РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pTSE6, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД GST-ESAT-6 СО СВОЙСТВАМИ ВИДОСПЕЦИФИЧНОГО МИКОБАКТЕРИАЛЬНОГО АНТИГЕНА ESAT-6, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА GST-ESAT-6 И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИД GST-ESAT-6 Российский патент 2006 года по МПК C12N15/63 C12N15/31 C12N1/21 C07K14/35 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и позволяет получать микробиологическим синтезом по упрощенной технологии новый гибридный полипептид GST-ESAT-6 со свойствами видоспецифичного белка-антигена Mycobacterium tuberculosis ESAT-6, который может быть использован для ранней видоспецифичной диагностики туберкулезной инфекции.

Разнообразие форм туберкулеза, распространение стертой картины заболевания, а также индивидуальная реакция организма на инфекцию представляют собой серьезную проблему для диагностики туберкулезной инфекции вообще и для ранней диагностики в частности.

Классическая методология диагностики туберкулеза связана с применением кожных (интрадермальных) реакций на введение туберкулина (PPD) - очищенного деривата протеина [1]. Однако проблема специфичности и чувствительности кожных тестов в случае лиц, вакцинированных BCG, не позволяет отличить их от индивидуумов, инфицированных патогенными микобактериями туберкулеза, в данном тесте [2]. Одной из причин ложноположительных реакций в реакции Манту связана с проявлением кросс-реактивности к нетуберкулезным микобактериям. Около 10% людей проявляют реактивность к нетуберкулезным микобактериям, из которых 30% оказываются позитивными в кожном тесте.

Среди классических методов диагностики туберкулеза наибольшей специфичностью обладает метод идентификации культуры возбудителя в посеве исследуемого образца. Широкое распространение получили также цитологические (микроскопические) методы определения микобактерий в мазках после окраски красителем. Однако оба этих метода оказываются малопригодными при небациллярных формах туберкулеза, когда микобактерии отсутствуют в биопробах. Кроме того, культивирование микобактерий ввиду их медленного роста является длительной процедурой, а цитологическая идентификация не обладает достаточной чувствительностью, чревата ошибками и в значительной степени зависит от квалификации персонала.

Методы серодиагностики, основанные на определении антител к антигенам микобактерий, в настоящее время нашли широкое применение для скрининговых исследований благодаря относительно невысокой стоимости, быстроте, высокой чувствительности и специфичности среди инфицированных людей [3]. Серологические методы отличаются большим разнообразием. Чувствительность и специфичность тестов, использующих технологию ИФА, варьируется в довольно широком диапазоне и составляет 40-85% и 67-100% соответственно. Однако зачастую показатели гуморального иммунного ответа при туберкулезе снижены, и это приводит к тому, что вирулентные микобактерии, вызывающие туберкулез у человека, перекрестно реагируют с набором антигенов непатогенных микобактерий и многих возбудителей других болезней. С другой стороны, антимикобактериальная и гормональная терапия оказывают супрессирующее влияние на продукцию антител при туберкулезе. Именно этот фактор является основным при выявлении маркеров гуморального иммунитета у больных туберкулезом (происходит снижение уровня антител), и таким образом, процент позитивных результатов в ИФА оказывается сравнительно невысоким [4].

В литературе описано большое количество новых белков (полипептидов) микобактерий туберкулезного комплекса, которые могут быть использованы в диагностических тестах. Известны и нуклеотидные последовательности, кодирующие эти белки. Большая часть этой коллекции имеет сходства с другими видами Mycobacterium и даже с родами других бактерий. Количество белков культурального фильтрата, секретируемых микобактериями M.tuberculosis и обладающих иммунологической и ферментативной активностью, ассоциированы с патогенезом. Однако полный анализ белковой композиции (состава) в этих фракциях остается до конца не изученным [5].

При развитии туберкулезной инфекции важная роль принадлежит Т-лимфоцитам и другим Т-клеткам или Т-клеточным эффекторам (CD4, CD8) [6]. В частности, СD4-Т-клетки продуцируют иммунный интерферон (гамма-интерферон, IFN-γ), который является стимулятором выработки в инфицированном организме антимикобактериальных макрофагов, как показано на мышиных моделях [7], а также активатором макрофагов человека при подавлении инфекции M.tuberculosis [8].

Сопоставление характера изменения Т-клеточного и В-клеточного звеньев иммунитета позволяет выявить уровень защитной реакции иммунной системы организма, направленной на синтез антител к бактериальным антигенам. Изучение состояния внутриклеточной функциональной активности иммунокомпетентных клеток позволяет получить сведения о патологическом процессе [9].

Высокий уровень продукции γ-IFN стимулирует Т-клеточную активацию, характеризуя клеточный иммунитет при туберкулезной инвазии. Выбор в качестве прогностического фактора в диагностике туберкулеза γ-интерферона является не случайным. Нарушение функционирования в цепи IFN является отражением нарушения функции иммунной системы [10].

