СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИКЛИЧЕСКОГО ПЕПТИДА - ОКТРЕОТИДА Российский патент 2011 года по МПК C07K1/02 C07K1/06 C07K7/06 C07K14/655 

Изобретение относится к получению циклических пептидов, в частности октреотида, используемого в фармацевтической химии.

Октреотид I является синтетическим аналогом соматостатина, который обладает сходным профилем фармакологической активности, но значительно превосходит природный пептид по силе и длительности действия. Подобно соматостатину он ингибирует секрецию пептидных гормонов гастропанкреатической эндокринной системы (инсулина, глюкагона, гастрина и пр.), а также гормона роста.

Октреотид применяется как лекарственное средство для лечения акромегалии, опухолей гастропанкреатической эндокринной системы, а также используется как действенное средство профилактики осложнений в панкреатической хирургии. Хелатные аналоги октреотида, меченные радиоактивными изотопами, например, индия, рения и технеция применяются для локализации опухолей методами компьютерной сцинтиграфии.

Октреотид представляет собой циклический октапептид следующей структуры:

Особенностями его структуры являются:

- наличие двух D-аминокислот;

- наличие дисульфидного цикла;

- восстановленный С-концевой остаток треонина (треонинол);

- высокое содержание гидрофобных ароматических аминокислот.

Существенным с точки зрения химического синтеза является также наличие неустойчивого к действию окислителей и сильных кислот остатка триптофана. Синтез октреотида может быть осуществлен как твердофазным методом, так и классическими методами пептидного синтеза в растворе.

Патент США 4395403, 26.07.1983, описывает способ синтеза октреотида в растворе. По этому способу из защищенных дипептидных сегментов синтезируется защищенный октреотид, содержащий остаток С-трет-бутоксикарбонил-лизина и остатки цистеина, блокированные п-метоксибензильными группами, который затем подвергается полному деблокированию действием трифторацетата бора и тиоанизола в трифторуксусной кислоте и окислению кислородом воздуха в разбавленном водном растворе.

Подобный способ деблокирования требует применения больших объемов органических растворителей (>1 л/г) для выделения деблокированного пептида; кроме того, существует риск частичной деструкции остатка триптофана при действии сильных кислот на стадии финального деблокирования.

Основные проблемы синтеза октреотида твердофазным методом связаны с наличием в его молекуле С-концевого остатка треонинола. Треонинол не содержит карбоксильной группы, что не дает возможности использовать традиционные методы присоединения первой (С-концевой) аминокислоты к полимерной матрице. В работе W. В. Edwards et al. (J. Med. Chem. 1994, 373749) синтез осуществляли, начиная с предпоследнего остатка Cys(Acm), присоединенного к полимеру сложноэфирной связью. После сборки пептид окисляли до дисульфида на полимере, затем получали защищенный [D-Trp(Boc)⁴, Lys(Boc)⁵, Тhr(Вu^t)⁶]- октреотид путем аминолиза пептидил-полимера избытком треонинола. Аминолиз протекал очень медленно, и общий выход защищенного пептида составил 14%.

Более эффективным оказался способ Y. Arano et al. (Bioconjugate Chem. 1997, 8, 442), которые синтезировали октреотид, начиная с остатка Fmoc- Thr(Bu^t)-ol, присоединенного к 2-хлортритильному полимеру. Однако синтез необходимого для этой цели защищенного производного треонинола представляет отдельную непростую задачу.

В патенте США 5889146, 30.03.1999, описан синтез октреотида, в котором С-концевой остаток треонинола присоединяли к полимеру путем образования циклического ацеталя с полимерсвязанным терефталевым альдегидом. Такой циклический ацеталь обеспечивает одновременную защиту обеих гидроксильных групп треонинола и легко расщепляется кислотными реагентами в условиях удаления защитных групп трет-бутильного типа.

Следует отметить, что известные твердофазовые способы получения октреотида разработаны в основном с целью последующего синтеза конъюгатов с хелатами, биотином и другими маркерными молекулами, реализованы в микромасштабе (0,1-0,25 ммоль) и практически не пригодны для синтеза октреотида в граммовых и более количествах, так как предполагают использование малодоступных и дорогостоящих исходных материалов - защищенных аминокислот, специальных полимеров и конденсирующих реагентов для твердофазового синтеза.

Известен способ получения октреатида с использованием ацетата ртути и сероводорода для снятия асетамидометильной защиты с последующей окислительной циклизацией раствором перекиси водорода (Russian Journal of Bioorganic Chemistry; V.30, №2, p.101-110, 2004).

Недостатком этого метода является использование высокотоксичных реагентов - ацетата ртути и сероводорода.

Наиболее близким по технической сущности к описываемому способу является способ получения октреатида, основанный на снятии асетамидометильной защиты и дальнейшей циклизации с использованием раствора иода в 90-95%-ном метаноле (WO 03097/668, 27.11.2003).

