Способ получения антигена из Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201 молекулярной массой 28 кДа для изучения гуморального иммунного ответа Российский патент 2019 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской и ветеринарной иммунологии, а именно к лабораторной диагностике, и касается получения антигенов из клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201, которые могут в дальнейшем быть использованы в качестве дискретных структур при создании диагностической панели наиболее значимых микобактериальных антигенов и для изучения гуморального иммунного ответа в серологических реакциях у больных туберкулезом.

Туберкулез (ТБ) до настоящего времени остается самой страшной в смысле распространения, самой опасной в смысле неизлечимости эпизоотией, одной из 10 ведущих причин смертности: он свирепствует во всех странах мира, вызывая заболевания людей, крупного рогатого скота (КРС), который в свою очередь заражает людей, работающих в животноводстве и пищевой промышленности. Несмотря на успехи, достигнутые в борьбе с ТБ, эта инфекция остается одной из ведущих, наиболее сложных и экономически значимых в инфекционной патологии [1, 2].

В 2015 г. Организация Объединенных Наций (ООН) приняла Цели в области устойчивого развития (ЦУР) до 2030 года. Одной из задач этих целей является ликвидация глобальной эпидемии ТБ. Стратегия Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) по ликвидации туберкулеза 2016-2035, одобренная Всемирной ассамблеей здравоохранения в 2014 г., призывает сократить к 2030 г. количество случаев смерти от ТБ на 90%, а показатель заболеваемости ТБ на 80% по сравнению с 2015 годом. По оценкам ВОЗ в 2015 году во всем мире ТБ заболело 10,4 млн. людей, т.е. заболеваемость ТБ в мире составила 142 на 100 тыс. населения. Среди них 1,2 млн. (11%) составили больные ВИЧ инфекцией, у 480 тыс. человек развился ТБ с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ). В 2015 году ТБ стал причиной летальных исходов у 1,8 млн., включая 390 тыс. среди ВИЧ позитивных лиц и почти 200 тыс. среди больных МЛУ-ТБ [15]. В связи с актуальностью проблемы ТБ ВОЗ провела осенью 2017 года в г. Москве глобальную министерскую конференцию ВОЗ «Ликвидация туберкулеза в эпоху устойчивого развития: межсекторальные меры» призванную ускорить осуществление странами Стратегии ВОЗ «Остановить туберкулез» с целью достижения показателей по ТБ, установленных Всемирной ассамблеей здравоохранения, и ЦУР ООН. Итоги Конференции на уровне министров будут приняты к сведению Совещанием высокого уровня по ТБ Генеральной Ассамблей ООН в 2018 году [2, 3, 14]. На этой конференции было отмечено, что туберкулез является ведущей инфекционной болезнью, уносящей жизни людей во всем мире. С ним связаны глубокие экономические и социальные последствия. Продолжается кризис общественного здравоохранения, вызванный МЛУ-ТБ. Хотя с 2000 года мировые усилия позволили спасти 49 миллионов человек, мероприятия и инвестиции крайне малы, чтобы положить конец эпидемии ТБ. Необходимы межсекторальные усилия высокого уровня, а меры в отношении ТБ могут служить показателем осуществления повестки дня в области ЦУР [14].

На современном этапе борьбы с ТБ, основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остается проблема ранней диагностики этой болезни. Поэтому, наряду с общепринятыми методами диагностики ТБ, необходимы исследования современными методами, такими как серологическая диагностика с использованием маркерных антигенов, специфичных для M.bovis, М.tuberculosis, BCG, молекулярно-биологические исследования, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР) для уточнения диагноза в спорных вопросах [12]. Выделение самой микобактерии из мокроты, мочи, либо других биологических секретов является доказательной и основной частью диагностики ТБ. Однако выделение микобактерий происходит только когда в результате активного заболевания очаг уже разрушен, ткани повреждены, а размножающиеся микобактерий из очага поступают во внешнюю среду (открытая форма ТБ). Но даже при наличии активного заболевания с открытой формой, в исследуемом материале может быть слишком мало микобактерий для обнаружения их путем посева или микроскопии (низкая чувствительность 40-50% при концентрации микобактерий 1000-10000 кл/мл, а при концентрации микобактерий не более 1000 кл/мл отрицательные результаты отмечаются в 96% случаев) [16].

