Способ получения антигена из Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201 молекулярной массой 24 кДа для изучения гуморального иммунного ответа Российский патент 2024 года по МПК C12N1/00 A61K39/04 G01N33/531 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской и ветеринарной иммунологии, а именно к лабораторной диагностике, и касается получения антигенов Mycobacterium bovis, которые в совокупности могут быть использованы в качестве биомаркеров при создании диагностической панели наиболее информативных микобактериальных антигенов, а также для изучения гуморального иммунного ответа на различных стадиях инфекционного процесса, который поможет составить диаграмму В-клеточного иммунного ответа к основным биомаркерам (антигенам) Mycobacterium bovis Bovinus-8 на модели штамма 700201, что позволит определять длительность процесса инфицирования.

Туберкулез крупного рогатого скота - хроническое инфекционное заболевание, вызывающее большие потери в животноводстве, поражающее широкий спектр млекопитающих-хозяев, включая людей.

Основным возбудителем туберкулеза крупного рогатого скота является Mycobacterium bovis, который может преодолевать видовой барьер и вызывать туберкулез у людей и других млекопитающих. Туберкулез представляет серьезную опасность для здоровья людей, в частности, как для обслуживающего персонала, так и для потребителей продуктов животноводства (мясо, молоко, молочные продукты). Общепринятым методом предотвращения распространения туберкулеза от животных к человеку является выбраковка животных на основании аллергической реакции замедленного типа на кожную туберкулиновой пробу ППД (Purified protein derivate - очищенный белковый дериват).

Несмотря на важность точных и быстрых диагностических тестов, традиционные методы, включая внутрикожные, обладают высоким уровнем ложноотрицательных результатов для крупного рогатого скота. В диагностике туберкулеза, как социально значимого и опасного заболевания, важна высокая точность результатов лабораторных диагностических исследований.

Общепринятый тест - «туберкулиновая проба» - является основой для начала исследований на туберкулез крупного рогатого скота. Однако данный метод имеет ряд недостатков, суть которых заключается в большом количестве ложных реакций. С одной стороны, это ложноотрицательные реакции - когда больное туберкулезом животное настолько истощено инфекцией что не может должным образом реагировать на туберкулиновую пробу, такое «больное» животное остается на ферме, являясь источником инфицирования здоровых животных, а естественные выделения инфицируют местную экосистему. С другой стороны, ложноотрицательные реакции - подобная ситуация чаще проявляется у животных с хорошим иммунитетом, высокой иммунологической реактивностью, высокими продуктивными качествами, реагирующих положительно животных подвергают диагностическому убою и дальнейшим исследованиям на туберкулез, чаще всего диагноз не подтверждается.

Разработка более специфических реагентов для диагностики инфекции М. bovis является по настоящее время актуальной. На сегодняшний день выявлен ряд микобактериальных белков. Некоторые из этих антигенов включают белок микобактерий: М. bovis 83 (МРВ83), представляющий основной антиген, экспрессируемый М. bovis, микобактериальный белок МРВ64, ранний секреторный антиген ESAT-6 и белок культурального фильтрата CFP-10. ESAT-6 и CFP-10 антигены вызывают Т-хелперный 1 (Th1) клеточный ответ, который высвобождает про воспалительные цитокины включая интерферон-γ (ИФН-γ).

Основанием для разработки методов серологической диагностики туберкулеза является тот факт, что при активации инфекции отмечается интенсивный синтез микобактериальных антигенов, являющихся активаторами запуска иммунокомпетентных клеток. Вариабельность антигенной структуры туберкулезных микобактерий на разных стадиях инфекционного процесса, наличие у него большого количества антигенов, а также вариабельная иммуногенность последних, служат объективными причинами того, что до настоящего времени не разработано ни одного серологического теста, обладающего настолько высокой чувствительностью, чтобы им можно было бы заменить или дополнить применяемые в настоящее время «устаревшие» методы прижизненной диагностики туберкулеза (Золотой стандарт: туберкулиновая проба, бактериологический посев). Во многих научных центрах мира активно ведутся поисковые работы по выявлению и выделению специфических туберкулезных антигенов.