Недостатком известного способа является использование большого количества метанола, применение водно-метанольных растворов с пониженным содержанием метанола невозможно ввиду ограниченной растворимости иода в воде.

Таким образом, существует необходимость в эффективных и масштабируемых способах получения октреатида.

Технической задачей данного изобретения является упрощение процесса получения и повышение экологической чистоты производства - исключением токсичных реагентов: ацетата ртути и сероводорода, и значительным снижением необходимомго количества метанола.

Поставленная техническая задача достигается новым способом получения циклического пептида октреатида, заключающимся в том, что синтез осуществляют жидкофазным методом путем окислительной циклизации пептида формулы (II):

D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol (II)

или защищенного пептида формулы (III):

D-Phe-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol(III)

в присутствии в качестве окислителя и деблокирующего агента трииодида калия в водно-метанольном растворе и последующего выделения октреотида в виде соли с трифторуксусной кислотой и очистки высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Исходные линейные пептиды формул (II) и (III) используют в виде солей с трифторуксусной кислотой.

В общей формуле пептида (III) (Acm) обозначает защитные ацетоамидометильные группы; Thr-ol - остаток L-треонинола [(2S,3R)-1,3-дигидрокси-2-аминобутана.

Ниже приводятся сведения, иллюстрирующие заявленное изобретение в виде экспериментальных данных.

Таким образом, решение поставленной задачи достигается заявленным способом, который заключается в том, что синтез октреотида осуществляется в растворе путем окислительной циклизации пептида формулы: D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol либо его защищенного производного формулы: D-Phe-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol с использованием нового для этого процесса реагента - трииодида калия, гораздо лучше растворимого как в воде, так и в водно-метанольных растворах по сравнению с иодом.

Экспериментальная часть.

Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Shimadzu. Колонка: Grom-Sil 12J ODS-4HE, 5µm, 250*4,6 mm. Условия: градиент с 20%В до 40%В за 20 минут, А - вода+фосфатный буфер, рН 3, В - ацетонитрил.

Описываемый способ иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его.

Пример 1.

К раствору 142,7 гр (0,34 моль) трииодида калия в 2900 мл 30% водного метанола при интенсивном перемешивании и температуре 22-25°С по каплям в течение 6 часов прибавляют раствор 109,6 г (0,077 моль) бис-трифторацетата D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol (содержание основного вещества по данным ВЭЖХ 87,8%) в 800 мл 10% водного метанола. По окончании прибавления реакционную массу перемешивают дополнительно 1 час при комнатной температуре и охлаждают до 0-5°С. При этой температуре последовательно при перемешивании приливают 520 мл 1N раствора сульфита натрия в воде, 175 мл 4N раствора гидрооксида натрия в воде и 75 мл ледяной уксусной кислоты. Анализ ВЭЖХ показал содержание октреотида в реакционной массе в пересчете на основание 68,2 г (86,9% от теоретического выхода). Выделение и очистку конечного продукта производят методами препаративной ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография).

Пример 2.

К раствору 222,5 г (0,53 моль) трииодида калия в 4700 мл 30% водного метанола при интенсивном перемешивании и температуре 27-30°С по каплям в течение 6 часов прибавляют раствор 155,9 г (0,094 моль) бис-трифторацетата D-Phe-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol (содержание основного вещества по данным ВЭЖХ 83,9%) в 1000 мл 10% водного метанола. По окончании прибавления реакционную массу перемешивают дополнительно 1 час при комнатной температуре и охлаждают до 0-5°С. При этой температуре последовательно при перемешивании приливают 810 мл 1N раствора сульфита натрия в воде, 273 мл 4N раствора гидрооксида натрия в воде и 117 мл ледяной уксусной кислоты. Анализ ВЭЖХ показал содержание октреотида в реакционной массе в пересчете на основание 79,2 г (82,7% от теоретического выхода). Выделение и очистку конечного продукта производят методами препаративной ВЭЖХ.

Как видно из вышеприведенных примеров, описанный способ отличается простотой, отсутствием токсичных реагентов и пригоден для получения целевого продукта с высоким выходом.

Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к способу получения октреотида жидкофазным методом путем окислительной циклизации с использованием в качестве окислительного и деблокирующего реагента трииодида калия в водно-метанольном растворе. Способ отличается простотой, отсутствием токсичных реагентов и высоким выходом целевого продукта.

Способ получения циклического пептида - октреотида:

в виде соли с трифторуксусной кислотой, заключающийся в том, что синтез осуществляют жидкофазным методом путем окислительной циклизации пептида формулы:
D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol (II)
или защищенного пептида формулы (III)
D-Phe-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol (III),
где (Acm) - защитные ацетамидометильные группы в присутствии в качестве окислительного и деблокирующего агента реагента трииодида калия в водно-метанольном растворе с последующим выделением и очисткой октреотида методом высокоэффективной жидкофазной хроматографии, при этом исходные пептиды формул (II) и (III) используют в виде солей с трифторуксусной кислотой.