Проблема совершенствования диагностики ТБ имеет своей целью поиск способов ранней доклинической диагностики болезни (включая латентные формы заболевания) и решения ряда задач, связанных с дифференциальной диагностикой ТБ, туберкулиновых реакций, вызванных сенсибилизацией организма атипичными микобактериями и микобактериями птичьего вида [4, 5, 6].

Предпосылкой для разработки методов серологической диагностики ТБ является тот факт, что при активации инфекции отмечается интенсивный синтез микобактериальных антигенов, являющихся активаторами запуска иммунокомпетентных клеток [7, 12]. Вариабельность антигенной структуры туберкулезных микобактерий на разных стадиях инфекционного процесса, наличие у него большого количества антигенов, а также вариабельная иммуногенность последних служат объективными причинами того, что до настоящего времени не разработано ни одного серологического теста, обладающего настолько высокой чувствительностью, чтобы им можно было бы заменить или дополнить применяемые в настоящее время «устаревшие» методы диагностики ТБ (Золотой стандарт: флюорография, реакция Манту, бактериологический посев). Во многих научных центрах мира активно ведутся поисковые работы по выявлению и выделению специфических туберкулезных антигенов [8-11].

Наиболее близким по совокупности признаков и достигаемому результату к заявленному техническому решению является способ получения антигенов [13], растворимых в изотоническом растворе хлорида натрия. Этот способ включает получение бактериальной взвеси в сухом виде путем троекратной обработки ацетоном, а затем эфиром и последующим высушиванием. Затем к 40 мг высушенной биомассы вносят 10 мл изотонического раствора хлорида натрия, 30 минут интенсивно встряхивают, после чего инкубируют 24 часа при комнатной температуре, центрифугируют 20 мин при 9000 об/мин, сливают прозрачный центрифугат. Полученный экстракт используют в качестве антигенного препарата в серологических реакциях, а именно в реакции преципитации. В исследованиях сывороток больных методом иммуноблотинга этот материал малоэффективен из-за низкой доли специфических и значимых для диагностики ТБ антигенов, слишком высокого содержания балластного материала, что является существенным недостатком рассмотренного способа получения антигенов. К отмеченному недостатку, вероятно, приводит обработка бактериальных клеток неразбавленным ацетоном, затем эфиром и последующее высушивание, в результате чего происходит деструктивное разрушение и вымывание липидов мембранных комплексов и, как следствие этого, облегченная экстракция (изотоническим раствором) клеточного материала.

Задачей заявляемого способа является выделение антигена молекулярной массой 28 кДа, из разрушенных клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201, культивированных на твердой питательной среде Левенштейна-Йенсена, исключая использование продуктов экспрессии.

Цель настоящего изобретения заключалась в разработке способа получения антигена молекулярной массой 28 кДа из Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201, который обладал бы высокой специфичностью и активностью, использование которого в серологических тестах для клинической практики дало бы дополнительную информацию о гуморальном иммунном ответе при ТБ к данному антигену в реакциях иммуноблотинга и ИФА и охватило бы большее количество пациентов с подозрением на туберкулезную инфекцию.

Поставленная задача достигается тем, что в предлагаемом способе отмытые клетки Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201 трижды подвергают разрушению в гомогенизаторе Fast Prep 24™ в течение 45 с при скорости вибрации 6,5 мл/с, удаляют разрушенные клетки с помощью центрифугирования при 7000 об/мин, выдерживают супернатант при +4-6°С в течение 10 суток, повторно удаляют спонтанный осадок центрифугированием, добавляют к супернатанту лизирующий буфер, содержащий 0,2% додецилсульфата натрия, 0,1% 2-β меркаптоэтанола, выдерживают пробы при 100°С 10 мин., фракционируют на колонке с использованием 9% полиакриламидного геля (далее - ПААГ).