Известен универсальный способ получения антигена для серологических реакций, применимый практически для всех возбудителей (см. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под редакцией М.О. Биргера, Москва: «Медицина». 1982 - с.464). Способ включает получение бактериальной взвеси в сухом виде путем троекратной обработки ацетоном, а затем эфиром и последующим высушиванием. Затем к 40 мг высушенной биомассы вносят 10 мл изотонического раствора хлорида натрия, 30 минут интенсивно встряхивают, после чего инкубируют 24 часа при комнатной температуре, центрифугируют 20 мин. при 9000 об/мин, сливают прозрачный центрифугат. Полученный экстракт используют в качестве антигенного препарата в серологических реакциях, а именно в реакции преципитации. В исследованиях сывороток больных методом иммуноблотинга этот материал малоэффективен из-за низкой доли специфических и значимых для диагностики туберкулеза антигенов, слишком высокого содержания балластного материала, что является существенным недостатком рассмотренного способа получения антигенов; обработка бактериальных клеток неразбавленным ацетоном, затем эфиром и последующее высушивание, в результате чего происходит деструктивное разрушение и вымывание липидов мембранных комплексов и, как следствие этого, облегченная экстракция (изотоническим раствором) клеточного материала.

Наиболее близким по совокупности признаков и достигаемому результату к заявленному техническому решению является способ получения антигена из Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201 молекулярной массой 28 кДа для изучения гуморального иммунного ответа (Патент RU 2691586, МПК C12N 1/00, опубл. 14.06.2019 Бюл. №17), включающий культивирование возбудителя на твердой питательной среде Левенштейна-Йенсена, разрушение отмытых клеток и фракционирование препаративным электрофорезом, причем отмытые клетки трижды подвергают разрушению в гомогенизаторе Fast Prep 24 в течение 45 сек при скорости вибрации 6,5 мс, удаляют разрушенные клетки с помощью центрифугирования при 7000 об/мин, выдерживают супернатант при +4-6°С в течение 10 дней, повторно удаляют спонтанный осадок центрифугированием, добавляют к супернатанту лизирующий буфер, содержащий 0,2% додецилсульфата натрия, 0,1% 2-меркаптоэтанола, выдерживают пробы при 100°С 10 минут, фракционируют на колонке, с использованием 9% полиакриамидного геля. Представленный способ взят за прототип.

Недостатком известного способа является использование одного маркера, что не позволяет наиболее полно поставить диагноз «туберкулез», данный антиген может только дополнить панель маркерных белков для диагностики туберкулеза в связи с гетерогенностью иммунного ответа со стороны иммунной системы, что определяется презентацией макрофагами различных структур микобактерий В-клеткам.

Цель заявляемого изобретения заключается в разработке способа получения антигена молекулярной массой 24 кДа из Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201, который обладал бы высокой специфичностью и активностью, позволил бы наиболее полно расширить достоверность лабораторной диагностики туберкулеза, а также дополнил диагностическую панель биомаркеров, как для изучения гуморального иммунного ответа, так и для конструирования иммунологических тестов.

Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе получения одного, единичного антигена из Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201, молекулярной массой 24 кДа, включающий культивирование возбудителя на твердой питательной среде Левенштейна-Йенсена в течение 45-60 суток, промывку клеток от остатков питательной среды, ультразвуковое диспергирование клеточных конгломератов, разрушение отмытых клеток на гомогенизаторе Fast Prep 24 в режиме: скорость вибрации - 6,5 мл/с, продолжительность 60 с, повторность 3 раза, с последующим удалением разрушенных клеток и трехкратной промывкой разрушенных клеток, объединением супернатантов отмытых клеток, осветляющим центрифугированием при 10000 об/мин, добавлением к последнему раствора (лизирующий буфер), содержащего 0,1% додецилсульфата натрия, 0,1% 2-меркаптоэтанола, выдерживанием при температуре 100°С, фракционированием на колонке, с использованием в качестве неподвижной фазы полиакриламидный гель, содержащий 0,1% додецилсульфата натрия, оценку серологической активности в реакции иммуноблотинга, объединения фракций с молекулярной массой 24 кДа по результатам последнего.