γ-IFN-анализ основывается на количественном определении уровня γ-IFN при стимуляции лимфоцитов цельной клеточной крови, инкубированных в течение 16-20 часов с белковыми антигенами M.tuberculosis и контрольными антигенами. В результате стимуляции эффекторов Т-клеток памяти в крови происходит быстрая секреция цитокинов, ответственных за эффекторные функции клеточного иммунного ответа, при этом IFN-γ является одним из немногих цитокинов, который продуцируется в этом процессе и служит специфическим маркером для клеточных медиаторов иммунного ответа.

В качестве комплекса микобактериальных антигенов для такого рода диагностических исследований могут быть использованы туберкулин (PPD) или культуральные фильтраты (CF) M.tuberculosis H37Rv. В отличие от кожного теста γ-IFN-анализ позволяет проводить дифференцирование между BCG-вакцинированными и инфицированными пациентами. Как правило, результаты исследования клинических изолятов с использованием гамма-интерферонового анализа выявляет более низкий процент вакцинированных, имеющих позитивный результат на наличие туберкулезной инфекции, чем данные интрадермального теста. Такое различие указывает на то, что результаты кожной пробы с использованием PPD имеют низкую специфичность в случае BCG-вакцинированных пациентов.

Наиболее подходящими полипептидами, играющими роль микобактериальных антигенов в гамма-интерфероновом анализе, являются белки, высокоспецифичные для вирулентных штаммов возбудителей туберкулеза и одновременно отсутствующие в вакцинных штаммах BCG.

Применение видоспецифичных белков позволяет дифференцировать различные фазы развития туберкулезной инфекции в отличие от других белков M.tuberculosis, например использование белка с молекулярной массой 19 кДа, а высокий уровень Т-клеточного ответа на видоспецифичные антигены коррелирует с протективным иммунитетом при туберкулезе и с риском развития активной формы туберкулеза.

Известен белок ESAT-6, впервые идентифицированный Sorensen с соавторами [11] как высокоспецифичный именно для вирулентных видов возбудителей туберкулеза. Основное преимущество этого белка в том, что в геномах вакцинных штаммов BCG отсутствует нуклеотидная последовательность, кодирующая его. Молекулярная масса очищенного нативного белка равна 24 кДа. ESAT-6 является основным антигеном, вызывающим развитие раннего Т-клеточного ответа. Этот процесс сопровождается повышенной продукцией γ-IFN. Ген белка ESAT-6 входит в состав геномного фрагмента RD1 размером 9,5 тыс. п.н., присутствующего в геномах штаммов M.tuberculosis и M.bovis. Но эта нуклеотидная последовательность (RD1-область) отсутствует во всех вакцинных штаммах M.bovis BCG, а это означает, что ESAT-6 также отсутствует в вакцинных препаратах, что и позволяет использовать его в диагностических целях [12].

Выделение и очистка белка ESAT-6 из культурального фильтрата микобактерий является дорогостоящей и сложной процедурой, выход продукта при этом оказывается чрезвычайно низким, поэтому применение техники рекомбинантных ДНК для получения указанного белка является экономически более целесообразным для практических целей диагностики.

Известен генно-инженерный способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами микобактериального антигена ESAT-6, используемого для диагностических целей [13, прототип]. Однако предлагаемая конструкция не позволяет нарабатывать препаративные количества этого полипептида. Кроме того, в процессе биотехнологической очистки полученного рекомбинантного полипептида ESAT-6, последний претерпевает значительную деградацию, что сказывается на его иммуногенных свойствах.

Технической задачей изобретения является конструирование рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli - продуцента гибридного полипептида со свойствами видоспецифичного микобактериального антигена ESAT-6, имеющего такую конструкцию, которая бы позволяла нарабатывать целевой высокоочищенный недеградированный полипептид в препаративных количествах при сохранении иммуногенных свойств последнего.

Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pTSE6, кодирующей химерный полипептид: глутатион-S-трансфераза (GST)+ESAT-6 (далее rESAT-6). При этом ген, кодирующий полипептид со свойствами микобактериального антигена ESAT-6, находится в одной рамке считывания с геном глутатион-S-трансферазы из Schistosoma japonicum (GST S.j.).

Рекомбинантная плазмидная ДНК pTSE 6 (фиг.1a и 1б) с молекулярной массой 3,45 МДа имеет размер 5316 п.н. и состоит из следующих элементов:

- EcoRI-BamHI - фрагмента векторной плазмиды pGEX-2T (Pharmacia Biotech) размером 4938 п.н., содержащего ген β-лактамазы, индуцируемый tac-промотор, внутренний lacI^q-ген, кодирующий белок-репрессор лактозного оперона, фрагмент гена глутатион-S-трансферазы из Schistosoma japonicum с множественным сайтом для клонирования генов в 3'-концевой части этого гена и сайт протеолиза тромбином;

- EcoRI-BamHI - фрагмента размером 378 п.н., содержащего фланкированный сайтами для эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHI полный ген esat-6, полученный амплификацией фрагмента с генома Mycobacterium tuberculosis;

содержит:

- в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pTSE6 клеток Е.coli к антибиотику ампициллину;

- уникальные сайты рестрикции: BamHI - 930, EcoRI-1308.