Предполагаемое изобретение поясняется чертежами, на которых изображены:

Рис. 1 - Результаты иммуноблотинга сывороток индивидуальных пациентов, больных туберкулезом с полными клеточными лизатами М. bovis штамм Valee-88, M.bovis-Bovinus-8 штамм 700201, M.intraracellulare N 13N, M.avium, M.tuberculosis H37Rv TBC, штамм 700403f, BCG.

Рис.2 - Гистограмма препаративного фракционирования исходного материала супернатанта, полученного разрушением на гомогенизаторе Fast Prep 24™ клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201.

Рис. 3 - Результаты иммуноблотинга отдельных фракций, полученных препаративным электрофорезом в полиакриламидном геле.

Рис. 4 - Денситограммы фракций, полученных препаративным электрофорезом в 9% полиакриламидном геле.

Рис. 5 - Показатели ОП ИФА фракции №9 с гипериммунной сывороткой крови кролика.

Заявляемое техническое решение отличается от прототипа тем, что клеточная масса отмывается от остатков питательной среды, суспендируется 3-5 мин в 0,1 М ФБР, рН 7,2-7,4 в стеклянном гомогенизаторе для получения однородной массы микобактерий, снятых с твердой питательной среды, затем гомогенные клетки разрушают на приборе MP Biomedicals FastPrep-24™ Instrument с использованием пробирок Blue Lysing Matrix В с шариками из карбида кремния, диаметром 0,1 мм (объем пробирки - 2 мл). Режим обработки: скорость вибрации 6,5 мл/с, время обработки 45 с, количество повторов - 3, временной интервал между обработками 10 мин. По окончанию обработки пробирки выдерживают не менее 5 мин при комнатной температуре для осаждения частиц карбида кремния, осторожно отбирают не осевшую, верхнюю часть раствора. Отобранный материал трижды встряхивают на Vortex V 1 plus (BioSan) по 50 с, интервал между встряхиваниями составляет 3 мин, затем взвесь центрифугируют 7 мин. при 13000 об/мин. К отобранному супернатанту добавляют лизирующий буфер, состоящий из 0.0625М трис-HCl (рН 6.8), 0,2% SDS и 0,1% 2-β-меркаптоэтанола, разливают по 1 мл в 1,5 мл пробирки эппендорф и помещают их в термошейкер TS 100, используя термоблок SC 18 (12×1,5 мл) «BIOSAN». Пробы инкубируют 10 мин. при 100°С, скорость вращения термоблока - 500 RPM (полученный материал служит основным для проведения дальнейших работ). Далее пробы вносят в колонку прибора Mini Prep Cell фирмы BIO RAD. Фракционирование антигенного материала проводят на 17 см колонке, заполненной 9% ПААГ. Пробы собирают на коллекторе фракций FRAC 100 (Pharmacia LKB), спектрофотометрический контроль осуществляют при помощи Optical unit UV-1 и Control Unit UV-1 (LKB), результаты документируют на самописце Recoder Rec, модель 102 (LKB), скорость элюции регулируют перестальтическим насосом Peristaltic pump Varioperpex (LKB). Условия разделения: напряжение 0,25 А, скорость элюции 500 мкл/10 мин.. Белковый состав определяют аналитическим электрофорезом в 12,5% ПААГ, в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия по Laemmli U.K. [18], перенос на нитроцеллюлозную мембрану (Suppoted nitrocellulose membrane 0,45 μm, 30 cm×3 m roll фирмы BIO RAD) осуществляют по Towbin Н. [19], серологическую активность определяют в реакции имуноблотинга с использованием гипериммунной сыворотки крови кроликов, полученной путем гипериммунизации кроликов нативными клетками Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201 по описанному ранее методу [17].