Заявляемое изобретение поясняется графическим материалом, где изображено:

Фиг. 1 - гистограмма препаративного фракционирования исходного материала супернатанта разрушенных на гомогенизаторе Fast Prep 24 клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201. Данные получены при помощи увикорда UV 1 и самописца Recoder model 102.

Фиг. 2 - результаты иммуноблотинга фракций, полученных после препаративного электрофореза в 10% полиакриламидном геле. Для выявления серологической активности фракций использовали гипериммунную сыворотку кролика, полученную к цельным клеткам Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201.

Пробы: 1-исходная проба до препаративного фракционирования; 2-фракция №1; 3-фракция №2; 4-фракция №3; 5-фракция №4; 6-фракция №5; 7-фракция №6; 8-фракция №7; 9-фракция №8; 10-фракция №9; 11-фракция №10; 12-фракция №11; 13-фракция №12; 14-фракция №13; 15-фракция №14; 16-фракция №15; 17-фракция №16; 18-фракция №17; 19-фракция №18; 20-фракция №19; 21-фракция №20; 22-фракция №21; 23-фракция №22; 24-фракция №23; 25-фракция №24; 26-фракция №25; 27-фракция №26; 27-фракция №26; 28-фракция №27; М-маркер молекулярных масс Bio-Rad 250-10 кДа Precision Plus Protein™ Standart Dual Color.

Фиг. 3 - гистограмма препаративного фракционирования и результаты иммуноблотинга с гипериммунной сывороткой кролика, полученной к цельным клеткам Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201.

Фиг. 4 - результаты иммуноблотинга в виде денситограмм фракций с 16 по 27. Обозначения А - денситограммы фракций с 16 по 27; Б - денситограммы фракций с 25 по 27, красной линией обозначена зона молекулярной массы 24 кДа.

Фиг. 5 - результаты иммуноблотинга фракций, полученных после объединения. Для выявления серологической активности фракций использовали гипериммунную сыворотку кролика, полученную к цельным клеткам Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201. Обозначения: №1 - (с 1 по 4 фракции); №2 - (с 5 по 12 фракции); №3 - (с 13 по 17 фракции); №4 - (с 18 по 21 фракции); №5 - (с 22 по 23 фракции); №6 - (с 24 по 25 фракции); №7 - (с 26 по 27 фракции); №8 - (с 29 по 29 фракции); №9 - (с 30 по 32 фракции); №10 - (с 33 по 37 фракции); №11 - (с 38 по 42 фракции); №12 - (с 43 по 50 фракции); №13 - (с 51 по 8 фракции); №14 - (с 59 по 63 фракции); М-маркер молекулярных масс Bio-Rad 250-10 кДа Precision Plus Protein™ Standart Dual Color.

Фиг. 6 - график результатов ИФА: раститровка объединенных фракций №5, №6, №7, №8. К+ положительная сыворотка в разведении 1:100, К- отрицательная сыворотка в разведении 1:100.