Наличие в составе химерного рекомбинантного полипептида rESAT-6 GST-фрагмента позволяет нарабатывать препаративные количества целевого белка с использованием аффинной хроматографии. Данные свойства конструкции важны в биотехнологическом аспекте. Кроме того, наличие GST-фрагмента позволяет облегчить процесс очистки рекомбинантного полипептида и получать высокоочищенный белок со свойствами микобактериального антигена ESAT-6 без деградации. Присутствие GST-фрагмента в составе химерного белка позволяет защитить его от внутриклеточных факторов деградации и ферментов крови при стимуляции цельной клеточной культуры крови в процессе диагностического анализа. Пролонгирование его действия при стимуляции цельной крови или мононуклеаров цельной крови с использованием такого рода структур относится к важным факторам стабильности таких белков. При этом иммуногенные свойства предлагаемой химерной структуры полипептида не утрачиваются. Принципиальным отличием предлагаемого химерного полипептида от исходного в прототипе ESAT-6 является то, что рекомбинантный белок, полученный в результате экспрессии, является единым образованием, включающим иммунодоминантные видоспецифические структурные эпитопы нативного белка ESAT-6 и не обладающим функциональной активностью GST-фрагмента. Расположенный между полипептидными фрагментами GST и ESAT-6 (фиг.2а и 2б) сайт гидролиза тромбином позволяет при необходимости получать микобактериальный антиген ESAT-6, свободный от N-концевого полипептидного фрагмента GST.

Для получения бактериального штамма-продуцента химерного белка rEsat-6 компетентные клетки Escherichia coli BL21 трансформируют сконструированной целевой плазмидой pTSE6. Полученный штамм бактерий E.coli BL21/pTSE6 характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. По морфологическим признакам штамм-продуцент рекомбинантного белка rEsat-6 не отличается от исходного штамма Escherichia coli BL21, не содержащего целевую плазмиду.

Культуральные признаки. По культуральным признакам штамм-продуцент рекомбинантного белка rEsat-6 не отличается от исходного штамма Escherichia coli BL21, не содержащего целевую плазмиду.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки штамма-продуцента рекомбинантного белка rEsat-6 проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием целевой плазмиды.

Существенным отличием штамма E.coli BL21/pTSE6 является то, что он обеспечивает синтез химерного полипептида rESAT-6 (GST-ESAT-6) со свойствами микобактериального антигена ESAT-6 с уровнем экспрессии 1-10 мг/мл белка.

Полученный штамм депонирован в НИИ Коллекции культур микроорганизмов (НИИ ККМ) ГНЦ ВБ "Вектор" под номером В-1026.

Химерный полипептид rESAT-6 (GST-ESAT-6) (фиг.2а и 2б), экспрессируемый рекомбинантным штаммом E.coli BL21/pTSE6, содержит в качестве белка-носителя N-концевой полипептидный фрагмент глутатион-S-трансферазы S.j. (226 а.о. с молекулярной массой 26 кДа) и соединенный через сайт гидролиза тромбином (LVPI^GS) С-концевой полипептидный фрагмент видоспецифичного микобактериального антигена ESAT-6 (95 а.о. с молекулярной массой 6 кДа), и имеет аминокислотную последовательность, приведенную на Фиг.2а и 2б.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

Фиг.1а. Схема организации рекомбинантной плазмиды pTSE6, где: GST - ген белка глутатион-8-трансферазы; ESAT-6 - клонированный фрагмент, включающий полный ген белка ESAT-6; уникальные BamHI- и EcoRI-сайты эндонуклеаз рестрикции, использованные при создании данной конструкции; ptac - синтетический промотор, присутствующий в векторной pGEX-2T и рекомбинантной плазмидах; Ар^R - ген β-лактамазы (bla-ген), обеспечивающий трансформированным бактериальным клеткам устойчивость к ампициллину.

Фиг.1б - рестрикционная карта целевой плазмиды pTSE6.

Фиг.2а и 2б - полная нуклеотидная и аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида GST-ESAT-6, где - LVPR^GS аминокислотная последовательность сайта узнавания и гидролиза протеазой тромбин (выделен цветом).

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pTSE6.

В качестве источника для наработки клонируемого нуклеотидного материала используют геномную микобактериальную ДНК M.tuberculosis штамма H37Rv, выделенную из инактивированных клеток микобактерий. Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме 50 мкл в присутствии пары праймеров:

5'-GAGGATCCATGACAGAGCAGCAGTGG-3' [прямой праймер для гена esxA (esat6)],

5'-GCGAATTCTAAACACGAGAAAGGGCG-3' [обратный праймер для гена esxA (esat6)]

с температурно-временным профилем: 94°С - 3 мин, 4 цикла [94°С - 30 с, 45°С - 20 с, 72°С - 40 с], 33 цикла [94°С - 30 с, 58°С - 20 с, 72°С - 40 с], результирующий отжиг 72°С - 5 мин. Полную нуклеотидную последовательность клонируемого гена (esxA) для подбора первичной нуклеотидной последовательности праймеров получили из базы данных Института Пастера (Франция). Температуры плавления праймеров исходя из их нуклеотидной последовательности рассчитывали при использовании программы NTI Suite. Отжиг праймеров в первых 4 циклах ведут при пониженной температуре отжига (45°С), проводя расчет температур плавления праймеров только с полностью гибридизующимися последовательностями этих праймеров с нуклеотидной геномной матрицей: 5'-концевая последовательность в 8 н.п. является дополнительной и предназначена для создания сайта узнавания для эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI соответственно с целью облегчения последующей стадии клонирования.