Ранее проведенные исследования по изучению серологической активности индивидуальных сывороток крови больных ТБ к полным клеточным лизатам микобактерий (М bovis штамм Valee-88, М. bovis Bovinus-8 штамм 700201, M.intraracellulare N 13N, M.avium, М.tuberculosis H37Rv TBC, штамм 700403f, BCG-1) показали высокую активность антигенов полных клеточных лизатов М. bovis Bovinus-8 штамм 70020J и BCG-1, молекулярная масса которых располагалась в области 26 кДа и 28-30 кДа из которых наибольший интерес представлял антиген с молекулярной массой 28 кДа, показавший наибольшую активность. При скрининговом обследовании индивидуальных сывороток больных ТБ серологическая активность к антигену М. bovis Bovinus-8 штамм 700201 молекулярной массой 28 кДа регистрировалась у 35-40% пациентов. Этот факт явился предпосылкой проведения работ по выделению антигена с молекулярной массой 28 кДа из клеток M.bovis Bovinus-8 штамм 700201, показавшим мажорную серологическую активность с сыворотками крови больных ТБ, для дальнейшего изучения свойств дискретного препарата антигена 28 кДа и использования его в серологических реакциях при изучении гуморального иммунного ответа у ТБ пациентов. Полученные результаты иммуноблотинга полных клеточных лизатов микобактерий на примере 2-х индивидуальных сывороток крови больных ТБ поясняются рисунком 1.

Антиген из M.bovis Bovinus-8 штамм 700201 для изучения гуморального иммунного ответа в реакции иммуноблотинга у больных ТБ получают следующим способом.

Пример 1. Исходным сырьем для получения антигена служат клетки Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201, выращенные на твердой питательной среде Левенштейна Йенсена в течение 30 сут.

1. Клетки Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201, полученные из Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (г. Москва), адаптировали к среде Левенштейна-Йенсена в течение 6 месяцев, постепенно снижая время между пересевами с 60 до 30 сут.

2. Клетки снимали с поверхности твердой питательной среды скребком, промывали от остатков питательной среды дистиллированной водой, отделяя клетки центрифугированием при 7500 об/мин (+8-10°С) в течение 30 мин, супернатант декантировали, осадок заливали новой порцией дистиллированной воды, встряхивали на вортексе и вновь центрифугировали. Данную процедуру повторяли три раза.

3. Осадок отмытых клеток гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе не менее 3-5 мин для получения однородной массы в 0,1 М ФБР (фосфатный буферный раствор), рН 7,2-7,4, клетки вновь осаждали центрифугированием при 7500 об/мин (+8-10°С) 30 мин. Супернатант сливали в стерильную емкость, осадок вновь гомогенизировали, доводя консистенцию до однородной массы и вновь осаждали центрифугированием. Данную процедуру повторяли 5 раз.

4. После последнего центрифугирования к осадку клеток добавляли 0,1 М ФБР, рН 7,2-7,4, клетки вновь гомогенизировали и разводили по стандарту мутности до конечной концентрации 10 млрд. клеток/мл.

5. 10 млрд. взвесь клеток в объеме 1,8 мл вносили в 2 мл пробирки Blue Lysing Matrix В с шариками из карбида кремния, диаметром 0,1 мм (объем пробирки 2 мл) и 3 раза обрабатывали на гомогенизаторе FastPrep 24™. Режим обработки: скорость вибрации 6,5 мл/с, время обработки 45 с, количество повторов - 3, временной интервал между обработками 10 мин.

6. Разрушенную клеточную массу выдерживали в пробирках Blue Lysing Matrix В не менее 5 мин до полного осаждения шариков карбида кремния, раствор осторожно отбирали в пробирки эппендорф, объемом 2,0 мл, центрифугировали при 13000 об/мин (8-10°С), супернатант декантировали в отдельную емкость. В пробирки Blue Lysing Matrix В вновь добавляли 1,5 мл 0,1 М ФБР, рН 7,2-7,4, встряхивали на вортексе в течение 50 с, интервал между встряхиваниями составлял 3 мин, выдерживали не менее 5 мин до полного осаждения шариков карбида кремния, раствор осторожно отбирали в пробирки эппендорф объемом 2,0 мл, центрифугировали при 13000 об/мин (8-10°С), супернатант объединяли с супернатантом после 1-го центрифугирования. Данную процедуру повторяли 3 раза.