Заявляемое техническое решение осуществляется следующим образом: отмытую клеточную массу, содержащую конгломерат клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201 разбивают легкой ультразвуковой дезинтеграцией 22 кГц в течение 5-10 секунд при амплитуде 95% на приборе SONICS Vibta Cells, модель VCX 130 (SONICS&MATERIAFS INC, USA) для получения однородной массы микобактерий, данная процедура позволяет экстрагировать структуры клеточной стенки, дополнительно обогащая клеточную суспензию легко солюбилизируемыми компонентами клеточной стенки, затем гомогенные клетки разрушают на приборе MP Biomedicals Fast Prep-24™ Instrument с использованием циркониевых шариков диаметром 0,1 мм (объем пробирок эппендорф - 2 мл). Режим обработки: скорость вибрации 6,5 м/с, время обработки 60 секунд, количество повторов 3, временной интервал между обработками 5 минут. По окончанию обработки пробирки выдерживают не менее 1-5 минут (в зависимости от консистенции раствора, или использовали программу short start на центрифуге Mini Spin) при комнатной температуре для осаждения шариков циркония, осторожно отбирают содержимое пробирок. К осадку добавляют дистиллированную воду, трижды встряхивают на Vortex V-l plus («BIOSAN») по 10 секунд с интервалом между встряхиваниями 30 с, количество повторов 3, затем взвесь центрифугируют 10 минут при 10 000 об/мин (центрифуга Eppendorf AG Mini Spin). Все супернатанты объединяют, добавляют лизирующий буфер, состоящий из 0,0625 М трис-HCl (рН 6.8), 0,1% SDS и 0,1% 2-меркаптоэтанола, разливают по 1 мл в 1,5 мл пробирки эппендорф и помещают их в термошейкер TS 100, термоблок SC 18 (12×1,5 мл) «BIOSAN».

Пробы обрабатывают 7 минут при 100°С при скорости вращения 500 RPM. Далее пробы вносят в колонку, прибора Mini Prep Cell фирмы «Bio-Rad». Фракционирование антигенного материала проводят на 15 см колонке, заполненной 12% полиакриламидным гелем (ПААГ). Пробы собирают на коллекторе фракций FRAC-100 (Pharmacia LKB), спектрофотометрический контроль осуществляют при помощи Optical unit UV-1 и Control Unit UV-1 (LKB), результаты детектируют на самописце Recoder Rec 102 (LKB), скорость элюции регулируют перестальтическим насосом Peristaltic pump Varioperpex (LKB). Условия разделения: напряжение 300 вольт, скорость элюции 1 мл/15 минут. Электрофорез проводят по методу Laemmli U.K. [3] с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану по методике Towbin, Н. и др., [4], серологическую активность определяют в реакции иммуноблотинга.

Антиген молекулярной массой 24 кДа из Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201 для изучения гуморального иммунного ответа в реакции иммуноблотинга у больных туберкулезом и включения в диагностическую панель (набор специфических биомаркеров Mycobacterium bovis) получали следующим способом.

Заявленное изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Исходным сырьем для получения антигена служили клетки Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201, выращенные на твердой питательной среде Левенштейна Йенсена в течение 45-60 суток.

1. Клетки Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201, полученные из ГИСК им. Л.А. Тарасевича, выращенные на твердой питательной среде Левенштейна-Иенсена в течение 45-60 суток.

2. Клетки снимали с поверхности твердой питательной среды, трижды отмывали от остатков питательной среды дистиллированной водой.

3. Осадок отмытых клеток, представляющий конгломераты клеток (косвенный признак - визуально наблюдаемое быстрое осаждение клеточной массы в течение 3-5 минут), разбивали легкой ультразвуковой дезинтеграцией излучателем 22 кГц в течение 5-10 секунд при амплитуде 95%. На приборе SONICS Vibro Cell, model VCX 130 (SONICS&MATERIALS INC, USA) для получения однородной массы (косвенный признак: скорость осаждения клеточной массы увеличилась до 45-60 минут).

4. Однородную взвесь клеток в объеме 1,7 мл вносили в 2 мл пробирки эппендорф с шариками циркония, диаметром 0,1 мм и три раза обрабатывали на гомогенизаторе MP Biomedicals FastPrep-24™ Instrument. Режим обработки: скорость вибрации 6,5 м/с, время обработки 60 секунд, количество повторов - 3, минимальный временной интервал между обработками 5 минут.