Реакционная смесь включает полимеразный буфер, содержащий 60 мМ трис-HCl, рН 8,5; 25 мМ KCl; 1,5 мМ MgCl₂; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1% тритон Х-100; четыре дезоксинуклеозидтрифосфа - дАТФ, дГТФ, дЦТФ и ТТФ при конечной концентрации каждого из них 0,2 мМ; праймеры в концентрации каждого 0,15-0,2 мкМ и 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы («Сибэнзим»). Выход составляет около 2 мкг (8 пмоль) ПЦР-фрагмента. Полученный ПЦР-фрагмент длиной 388 п.н. очищают переосаждением этанолом в присутствии ацетата натрия, рН 4,8, и тРНК в качестве носителя [14]. Очищенный препарат ампликона растворяют в 80 мкл ТЕ-буфера и затем проводят совместный гидролиз в EcoRI-буфере («Сибэнзим») эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI при 37°С в течение 3-5 ч. Полученный из ампликона целевой рестрикт с двумя липкими концами переосаждают, как описано выше, растворяют в 40 мкл ТЕ-буфера или бидистиллированной воды и без дополнительной очистки используют в реакции лигирования с расщепленной векторной молекулой (pGEX-2T), также содержащей два липких конца - BamHI и EcoRI. Смешивают 2-5 мкл рестрикта-ампликона (0,5 пмоль) с 500 нг (0,15 пмоль) векторной ДНК pGEX-2T/BamHI/EcoRI в 20 мкл лигазного буфера («Сибэнзим»), прогревают при 65°С в течение 3-5 мин, резко охлаждают во льду, добавляют 20 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и реакционную смесь переносят в термостат, где выдерживают в течение ночи при 16°С. Аликвоту лигазной смеси (1-2 мкл) используют для трансформации компетентных клеток E.coli штамма JM103, приготовленных по методике с использованием раствора хлористого кальция [14], которые высевают на чашки с агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Чашки инкубируют при 37°С в течение ночи. Поиск клонов, содержащих искомую встройку, проводят непосредственно из колоний с помощью ПЦР-анализа, использующего в качестве амплимеров олигонуклеотиды, комплементарные разным цепям векторной молекулы и располагающиеся по обе стороны от места клонирования фрагмента. При этом клоны, содержащие встройку полного гена esxA (esat6), после разделения амплификата в геле агарозы (1,2%) соответствуют длине 548 п.н., что превышает длину клонируемого фрагмента, так как этот фрагмент содержит часть нуклеотидной последовательности исходной векторной молекулы. После отбора целевые плазмиды нарабатывают в аналитических количествах и проводят необходимый рестрикционный анализ (выявление наличия сайтов рестрикции BamHI и EcoRI). Полученную целевую плазмиду обозначили как pTSE6. Схема плазмидной ДНК представлена на Фиг.1а и 1б.

Пример 2. Получение штамма-продуцента, при культивировании клеток которого осуществляется продукция химерного белка GST-ESAT6.

Трансформацию клеток штамма E.coli BL21 проводят введением ДНК целевой плазмиды pTSE6 в компетентные клетки, приготовленные по методике с использованием раствора хлористого кальция [14], после чего высевают на чашки с агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Чашки инкубируют при 37°С в течение ночи. Появившиеся колонии представляют собой клоны штамма-продуцента.

Клетки из каждого отобранного клона (обычно не более 10) высевают в 1 мл жидкой среды с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл для получения ночных культур клеток и инкубируют при 37°С без качания. На следующий день засевают ночной культурой каждого клона в отношении 1:100 2 мл свежей среды с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют при 37°С со скоростью качания 160 об/мин. Окончательный отбор клонов проводят по способности культуры клеток продуцировать рекомбинантный белок rESAT6 в максимально возможных количествах после проведения индукции, осуществляемой при добавлении в растущую культуру, содержащую клетки каждого отдельного клона и достигшую плотности 0,15-0,2 при 660 нм, изопропил-β-D-галактопиранозид (ИПТГ), и последующего культивирования клеток при выбранной температуре (в нашем случае это 37°С и 1 мМ ИПТГ). Концентрацию белка, продуцируемого клетками отдельного клона, оценивают после проведения электрофореза лизатов культур клеток в 10%-ном ПААГ в денатурирующих условиях по Лэммли.

Пример 3. Выделение рекомбинантного белка GST-ESAT-6.