7. К отобранному супернатанту добавляли лизирующий буфер (0,0625 М трис-HCl (рН 6.8), 0,2% SDS и 0,1% 2-β-меркаптоэтанола), перемешивали, разливали по 1 мл в 1,5 мл пробирки эппендорф и помещали их в термошейкер. Пробы выдерживали 10 мин при 100°С скорость вращения термоблока составляла 500 RPM. Приготовленный таким образом препарат являлся исходным материалом для дальнейшей работы.

Пример 2. Супернатант обработанный лизируюшей смесью при 100°С далее использовали для препаративного выделения на приборе Mini Prep Cell фирмы BIO RAD.

1. В стеклянную трубку диаметром 0,5 мм, длиной 17 см вносили 9% ПААГ с катализаторами до отметки 14 см, оставляли на ночь (на 10-12 часов) до полной полимеризации, далее до отметки 15 см вносили концентрирующий гель (2 см), и выдерживали 40 мин до завершения полимеризации. До отметки 16 см (1 см) вносили термически обработанный супернатант, на него осторожно наслаивали трис-глициновый электродный буфер (0,025 М и 0,193 М соответственно), содержащий 0,1% SDS. Верхний и нижний концы стеклянной трубки соединяли с резервуарами, содержащими электродный буфер и подавали напряжение. Процесс разделения вели при постоянной силе тока.

2. Пробы собирали на коллекторе фракций FRAC 100 (Pharmacia LKB), спектрофотометрический контроль оптической плотности осуществляли при длине волны 280 нм на Optical unit UV-1 и Control Unit UV-1 (LKB), результаты детектировали на самописце Recoder Rec, модель 102 (LKB), скорость движения бумаги составляла 0,5 мм/мин, скорость элюции регулировали перестальтическим насосом Peristaltic punp Varioperpex (LKB). Условия разделения: напряжение 0,25 А, скорость элюции 500 мкл/10 мин. Полученные результаты препаративного электрофореза поясняются рисунком 2.

3. Аналитический электрофорез отобранных фракций проводили в 12,5% ПААГ, в присутствии 0,1% SDS и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану после переноса промывали и высушивали. Иммуноблотинг проводили с гипериммунной сывороткой крови кролика, полученной против нативных клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201. Полученные результаты иммуноблотинга поясняются рисунком 3.

Результаты документировали на системе гельдокументирования Gel Doc XR+ фирмы BIO RAD, и обрабатывали с использованием программы Image Lab Software 5.1. Результаты программной обработки в виде денситограмм поясняются рисунком 4.

По результатам анализа денситограмм фракция №9 представляла мономерный антиген с высокой серологической активностью. Анализ денситограмм фракций №10, 11, 12 выявил разделение мономерной фракции на 2 составляющие (димер: 2 мономера). Антиген №9 препаративно нарабатывался в количестве достаточном для проведения исследований, объединялся и использовался для дальнейшей работы.

Пример 3. Препаративно наработанная фракция №9 была также использована для сенсибилизации лунок стрипированных планшетов ВНИИ «Медполимер» для определения его специфичности и активности в ИФА.

1. Фракцию №9 вносили в стрипированные лунки планшета ВНИИ «Медполимер» в объеме 120 мкл с последовательным двукратным разведением, планшеты выдерживали 24 часа при комнатной температуре.

2. По истечению 24 часов, планшеты трижды промывали дистиллированной водой и высушивали при комнатной температуре.

3. Реакцию иммуноферментного анализа (ИФА) проводили с гипериммунной сывороткой крови кролика, полученной к нативным клетам Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 70020J. В качестве конъюгата использовали anti rabbit IgG, меченный пероксидазой, производства фирмы «Sigma». Полученные результаты ИФА поясняются рисунком 5.

Приведенные результаты ИФА свидетельствуют о высокой специфичности фракции №9 к гипериммунной сыворотке крови кролика, полученной против нативных клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 700201.

Таким образом, фракция №9 может в дальнейшем использоваться в качестве маркерного антигена для создания диагностической панели при разработке ИФА и мультиплексных тестов для выявления специфических антител в сыворотке крови больных туберкулезом.

Список литературы

1. Васильева И. А., Белиловский Е. М., Борисов С.Е., Стерликов С.А. Глобальные отчеты Всемирной организации здравоохранения по туберкулезу, формирование и интерпретация // Туберкулез и болезни легких. - 2017. - Т. 95, №5. - С. 7-16.