5. Пробирки с разрушенной клеточной массой выдерживали не менее 1-5 минут (в зависимости от консистенции раствора, или использовали программу short start на центрифуге Mini Spin) при комнатной температуре для осаждения шариков циркония, осторожно отбирали супернатант из пробирок. К осадку добавляли дистиллированную воду, трижды встряхивали на Vortex V-l plus («BIOSAN») по 10 секунд с интервалом между встряхиваниями 30 с, количество повторов 3, затем взвесь центрифугировали 10 минут при 10 000 об/мин. Все полученные супернатанты объединяли.

6. К отобранному (объединенному) супернатанту добавляли лизирующий буферный раствор, состоящий из 0.0625М трис-HCl (рН 6.8), 0,1% SDS и 0,1% 2-меркаптоэтанола, разливали по 1 мл в 1,5 мл пробирки эппендорф и помещали их в термошейкер TS-100, термоблок SC-18 (12×1,5 мл) «BIOSAN». Пробы обрабатывали в течение 7 минут при температуре 100°С при скорости вращения 500 RPM. Приготовленный таким образом препарат являлся исходным для дальнейшей работы.

Пример 2. Супернатант, обработанный лизирующей смесью при температуре 100°С, далее использовали для препаративного выделения на приборе Mini Prep-Cell фирмы «Bio-Rad».

1. В стеклянную трубку диаметром 0,8 мм и высотой 15 см вносили 12% полиакриламидный гель с катализаторами до отметки 10 см, оставляли на 10-12 часов до полной полимеризации, далее вносили концентрирующий гель до отметки 12 см, и выдерживали в течение 60 минут до завершения полимеризации. Вносили термически обработанный супернатант до отметки 14 см и осторожно наслаивали трис-глициновый электродный буфер (0,025М и 0,192 М соответственно, рН 8,35), содержащий 0,1% SDS. Верхнюю и нижнюю части стеклянной трубки соединяли с резервуарами, содержащими электродный буфер, и подавали напряжение. Процесс разделения вели при постоянном напряжении 300 вольт.

2. Пробы собирали на коллекторе фракций FRAC-100 «Pharmacia LKB», спектрофотометрический контроль оптической плотности осуществляли при длине волны 280 нм на Optical unit UV-1 и Control Unit UV-1 (LKB), результаты детектировали на самописце Recoder Rec 102 (LKB), скорость движения ленты 0,5 мм/мин, скорость элюции регулировали перестальтическим насосом Peristaltic pump Varioperpex (LKB). Условия разделения: напряжение 300 вольт, скорость элюции 1 мл/15 мин. Полученные результаты в виде гистограммы оптической плотности разделяемого лизированного материала представлены на Фиг. 1.

3. Электрофорез каждой фракции проводили в 10% ПААГ, в присутствии 0,1% SDS, далее материал с ПААГ переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Suppoted nitrocellulose membrane 0,45 u.m, фирмы «Bio-Rad»). Мембрану после переноса промывали и высушивали. Иммуноблотинг проводили с гипериммунной сывороткой крови кролика, полученной против цельных клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201. Результаты иммуноблотинга с гипериммунной сывороткой кролика против цельных клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201 представлены на Фиг. 2.

На Фиг. 3 для большей наглядности представлена гистограмма препаративного фракционирования, где овалом выделена область фракций 24-27, соответствующая молекулярной массе 24 кДа, стрелками указаны четыре фракции с 24 по 27, которые содержали антиген с молекулярной массой 24 кДа. По оптической плотности УФ детекции при длине волны λ=280 нм видно, что обозначенные фракции имели практически нулевой коэффициент экстинкции, что косвенно свидетельствует о полипептидной структуре полученного антигена.

Для более детального анализа треков иммуноблотинга результаты представлены в виде денситограммы, полученной с использованием программы Image J. Результаты денситограмм треков с 16 по 27 представлены на Фиг. 4 (А). Треки с 24 по 27 были взяты для наглядности распределения серологической активности полипептидов по молекулярным массам во временном процессе разделения, результаты представлены на Фиг. 4 (Б).