Клетки штамма E.coli BL21, трансформированные плазмидой pTSE6, выращивают в среде LB с ампициллином (50 мкг/мл) в течение ночи при 37°С. Ночную культуру (1:100) засевают в 150 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и подращивают до ранней логарифмической фазы. Далее индуцируют экспрессию целевого белка GST-ESAT-6 добавлением ИПТГ до концентрации 0,5 мМ. Индуцированные клетки растят 4 часа при 37°С, после чего собирают центрифугированием при 5000 g. Экспрессию целевого белка GST-ESAT-6 анализируют электрофорезом по Лэммли в 12%-ном полиакриламидном геле и иммуноблотингом с моноклональными антителами к белку-носителю GST. Результаты этого анализа показывают наличие в индуцированной культуре клеток E.coli BL21/pTSE6 при обработке клеточных осадков лизирующим буфером GST-ESAT-6 белка с молекулярной массой около 32 кДа, что соответствует расчетной молекулярной массе. В контрольных лизатах клеток E.coli BL21 и E.coli BL21/pGEX-2T белок с этой молекулярной массой отсутствует. Данный белок окрашивается в иммуноблотинге с моноклональными антителами к белку-носителю GST.

Для дальнейших анализов клетки ресуспендируют в 8 мл холодного (0°С) PBS-буфера, содержащего 140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 1,8 мМ КН₂PO₄ рН 7,3, 1 мМ ингибитора протеаз PMSF, и разрушают ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе (Ultrasonic processor Cole Farmer) 3×30 c с интервалом 1 мин между обработками при амплитуде 50А. К ультразвуковому дезинтеграту добавляют тритон Х-100 до 1%, инкубируют 30 мин при 0°С и отделяют фракцию растворимых белков от дебриса центрифугированием при 12000 g в течение 40 мин. Далее смешивают супернатант с 200 мкл глутатион-сефарозы (Glutathione Sepharose 4B Amersham, Biosciences AB) и инкубируют 30 мин с низкой скоростью перемешивания при комнатной температуре для аффинного связывания белка GST-ESAT-6. Затем смесь переносят в микроколонку путем многократного центрифугирования при 600 g, несколько раз промывают колонку PBS-буфером и проводят элюцию целевого белка буфером для элюции, содержащим 10 мМ восстановленный глутатион в 50 мМ трис-HCl, рН 8. В результате получают препарат очищенного рекомбинантного белка с концентрацией 1 мг/мл.

Пример 4. Проведение IFN-γ анализа.

1-я стадия (стимуляция цельной клеточной культуры крови целевым антигеном). Образцы гепаринизированной венозной крови пациентов перемешивают осторожно круговыми движениями в течение 20 мин. Распределяют по 100 мкл в 96-луночные планшеты (Nunc, USA), содержащие по 150 мкл/лунке полной среды RPMI 1640 с глутамином. Тщательно перемешивают и вносят антиген GST-ESAT-6 в концентрации 10 мкг/мл на лунку. Отдельно вносят по 100 мкл буферного раствора в лунки с нулевым контролем (без добавления антигена) и митоген РНА в концентрации 5 мкг/мл на лунку. Осторожно перемешивают. Инкубируют платы 20-48 час при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂

2-я стадия. Для проведения IFN-γ анализа в контрольные лунки планшет с сорбированными моноклональными антителами к гамма-интерферону производства BD Biosciences вносят по 100 мкл стандартных образцов гамма-интерферона в разных концентрациях (от 300-150-75-37,5-18,8-9,4-4,7 пк/мл) - производства BD Biosciences. В остальные лунки планшет вносят по 100 мкл исследуемых образцов плазмы крови после стимуляции, помещают в шейкер и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После окончания инкубации планшет промывают 3 раза промывочным буферным раствором (ФСБ-Т). После промывки в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл конъюгата биотинилированных антител к IFN-γ производства BD Biosciences и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации промывают планшет 3 раза буферным раствором ФСБ-Т. После чего в каждую лунку планшета добавляют по 100 мкл конъюгата авидин-пероксидазы хрена производства BD Biosciences в рабочем разведении. Инкубируют 60 мин при комнатной температуре. После окончания инкубации планшет промывают 5 раз промывочным буферным раствором (ФСБ-Т) и 3 раза Н₂О дистиллированной. Затем вносят в каждую лунку планшета по 100 мкл раствора ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина), помещают планшет в защищенное от света место и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Реакцию терминируют добавлением в каждую лунку планшета по 50 мкл стоп-реагента (0,9 N раствор H₂SO₄). Измеряют оптическую плотность на автоматическом спектрофотометре типа «Мультискан» при длине волны 450 нм.

Для оценки концентрации IFN-γ в исследуемых образцах строят калибровочную кривую в логарифмических координатах: ось абсцисс - концентрация IFN-γ (пкг/мл), ось ординат - значение оптической плотности образца. По полученным значениям проводят калибровочную кривую и рассчитывают количественное содержание IFN-γ в пг/мл или МЕ/мл в исследуемых и контрольных образцах. Результаты подсчитывают из среднего значения ОП в трех лунках (ρ<0,05). Значения Cutoff для IFN-γ>300 пг/мл считают позитивными.

Пример 5. Мононуклеары цельной клеточной культуры крови (2×10⁵ клеток/лунка), выделенные по стандартной процедуре с использованием градиентного центрифугирования в присутствии Фиколл-Гипак реагентов, суспендируют в 50 мкл полной клеточной культуральной среде RPMI 1640 и распределяют в 96-луночные планшеты (Nunc, MaxiSorb, USA), содержащие по 150 мкл/лунку полной среды RPMI 1640 производства ГНЦ ВБ "Вектор". Затем в каждую лунку планшет вносят химерный антиген GST-ESAT-6 в концентрации 5-10 мкг/мл; в контрольные лунки планшет вносят митоген (Con А или РНА) в концентрации 4 мкг/мл в трипликатах. Конечный объем реакционной среды в лунке планшета составляет 250 мкл. Инкубируют платы 16-24 час при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂.

