приводило к улучшению результата: ПТАТ выявляли у 93% больных туберкулезом [16, 17]. Однако поскольку нет ясности в вопросе, у пациентов с какой формой туберкулеза обнаруживали такой высокий процент ПТАТ, трудно оценить достоверность этих данных.

Кроме этого, важно подчеркнуть, что в настоящее время ни один из существующих антигенных препаратов не позволяет получить какую-либо приемлемую картину антителогенеза при инфицировании Mycobacterium tuberculosis, тогда как заявленный антигенный препарат обеспечивает возможность проведения исследований антителогенеза.

Цель настоящего изобретения заключалась в разработке способа получения антигенного препарата из Mycobacterium tuberculosis, который отличался бы высокой специфичностью и активностью, и позволял бы получать информацию о формировании гуморального ответа на внедрение возбудителя.

Наиболее близким по совокупности признаков и достигаемому результату к заявленному техническому решению является способ получения антигенов [18], растворимых в изотоническом растворе хлорида натрия. Этот способ включает культивирование Mycobacterium tuberculosis на среде Левенштейна-Йенсена, трехкратную отмывку от остатков питательной среды забуференным физраствором (ЗФР), рН 7,2, получение бактериальной массы в виде порошка путем трехкратной обработки неразбавленным ацетоном и затем эфиром и последующего высушивания. Затем 40 мг высушенной биомассы вносят в 10 мл изотонического раствора хлорида натрия, 30 минут интенсивно встряхивают, после чего инкубируют 24 ч при комнатной температуре, центрифугируют 20 мин при 9000 об/мин, проводят аспирацию надосадочной жидкости. Далее полученный материал используют в качестве антигенного препарата в серологических реакциях.

В исследованиях сывороток методом иммуноблотинга этот материал неприемлем из-за низкой доли специфических, значимых для диагностики туберкулеза антигенов и слишком высокого содержания балластного материала, что является существенным недостатком рассмотренного способа получения антигенов. К отмеченному недостатку, вероятно, приводит обработка бактериальных клеток неразбавленным ацетоном, затем эфиром и последующее высушивание, в результате чего происходит усиленное разрушение липидов мембранных комплексов и, как следствие этого, облегченная экстракция (изотоническим раствором) внутриклеточного материала.

Указанный недостаток отсутствует в заявленном техническом решении, которое отличается от прототипа тем, что отмытую клеточную массу суспендировали 1-3 мин сначала в 25% водном растворе ацетона, затем, отделив центрифугированием, - в 50% водном растворе ацетона.

Далее заявленное техническое решение реализуется следующим образом, собранный центрифугированием осадок суспендировали 15 мин в 5-10 об./% водном растворе диметилсульфоксида (ДМСО), затем обработанные клетки собирали центрифугированием и подвергали аналогичной процедуре, последовательно используя 11-15 об./% и 16-20 об./% водные растворы ДМСО. Полученные супернатанты объединяли и освобождали от ацетона и ДМСО исчерпывающим диализом против дистиллированной воды. Далее полученный диализат использовали в качестве антигенного препарата в реакции иммуноблотинга. Для этого препарат фракционировали электрофоретическим методом в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (19) и иммобилизовали антигенные фракции на нитроцеллюлозной мембране в соответствии с рекомендациями (20).

Заявленный материал поясняется следующими примерами.

Пример 1. Mycobacterium tuberculosis «штамм Академия» из коллекции Государственного института стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича (г.Москва), выращивали 30 дней на среде Левенштайна-Йенсена при 37°С. Микобактерии смывали с поверхности питательной среды забуференным физиологическим раствором (ЗФР), рН 7,2, осаждали центрифугированием и трижды отмывали от остатков питательной среды ЗФР, отделяя клетки центрифугированием. Отмытую бактериальную массу трехкратно обрабатывали ацетоном, затем эфиром, отделяя клетки центрифугированием, и высушивали. 40 мг высушенной биомассы вносили в 10 мл изотонического раствора хлорида натрия, 30 мин интенсивно встряхивали, инкубировали 24 ч при комнатной температуре, центрифугировали 20 мин при 9000 об/мин и проводили аспирацию надосадочной жидкости.

В результате получили антигенный препарат, содержащий примерно в одинаковых количествах около 20 белковых фракций, молекулярная масса которых варьировала в диапазоне 10-100 кДа (Фиг.1а). Иммуносорбент, приготовленный на основе полученного антигенного препарата в реакции с сыворотками пациентов с подтвержденным диагнозом - туберкулез, выявлял от 2 до 7 серопозитивных фракций (Фиг.1б).

Пример 2.