2. Васильева И. А., Белиловский Е. М., Борисов С.Е., Стерликов С.А. Заболеваемость, смертность и распространенность как показатели бремени туберкулеза в регионах ВОЗ, странах мира и в Российской Федерации. Часть 1. Заболеваемость и распространенность туберкулеза // Туберкулез и болезни легких. - 2017. - Т. 95, №6. - С. 9-21.

3. Васильева И.А. Обращение главного редактора журнала Туберкулез и болезни легких, президента РОФ/АФР, президента фонда им. М.И. Перельмана, главного фтизиатора Минздрава России // Туберкулез и болезни легких, 2017 г., т. 95, №4, с. 5.

4. Гулюкин A.M., Хисматуллина Н.А., Хаертынов К.С. и др. Использование антигенов микобактерий M.bovis BCG-1, M.bovis-8 и M.bovis Valee-88 для иммуноферментного анализа сывороток крови крупного рогатого скота // Труды Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. - 2013. - Т. 77. - С. 200-203.

5. Цибулькин А.П., Хаертынова И.М., Уразов Н.Г., Хаертынов К.С. Скрининг диагностического потенциала нативных белковых фракций Mycobacterium tuberculosis методом иммуноблоттинга // Клиническая лабораторная диагностика. - 2016. - Т. 61, №2. - С. 90-102.

6. Сотников Д.В., Жердев А.В., Авдиенко В.Г., Дзантиев Б.Б. Иммунохроматографическая серодиагностика туберкулеза с использованием конъюгата коллоидное золото-антиген // Биотехнология. - 2015. - №2. - С. 76-81.

7. Яковлева Л.Ф. Сравнительная эффективность иммуноферментных тест-систем для выявления маркеров туберкулезной инфекции. Иммунология, аллергология, инфектология. 2007, №2: 59-64.

8. Валиев Р.Ш., Валиев Н.Р., Хаертынова И.М., Хаертынов К.С. Анти-ТБ антитела класса IgG в сыворотке крови больных туберкулезом, ВИЧ-инфекцией и при их сочетании // Туберкулез и болезни легких. - 2014. - Т. 91, №9. - С. 14-15.

9. Хисматуллина Н.А., Хаертынов К.С., Шуралев Э.А., Гулюкин A.M., Ахмадеев P.M., Найманов А.Х. Получение антигенов микобактерий M.bovis BCG-1, M.bovis-S и M.bovis Valee для дифференциации поствакцинальных и постинфекционных антител // Ветеринарная медицина. - 2013. - №97. - С. 558-560.

10. Шуралев Э.А. Микобактериальные антигены: синтетические пептиды и рекомбинантные белки // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2013. - Т. 216. - С. 403-407.

11. Дятлова В.И., Богун А.Г., Бикетов С.Ф. Оценка серодиагностического потенциала рекомбинантных антигенов Mycobacterium tuberculosis, полученных в разных экспрессионных системах // Биотехнология. - 2014. - №1. - С. 72-78.

12. Яковлева Л.Ф., Лысенко А.П., Суркова Р.К. и др. Иммунный спектр сыворотки крови при различных формах туберкулеза и его влияние на результативность серологической диагностики. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2004, 2: 129-132.

13. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под редакцией М.О. Биргера, Москва, «Медицина», 1982, с. 141-142.

14. Всемирная организация здравоохранения. Доклад о глобальной борьбе с туберкулезом 2016 год.

15. Global Tuberculosis Report 2016. WHO/HTM/ТВ/ 2016.13. Geneva World Health Organization, 2016.

16. M.O. Odubanjo, Н.О. Dada-Adegbola The microbiological diagnosis of tuberculosis in a resource - limited setting: is acid-fast bacilli microscopy alone sufficient. Ann Ibd. Pg. Med 2011. Vol. 9, No. 1 24-29.