Для проведения IFN-γ анализа в контрольные лунки планшет с сорбированными моноклональными антителами к гамма-интерферону вносят по 100 мкл стандартных и контрольных образцов. В остальные лунки планшет вносят по 100 мкл исследуемых образцов плазмы крови после стимуляции. Помещают в шейкер и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После окончания инкубации планшет промывают 3 раза промывочным буферным раствором (ФСБ-Т). После промывки в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл конъюгата биотинилированных антител к IFN-γ и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации промывают планшет 3 раза буферным раствором ФСБ-Т. После чего в каждую лунку планшета добавяют по 100 мкл конъюгата авидин-пероксидазы хрена в рабочем разведении и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. После окончания инкубации планшет промывают 5 раз промывочным буферным раствором (ФСБ-Т) и 3 раза дистиллированной водой. Затем в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл раствора ТМБ (3,3',5,5'- тетраметилбензидина), помещают планшет в защищенное от света место и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Реакцию терминируют добавлением в каждую лунку планшета по 50 мкл стоп-реагента (0,9 N раствор H₂SO₄). Оптическую плотность образцов измеряют на автоматическом спектрофотометре типа «Мультискан» при длине волны 450 нм.

Для оценки концентрации IFN-γ в исследуемых образцах строят калибровочную кривую в логарифмических координатах: ось абсцисс - концентрация IFN-γ (пкг/мл), ось ординат - значение оптической плотности образца. По полученным значениям проводят калибровочную кривую и рассчитывают количественное содержание IFN-γ в пг/мл или МЕ/мл в исследуемых и контрольных образцах. Результаты подсчитывают из среднего значения ОП в трех лунках (ρ<0,05). Значения Cutoff для IFN-γ>300 пг/мл -считают позитивными.

Пример 6. Сорбцию МКА к IFN-γ производства BD OptEIA Reagent проводят с использованием 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,5 в течение 16 ч при 4°С на планшетах (Nunc, MaxiSorb, USA). После отмывки планшет промывочным буферным раствором (ФСБ, рН 7,0) 3 раза по 300 мкл/лунку проводят блокировку поверхности лунок блокировочным буферным раствором ФСБ, рН 7,0, содержащим 10% фетальной сыворотки, в течение 60 мин при комнатной температуре. После чего проводят отмывку планшета, как указано выше.

Подготовленный планшет с сорбированными МКА к IFN-γ используют при проведении IFN-γ-анализа. Для этого в каждую лунку планшета вносят по 150 мкл полной среды RPMI 1640. Образцы гепаринизированной венозной крови пациентов осторожно перемешивают и затем распределяют по 100 мкл в 96-луночные планшеты (Nunc, USA). Тщательно перемешивают и вносят раствор антигена GST-ESAT-6 в RPMI 1640 с 0,2 мМ глутамина в концентрации 10 мкг/мл на лунку. В лунки А-1, В-1 и С-1 вносят митоген (РНА), в лунки D-1, Е-1 добавляют по 100 мкл разводящего буферного раствора (нулевой контроль). Осторожно перемешивают. Инкубируют платы 24-48 час при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂, при перемешивании. После окончания инкубации планшет промывают 5×300 мкл/лунку дистиллированной водой и 5×300 мкл ФСБ-Т буферным раствором. С целью построения калибровочного графика при проведения IFN-γ анализа предварительно проводят инкубацию со стандартными калибровочными образцами IFN-γ. Для этого в контрольные лунки планшет с сорбированными моноклональными антителами к гамма-интерферону производства BD Biosciences вносят по 100 мкл стандартных образцов гамма-интерферона в разных концентрациях (от 300-150-75-37,5-18,8-9,4-4,7 пк/мл) - производства BD Biosciences или по 100 мкл стандартных калибровочных образцов, содержащих IFN-γ (2000-1000-500-300-100-50-0 пкг/мл) и контрольный образц (330 пк/мл IFN-γ) производства «Вектор-Бест». Инкубируют согласно инструкции по применению наборов. После окончания инкубации стрипы планшет промывают 3 раза промывочным буферным раствором (ФСБ-Т). После промывки в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл конъюгата биотинилированных антител к IFN-γ и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации планшет промывают 3 раза буферным раствором ФСБ-Т, в каждую лунку планшета добавляют по 100 мкл конъюгата авидин-пероксидазы или стрептавидин-пероксидазы хрена в рабочем разведении и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. После окончания инкубации планшет промывают 5 раз промывочным буферным раствором (ФСБ-Т) и 3 раза дистиллированной водой и вносят в каждую лунку планшета по 100 мкл раствора ТМБ (3,3',5,5'- тетраметилбензидина). Планшет помещают в защищенное от света месте и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Реакцию терминируют добавлением в каждую лунку планшета по 50 мкл стоп-реагента (0,9N раствор H₂SO₄) и измеряют оптическую плотность на автоматическом спектрофотометре типа «Мультискан» при длине волны 450 нм. Результаты анализа представляют в значениях Cutoff, которые получают по построенным калибровочным кривым как описано выше.