Пример 3. Полученные фракции после препаративного электрофореза были объединены в соответствии с результатами иммуноблотинга, всего получено 14 объединенных фракций: №1-(с 1 по 4 фракции); №2-(с 5 по 12 фракции); №3-(с 13 по 17 фракции); №4-(с 18 по 21 фракции); №5-(с 22 по 23 фракции); №6-(с 24 по 25 фракции); №7-(с 26 по 27 фракции); №8-(с 29 по 29 фракции); №9-(с 30 по 32 фракции); №10-(с 33 по 37 фракции); №11-(с 38 по 42 фракции); №12-(с 43 по 50 фракции); №13-(с 51 по 8 фракции); №14-(с 59 по 63 фракции). Объединенные фракции были исследованы в реакции иммуноблотинга с гипериммунной сывороткой крови кролика, полученной против цельных клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамма 700201. Результаты иммуноблотинга с гипериммунной сывороткой кролика против цельных клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамма 700201 представлены на Фиг. 5.

Как видно из представленной фигуры наибольшая серологическая активность наблюдалась в треках №6-(с 24 по 25 фракции) и №7-(с 26 по 27 фракции). Полученный материал был лиофильно высушен.

Пример 4. Использование антигенов объединенных фракций №5, №6, №7, №8 в ИФА.

Данные объединенные фракции №5, №6, №7, №8 показали в реакции иммуноблотинга высокую серологическую активность. Эти антигены были исследованы в реакции ИФА с использованием полистироловых стрипированных планшетов ВНИИМЕДПОЛИМЕР. Антигены сенсибилизировали на 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере, рН=9,5, с двукратной раститровкой, начиная с титра 1:10. В качестве положительной сыворотки использовали гипериммунную сыворотку, полученную против цельных клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамма 700201. В качестве отрицательной сыворотки использовали нормальную кроличью сыворотку. Разведение сывороток составляло 1:100. Результаты ИФА в виде гистограммы представлены на Фиг. 6. Как видно из Фиг. 6 наибольшей активностью в разведении 1:40 обладали антигены №5 и №6. Данные антигены могут быть использованы в качестве биомаркера в конструировании диагностических тест-систем (в дополнении к ранее полученному антигену с молекулярной массой 28 кДа).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения антигена из Mycobacterium bovis Bovines-8 штамм 700201 молекулярной массой 24 кДа для изучения гуморального ответа, включающий культивирование возбудителя на твердой питательной среде Левенштейна-Йенсена, разрушение отмытых клеток с частотой 22 кГц в течение 5-10 с, затем гомогенные клетки микобактерий трехкратно разрушают с использованием циркониевых шариков диаметром 0,1 мм в заданном временном режиме, осветляют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин, антиген фракционируют препаративно на 15 см колонке в 12% ПААГ с использованием додецилсульфата натрия в концентрации 0,1%. Изобретение обеспечивает дополнение диагностической панели биомаркеров для изучения гуморального иммунного ответа и для иммунологических тестов. 6 ил., 4 пр.

Способ получения антигена из Mycobacterium bovis Bovines-8 штамм 700201 молекулярной массой 24 кДа для изучения гуморального ответа, включающий культивирование возбудителя на твердой питательной среде Левенштейна-Йенсена, разрушение отмытых клеток и фракционирование препаративным электрофорезом, отличающийся тем, что разрушение отмытых клеток осуществляют легкой ультразвуковой дезинтеграцией с частотой 22 кГц, в течение 5-10 с на приборе SONICS Vibra Cell, модель VCX 130, затем гомогенные клетки микобактерий трехкратно разрушают с использованием циркониевых шариков диаметром 0,1 мм в течение 60 с с временным интервалом между обработками 5 мин, с отмывкой шариков циркония от остатков разрушенных клеток дистиллированной водой, осветлением центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин, препаративным фракционированием антигена на 15 см колонке в 12% ПААГ с использованием додецилсульфата натрия в концентрации 0,1%.