СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/32 

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, а именно к культуральным методам выявления микобактерий комплекса M.tuberculosis, и может быть использовано при проведении противотуберкулезных мероприятий, в научно-исследовательских и производственных лабораториях медицинского и ветеринарного профиля.

Традиционно культуральные исследования диагностического материала осуществляют на плотных яичных и полусинтетических жидких средах, поскольку микобактерии туберкулеза требовательны к составу питательных сред и растут только на специальных, содержащих необходимый набор солей и аминокислот. Это отличает их от ряда других микобактерий, менее требовательных к питательным средам и растущих на стандартном мясопептонном агаре.

Известен культуральный способ выявления микобактерий методом прямого посева, при котором для получения чистых культур микобактерий контаминированный или биоматериал каждой исследуемой пробы после предварительной обработки высевают в 10 пробирок с селективной плотной яичной средой Левенштейна-Йенсена и одновременно по 10 пробирок еще не менее как на две из следующих селективных сред: Гельберга, Петраньяни, Финн-2, Мордовского, Новую, Фаст-3. В процессе инкубации еженедельно регистрируют результаты роста микобактерий (Наставление по диагностике туберкулеза. Утверждено Департаментом ветеринарии, 18 ноября 2002 г., п.6, стр.26-29).

Известный способ выявления микобактерий в чистом виде методом прямого посева на селективные питательные среды из любых биоматериалов ввиду своеобразия их биологических свойств имеет ряд существенных недостатков:

- макроскопический рост микобактерий выявляется чрезвычайно поздно, в сроки от трех недель до трех месяцев;

- накопление биомассы в первой генерации скудное;

- кроме того, при незначительном контаминировании микобактериями исследуемого биоматериала или в случае их ослабленной жизнеспособности видимые невооруженным глазом колонии этих микроорганизмов вообще могут не появиться;

- способы прямого посева на селективные плотные яичные питательные среды недостаточно информативны, трудоемки, малоэффективны, требуют значительных затрат времени и средств.

Задача изобретения - разработка эффективного высокоинформативного способа выявления микобактерий, обеспечивающего сокращение времени диагностики туберкулеза и снижение трудоемкости и материальных затрат на бактериологические исследования.

Технический результат - создание благоприятных условий для жизнедеятельности и эффективного роста микобактерий туберкулеза на питательной среде на основе стандартного мясопептонного агара, снижение продолжительности инкубирования посевов диагностического материала до 4-х суток.

Технический результат достигается тем, что в способе выявления микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, предусматривающем подготовку диагностического материала, его посев на плотную питательную среду, инкубацию и регистрацию результатов, в качестве питательной среды используют смесь стандартного мясопептонного агара и вазелинового масла при следующем соотношении компонентов, мас.%: мясопептонный агар - 95%, вазелиновое масло - 5%, а регистрацию результатов осуществляют через 24-48-72-96 часов.

Сущность изобретения заключается в том, что вазелиновое масло (С₅Н₁₂ - С₁₆Н₂₄) обогащает стандартный мясопетонный агар водородом и углеродом. Обладая сильно выраженными адсорбционными свойствами в отношении микобактерий, масло выступает в роли стимулятора, обеспечивающего необходимое ускорение для значительного сокращения времени их роста. После приготовления и застывания смеси масло оказывается на наружной поверхности питательной среды и в поверхностном слое создаются благоприятные условия для размножения и роста колоний микобактерий, в том числе и за счет аэрации. Выбранное соотношение вазелинового масла (5%) и МПА (95%) в питательной среде установлено экспериментально и является оптимальным для высокой чистоты индикации микобактерий при посевах патологических материалов, увеличения скорости их выделения, роста и накопления биомассы.

Для осуществления способа в качестве питательной среды используют мясопептонный вазелиновый агар, который представляет смесь стандартного мясопептонного агара, содержащего 2-3% агар-агара, ph-7,4-7,6, и стерильного вазелинового масла при соотношении компонентов, мас.%: вазелиновое масло - 5, мясопептонный агар - 95. Для ее приготовления к расплавленному мясопептонному агару (МПА), интенсивно помешивая, добавляют стерильное вазелиновое масло. После тщательного перемешивания и встряхивания смесь разливают в большие бактериологические пробирки и чашки Петри, стерилизуют в автоклаве при 120°С, при 1 атм в течение 30 минут. После стерилизации горячие пробирки с полученной питательной средой раскладывали наклонно под углом 5-6°, а чашки Петри оставляют на ровной поверхности стола, и далее их охлаждают при комнатной температуре. При застывании питательной среды образуется плотная влажная поверхность. На нее вносят по 1 мл суспензии подготовленного диагностического материала, приготовленной на стерильном физиологическом растворе в концентрации 2 млрд. микробных тел/мл по оптическому бактериальному стандарту. Диагностический материал для посевов используют после предварительной обработки, включающей измельчение, тщательное растирание со стерильным песком, обработку 6% раствором серной кислоты (в соотношении 1:4), центрифугирование в течение 15 мин при 3000 об/мин, двойное отмывание осадка стерильным физиологическим раствором и приготовление суспензии путем добавления к отмытому осадку стерильного физиологического раствора (1:4).