Туберкулезный контроль проводится для выявления активного туберкулеза и скрининга лиц, имеющих контакт с использованием туберкулиновой пробы. Быстрый путь раннего выявления инфекции в крови с использованием рекомбинантных белков является альтернативным кожному тесту. Выявление уровня IFN-γ коррелирует со стадией и степенью туберкулезной инфекции, уровнем иммунного ответа и вероятностью прогрессирования активной формы туберкулеза. В Таблице 1 представлены результаты выявления активного туберкулеза легких с использованием IFN-γ-анализа, а также среди здорового контингента. Как показывают проведенные исследования, полученные рекомбинантные белки позволяют выявлять активный туберкулезный процесс среди больных туберкулезом легких. Уровень IFN-γ среди здорового контингента не превышает предельные значения (>300 пг/мл IFN-γ), соответствующие группе риска или больных туберкулезом. Эти данные свидетельствуют о специфичности метода. Клинический статус больных с разной формой туберкулезной инфекции, выявленных с использованием гибридных белков rESAT-6, представлен в Таблице 3. В Таблице 4 представлены результаты сравнительного изучения специфичности и чувствительности рекомбинантных белков rESAT-6 в сравнении с PPD-туберкулином при стимуляции цельной клеточной культуры крови. Специфичность рекомбинантных белков в IFN-γ-анализе туберкулеза оказывается выше, чем PPD-туберкулина.

Таблица 1
IFN-γ - анализ туберкулеза при стимуляции гибридными белками у пациентов с активной формой туберкулеза легкихПациенты с активной формой туберкулезаIFN-γ (пг/мл)RESAT-6ConAРНАPPD1175067004782410022360732454213650311045303218285044475730067104870513209650897146406277861876462007421012344142301732087604851435239809324019870213405830103420183001723510350112290165401453021200121318123471324757301364234503241067014564017650189301534015176409852316642341028750745817334019340187451048018168034500295606130Доноры<300<300<300180-632

Значения Cutoff для IFN-γ>300 пг/мл - позитивные. Результаты подсчитывали из среднего значения ОП в трех лунках (ρ<0,05) и выражали в пг/мл, используя калибровочный график.

Для другой группы пациентов с туберкулезной инфекцией результаты продукции IFN-γ выражали в МЕ/мл с применением калибровочного графика. Аналитическая чувствительность теста составила 1,2-1,7 МЕ/мл IFN-γ для отрицательного (нулевого) контрольного образца из плазмы крови исследуемых пациентов. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2.
IFN-γ - анализ легочного туберкулеза при стимуляции гибридными белками и митогенамиПациенты с активной
Формой туберкулезаIFN-γ (МЕ/мл)PPDrESAT-6МитогенРНАТБ154,32,3463,5ТБ227,03,147,6ТБ359,25,7123,0ТБ473,03,2117,0ТБ524,82,743,2ТБ611,71,7323,1ТБ74,70,87126,8ТБ82,90,8121,3ТБ95,30,7353,1ТБ1027,60,83143,9ТБ1157,20,2365,3ТБ1210,96,472,1ТБ1362,37,257,4ТБ141,72,119,7ТБ1533,41,734,5ТБ167,213.267,3ТБ1798,712,478,1ТБ1874,619,332,3ТБ1943,1132,2179,3ТБ2067,3147,5165,7

Таблица 3.
Клинический статус больных туберкулезом, выявленных с использованием рекомбинантных белков rESAT-6 и IFN-γ - анализаNП/пТуберкулезная инфекцияЧувствительность (%)Специфичность (%)1Инфильтративный туберкулез легких86-9587-972Очаговый туберкулез легких87-9493-943Диссеминированный туберкулез легких84-9786-944Фиброзно-кавернозный туберкулез легких96-10097-100Таблица 4.
Чувствительность и специфичность PPD, rESAT-6 у ТБ пациентов и здоровых доноровКоличество IFN-γ пкг/млАнтигенКол-во выявленных больных ТБ/к общему числу.Чувствительность (%)*Специфичность (%)**  ТБЗдоровые ***  >300PPD5/67/7830 rESA Т-64/64/147371>1000rESA9/103/219085,7 Т-6 PPD7/913/1478,77>3000rESA Т-617/212/1980,989,5* - Позитивный ответ среди ТБ-инфицированных больных
** - Позитивный ответ среди неинфицированных пациентов.
*** - BCG-вакцинированные и невакцинированные пациенты

Некоторые формы туберкулеза (остро прогрессирующие) не могут быть выявлены методом профилактических обследований. Больные с такими процессами попадают в основном в больницы общего профиля, где диагностика их бывает затруднена из-за схожести рентгенологической картины с неспецифическими заболеваниями легких. Единственным методом достоверной диагностики в таких случаях является прямая бактериоскопия мокроты или применение IFN-γ-анализа. Все исследованные группы больных туберкулезом легких имели положительную реакцию с использованием микроскопических методов, культуральных, рентгеноскопии и молекулярно-биологических (ПЦР-анализ).