Mycobacterium tuberculosis «штамм Академия» из коллекции Государственного института стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича (г.Москва), выращивали 30 дней на среде Левенштайна-Йенсена при 37°С. Микобактерии смывали с поверхности питательной среды забуференным физиологическим раствором (ЗФР), рН 7,2, осаждали центрифугированием и трижды отмывали от остатков питательной среды ЗФР, отделяя клетки центрифугированием.

Клеточную массу суспендировали 2 мин сначала в 25% водном растворе ацетона, отделяли центрифугированием, затем 2 мин в 50% водном растворе ацетона. Собранный центрифугированием осадок суспендировали 15 мин в 7 об./% водном растворе ДМСО, бактериальные клетки собирали центрифугированием и подвергали аналогичной процедуре, последовательно используя 13 об./% и 18 об./% водные растворы ДМСО с последующим освобождением от бактериальной взвеси. Супернатанты объединяли и подвергали исчерпывающему диализу против дистиллированной воды.

Полученный антигенный препарат, как было установлено электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия, содержал около 30 белковых фракций с диапазоном молекулярных масс 4-100 кДа (Фиг.2а).

Иммуносорбент, приготовленный на основе полученного антигенного препарата в реакции с сыворотками содержащими ПТАТ, выявил более 20 серопозитивных фракций в сыворотках 24 больных туберкулезом (Фиг.2б).

Обращает на себя внимание весьма разнородный спектр серопозитивных фракций и это при том, что все 24 индивидуальные сыворотки пациентов с установленным диагнозом - туберкулез исследовались на иммуносорбенте одной серии. Полагаем, что полученная картина является отражением данных о чрезвычайно индивидуальном иммунном ответе организма на туберкулезную инфекцию (ссылки).

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна» предъявляемому к изобретениям, т.к. заявленная совокупность признаков и достигаемый технический результат не выявлен из исследованного уровня техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, т.к. оно не является очевидным для специалиста в данной области техники вследствие того, что до даты подачи настоящей заявки в исследованной области науки отсутствуют препараты, обладающие широким спектром серопозитивных фракций в реакции иммуноблотинга, полученных известными методами, тогда как дробное фракционирование, разработанное в заявленном техническом решении, обеспечивает получение антигенного(х) препарата(ов), который(е) в реакции с сыворотками, содержащими ПТАТ, выявляют более 20 серопозитивных фракций в сыворотках, например, 24 больных туберкулезом (Фиг.2б), при этом обращает на себя внимание весьма разнородный спектр серопозитивных фракций и это при том, что все 24 индивидуальные сыворотки пациентов с установленным диагнозом - туберкулез исследовались на иммуносорбенте одной серии. Полагаем, что полученная картина является отражением данных о чрезвычайно индивидуальном иммунном ответе организма на туберкулезную инфекцию (ссылки).

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. заявленное техническое решение апробировано в диагностической лаборатории республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями, результаты практических анализов представлены на Фиг.1а,б и Фиг.2а,б.

Изобретение относится к области медицины для диагностики туберкулеза и изучения гуморального иммунного ответа в реакции иммуноблотинга. Способ получения антигенного препарата из Micobacterium tuberculosis включает культивирование микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена, трехкратную промывку бактериальных клеток от остатков питательной среды. Отмытую бактериальную массу обрабатывают водными растворами ацетона с концентрацией 25% и 50%, причем после каждой обработки ацетоном клетки осаждают центрифугированием. Далее для получения экстрактов, содержащих антиген, осажденную центрифугированием бактериальную массу последовательно трижды обрабатывают водными растворами диметилсульфоксида с возрастающими концентрациями последнего от 5% до 20%, при этом каждый раз отделяют нерастворимую фракцию центрифугированием. Полученные три порции диметилсульфлксид-экстрактов объединяют и подвергают исчерпывающему диализу против дистиллированной воды. Полученный раствор используют в качестве антигенсодержащего материала для приготовления иммуносорбента на основе нитроцеллюлозной мембраны. Антигенный препарат по изобретению обладает расширенным спектром серопозитивных фракций в реакции иммуноблотинга. 4 ил.

Способ получения антигенного препарата из Mycobacterium tuberculosis, включающий культивирование Mycobacterium tuberculosis на среде Левенштейна-Йенсена, 3-кратную промывку бактериальных клеток от остатков питательной среды, отличающийся тем, что отмытую от остатков питательной среды бактериальную массу Mycobacterium tuberculosis обрабатывают водными растворами ацетона с концентрацией 25% и 50%, осаждают клетки после каждой обработки центрифугированием и далее для получения экстрактов выделенную центрифугированием бактериальную массу последовательно трижды обрабатывают водными растворами диметилсульфоксида с возрастающими концентрациями последнего от 5% до 20%, отделяя каждый раз нерастворимую фракцию центрифугированием, далее полученные три диметилсульфоксид-экстракта объединяют и после исчерпывающего диализа против дистиллированной воды получают антигенный препарат.