Инкубирование проводят в термостате при температуре 37-38°С. Для выявления начального роста микобактерий посевы просматривают через 24-48-72-96 часов. У выделенных первичных культур изучают и описывают:

- сроки обнаружения первичного роста;

- характер роста (отдельные колонии, их скопление, сплошной рост);

- характеристика колонии (величина, форма, поверхность, рельеф, конституция, эмульгируемость, пигментообразование);

- тинкториальные свойства микобактерий в мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену.

Для сравнительного изучения специфичности способа он был апробирован. В опыте использовали семь микобактериальных штаммов, полученных из музея ФГУ Всероссийского Государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (Mycobacterium tuberculosis №192, Mycobacterium bovis №14, Mycobacterium avium №961-97, Mycobacterium ihtracellularae №13, Mycobacterium scrofulaceum №13-S, Mycobacterium fortuitum №342 и Mycobacterium phlei №6-78); 15 проб биоматериала (средостенные лимфоузлы с типичными для туберкулеза изменениями), отобранные в условиях мясокомбината при убое туберкулинположительного крупного рогатого скота из неблагополучного по туберкулезу хозяйства Воронежской области и 9 проб не стерильной смеси земли и навоза из благополучной по туберкулезу крупного рогатого скота фермы, которые в условиях лаборатории кафедры искусственно контаминировали суспензиями 4-х музейных штаммов микобактерий: М. bovis-14, M.tuberculosis - 192, М. avium - 961-97, М. phlei-6-78. Для чего из каждой пробы готовили навески по 0,5 грамм, в которые параллельно добавляли по 10 мл суспензии, приготовленной на стерильном физиологическом растворе в концентрации 2 млрд. микробных тел/мл по оптическому бактериальному стандарту.

Музейные штаммы микобактерий для получения бактериальной массы выращивали на селективной среде Левенштейна-Йенсена в течение 3-4 недель. Чистоту культуры проверяли визуально и изучением мазков, окрашенных по Циль-Нильсену.

Для выявления первичных культур микобактерий использовали две плотные среды: стандартную, селективную яичную среду Левенштейна-Йенсена и мясопептонный вазелиновый агар (МПВА).

Подготовленные для исследования биоматериалы параллельно высевали на обе питательные среды. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37-38°С в течение 30-45 суток.

Для выявления начального роста микобактерий посевы просматривали каждые сутки и регистрировали результаты.

На мясопептонном вазелиновом агаре появление начального роста патогенных микобактерий - M.tuberculosis, M.bovis:

- в посевах музейных штаммов отмечено через 24-36-48 часов;

- в посевах биоматериалов (от животных и объектов внешней среды животноводческих ферм, искусственно контаминированных данными микобактериями) - через 48-72-96 часа;

Для M.avium - intracellularae, M.phlei - (во всех случаях) через 24-36-48 часов.

Кроме ускоренного роста всех видов микобактерий отмечено обилие колоний на поверхности питательной среды и интенсивное накопление их бактериальной массы.

Результаты исследований представлены в таблице, из которой видно, что скорость и интенсивность роста микобактерий разных видов зависит от способа выделения культуры, что указывает на специфичность способа в соответствии с изобретением.

Диапазоны сроков выявления первичных культур и интенсивности их роста в эти сроки существенно отражают различие способов выделения патогенных и непатогенных микобактерий в чистом виде из различных патологических материалов.

Использование предложенного способа выявления микобактерий туберкулеза позволяет значительно сократить сроки проведения диагностических исследований, в весьма короткие сроки получить значительное количество бактериальной массы в первой генерации, что имеет большое значение при изготовлении биопрепаратов (антигенов, аллергенов).

Предложенный способ экспрессен, обладает значительной разрешающей способностью и позволяет эффективно, в кратчайшие сроки, с наименьшими затратами средств и труда получить культуры микобактерий в чистом виде, что создает основу для своевременного и успешного проведения комплекса противотуберкулезных мероприятий.

ТаблицаВиды микобактерийСпособ выявления микобактерий туберкулезаИзвестный (на питательной среде Левенштейна-Йенсена)Заявленный на питательной среде мясопептонный агар+вазелиновое маслоСкорость роста (сут)интенсивность ростаСкорость роста (час)интенсивность ростаM.bovis-1424-30+24-48+++М.tuberculosis-19223-28+24-48+++M.avium-961-978-10+24-48+++M.intracellularae-38-10+24-48+++M.scrofixlaceum-13-s9-10+24-48+++M.fortuitum-3429-11++24-48+++M.phlei-6-785-6 24-48+++Биоматериал от КРС23-30 48-72-96+++Биоматериал из внешней среды искусственно контаминированный25-30,8-12 48-72-96+++Примечание: интенсивность роста:
(+) - единичные колонии
(++) - 10-15 колоний
(+++) - от 15-20 и более колоний

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарной и медицинской микробиологии. Способ выявления микобактерий предусматривает подготовку диагностического материала. Подготовленный диагностический материал засевают на плотную питательную среду, представляющую собой смесь стандартного мясопептонного агара и вазелинового масла. Инкубируют микобактерий в термостате. После инкубации осуществляют регистрацию результатов через 24-48-72-96 часов. Изобретение позволяет сократить сроки выявления микобактерий. 1 табл.

Способ выявления микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, предусматривающий подготовку диагностического материала, его посев на плотную питательную среду, инкубацию и регистрацию результатов, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют смесь стандартного мясопептонного агара и вазелинового масла при следующем соотношении компонентов, мас.%:

мясопептонный агар95вазелиновое масло5,

а регистрацию результатов осуществляют через 24-48-72-96 ч.