17. Bailey, G.S. The production of antisera / G.S. Bailey // Methods in Molecular Biology. - 1984. - V. 1. - P. 295-300.

18. Laemmli, U.K. Cleavage structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.

19. Towbin H., Staehelint Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979; 76 (9): 4350-4354.

Рис. 1

Результаты иммуноблотинга сывороток крови индивидуальных пациентов, больных туберкулезом с полными клеточными лизатами М. bovis штамм Valee-88, М. bovis Bovinus-8 штамм 700201, MAntraracellulare N 13N, М. avium, М. tuberculosis H37Rv ТВС, штамм 700403f, BCG

1 - М. bovis штамм Valee-88, 2-M.bovis Bovinus-8 штамм 700201, 3-Mintraracellulare N 13N, 4-M.avium, 5-M.tuberculosis H37Rv ТВС штамм 700403f, 6-вакцинный штамм БЦЖ-1 (производитель Микроген), М-маркер молекулярных масс Broad Range (Bio Rad).

Рис. 2

Гистограмма препаративного фракционирования исходного материала супернатанта, полученного разрушением на гомогенизаторе Fast Prep 24™ клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201.

По оси абсцисс - номера фракций по оси ординат - оптическая плотность, выраженная в единицах оптической плотности (ед.оп.) при длине волны 280 нм. Данные получены при использовании Optical unit UV-1 и Control Unit UV-1 (LKB), самописца Recoder model 102 (LKB).

Рис. 3

Результаты иммуноблотинга отдельных фракций, полученных препаративным электрофорезом в полиакриламидном геле. 4-19 номера фракций, собранных на коллекторе фракций и взятых для переноса на нитроцеллюлозную мембрану (Nitrocellulose Membranes, 0,45 μm, transfer of a broad range of proteins and nucleic acid, Bio Rad Laboratoris, Germany). Для выявления серологической активности фракций использовали гипериммунную сыворотку кролика, полученную к нативным клеткам Mycobacterium bovis Bovinus -8 штамм 700201.

Рис. 4

Денситограммы фракций, полученных препаративным электрофорезом в 9% полиакриламидном геле

Рис. 5

Показатели ОП ИФА фракции №9 с гипериммунной сывороткой крови кролика

К+ гипериммунная сыворотка крови кролика, полученная к нативным клеткам Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201;

К- отрицательная сыворотка крови кроликов (пул).

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения антигена из Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201 молекулярной массой 28 кДа для изучения гуморального иммунного ответа, включающий культивирование возбудителя на твердой питательной среде среде Левенштейна-Йенсена, разрушение отмытых клеток и фракционирование препаративным электрофорезом, где отмытые клетки трижды подвергают разрушению в гомогенизаторе Fast Prep 24 в течение 45 сек при скорости вибрации 6,5 мс, удаляют разрушенные клеток с помощью центрифугирования при 7000 об/мин, выдерживают супернатант при +4-6°С в течение 10 дней, повторно удаляют спонтанный осадок центрифугированием, добавляют к супернатанту лизирующий буфер, содержащий 0,2% додецилсульфата натрия, 0,1% 2-β меркаптоэтанола, выдерживают пробы при 100°С 10 минут, фракционируют на колонке, с использованием 9% полиакриамидного геля. Изобретение позволяет получить антиген обладающий высокой специфичностью и активностью. 5 ил.

Способ получения антигена из Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201 молекулярной массой 28 кДа для изучения гуморального иммунного ответа, включающий культивирование возбудителя на твердой питательной среде Левенштейна-Йенсена, разрушение отмытых клеток и фракционирование препаративным электрофорезом, отличающийся тем, что отмытые клетки трижды подвергают разрушению в гомогенизаторе Fast Prep 24 в течение 45 сек при скорости вибрации 6,5 мс, удаляют разрушенные клетки с помощью центрифугирования при 7000 об/мин, выдерживают супернатант при +4-6°С в течение 10 дней, повторно удаляют спонтанный осадок центрифугированием, добавляют к супернатанту лизирующий буфер, содержащий 0,2% додецилсульфата натрия, 0,1% 2-β меркаптоэтанола, выдерживают пробы при 100°С 10 минут, фракционируют на колонке, с использованием 9% полиакриамидного геля.