ЛИТЕРАТУРА

1. Nuket D., Stephen L.J. // Development of a human gamma interferon enzyme immunoassay and comparison with tuberculin skin testing for detection of Mycobacterium tuberculosis.// Infection Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 1998, V.5, №4, р.531-536.

2. Nakamura R.M., Velmonte M.A., KawajiriK, Ang C.F., Frias R.A., Mendoza M.T. et al. // MPB64 mycobacterial antigen: a new skin-test reagent through patch method for rapid diagnosis of active tuberculosis. // Int J Tuberc Lung Dis, 1998, №2 (7), р.541-546.

3. Wilkms EGL. // Antibody detection in tuberculosis. // In: Davies PDO, ed. Clinical tuberculosis, 2^nd ed. London: Chapman and Hall, 1998, p.81-95.

4. Imaz M.S., Zerbini E. // Antibody response to culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis during and after treatment of tuberculosis patients. // Int J Tuberc Lung Dis., 2000, №4(6), p.562-569.

5. Sonnenberg M.G. and Belisle J.T. // Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry. // Infect. Immun., 1997, V 65, №11, p.4515-4524.

6. Smith S.M., Brookes R., Klein M.R. et al. // Human CD8+ CTL specific for themycobacterial major secreted antigen 85 A. // J. Immunol., 2000, №165, p.7088-7095.

7. Reinout van Crevel, Tom H.M. Ottenhoff and Jos W.M. van der Meer // Innate Immunity to Mycobacterium tuberculosis. // Clinical Microbiology Reviews, 2002, V.15, №2, р.294-309.

8. Chackerian A.A., Perera T.V. et al. // Gamma Interferon-Producing CD4+ T Lymphocytes in the Lung Correlate with Resistance to Infection with Mecobacterium tuberculosis. // Infection and Immunity, 2001, V.69, №.4, p.2666-2674.

9. Ansar A.P., Wilkinson K.A., Klenerman P., McShane H., Davidson R.N., Pasvol G., Hill A.V.S. and Lalvani A. // Direct Ex Vivo Analysis of Antigen-Specific IFN-γ-Secreting CD4 Т Cells in Mycobacterium tuberculosis Infected Individuals: Associations with Clinical Disease State and Effect of Treatment. // The J. of Immunol., 2001, V.167, p.5217-5225.

10. Sodhi A., Gong J., Silva C., Qian D., Bames P.P. // Clinical correlates of interferon gamma production in patients with tuberculosis. // Clin Infect Dis., 1997, №25 (3), p.617-620.

11. Sorensen A.L., Nagai S., Houen G., Andersen P., Andersen A.B. // Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis. // Infect Immun, 1995, №63, p.1710-1717.

12. Harboe M., Oettinger Т., Wiker H.G., Rosenkrands I., Andersen P. // Evidence for occurrence of the ESAT-6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG. // Infect Immun 1996, №64, p.16-22.

13. Harboe M., Wiker G., Ulvund A.S., Malin H., Dockrell A.., Holm M.C., Andersen P. // B-cell epitopes and quantification of the ESAT-6 protein of Mycobacterium tuberculosis. II Infect Immun, 1998, №66, p.717-723.

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. M.: Мир. 1984.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Предложена рекомбинантная плазмида pTSE6, кодирующая гибридный полипептид GST-ESAT-6 со свойствами видоспецифичного микобактериального антигена ESAT-6. Плазмида имеет молекулярную массу 3,45 МДа и размер 5316 п.н. Предложен также рекомбинантный штамм E.coli, содержащий такую плазмиду, и рекомбинантный полипептид GST-ESAT-6. Рекомбинантный белок обладает свойствами видоспецифичного белка-антигена Mycobacterium tuberculosis ESAT-6. Группа изобретений позволяет облегчить процесс очистки рекомбинантного полипептида и получать высокоочищенный белок со свойствами микобактериального антигена ESAT-6 без деградации последнего. Изобретение может быть использовано для ранней видоспецифической диагностики туберкулезной инфекции. 3 н. ф-лы, 2 ил., 4 табл.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTSE 6, кодирующая гибридный полипептид GST-ESAT-6 со свойствами видоспецифичного микобактериального антигена ESAT-6, с молекулярной массой 3,45 МДа, имеет размер 5316 п.н. и состоит из следующих элементов:

EcoRI-BamHI - фрагмента векторной плазмиды pGEX-2T ("Pharmacia Biotech") размером 4938 п.н., содержащего ген β-лактамазы, индуцируемый Тас-промотор, внутренний lacI^q - ген, кодирующий белок - репрессор лактозного оперона, фрагмент гена глутатион-S-трансферазы из Schistosoma japonicum (GST) с множественным сайтом для клонирования генов в 3'-концевой части этого гена и сайт протеолиза тромбином в одной рамке считывания;

EcoRI - BamHI - фрагмента размером 378 п.н., содержащего фланкированный сайтами рестрикции EcoRI и BamHI полный ген esat-6, полученный амплификацией фрагмента генома Mycobacterium tuberculosis;

содержит:

в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pTSE 6 клеток Е.coli к антибиотику ампициллину;

уникальные сайты рестрикции: BamHI - 930, EcoRI - 1308.