ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ С ЗАЩИТНЫМИ ГРУППАМИ ВОС И FMOC Российский патент 2012 года по МПК C07K1/04 C07K7/06 C07K14/655 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу приготовления пептида, содержащего три или более аминокислотных остатков, имеющего N-концевую аминокислоту, предпоследнюю аминокислоту, прилегающую к N-концевой аминокислоте, и С-концевую аминокислоту.

Предшествующий уровень техники

Твердофазный синтез пептидов был введен в 1963 г. с целью преодолеть многие из проблем промежуточных стадий очистки, связанных с синтезом пептидов в растворе (Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2^nd ed., 1984). При твердофазном синтезе аминокислоты собираются (например, соединяются) в пептид любой необходимой последовательности, в то время как один конец цепи (например, С-конец) закреплен на нерастворимом носителе. Как только на носителе (подложке) собрана нужная последовательность, пептид после этого деблокируют (то есть отщепляют) с носителя. Двумя стандартными защитными группами для α-аминогрупп соединяемых аминокислот являются Вос, которую удаляют сильной кислотой, и Fmoc, которую удаляют основанием. Настоящее изобретение относится к удобному способу производства пептидов с использованием комбинации обеих этих защит для α-аминогрупп в одном синтезе на недорогой смоле из хлорметилированного полистирола.

При разработке синтеза пептидов твердофазным способом с использованием любой из указанных выше схем защиты α-аминогрупп важно, чтобы любые реакционно-способные «боковые группы» составляющих пептид аминокислот были в ходе сборки цепи защищены от нежелательных химических реакций. Желательно также, чтобы выбранные для защиты различных боковых групп химические группы не удалялись реагентами, используемыми для снятия защиты с α-аминогрупп. В-третьих, важно, чтобы связь растущей пептидной цепи с частицей смолы была устойчива к действию реагентов, используемых в процессе сборки цепи для удаления любых типов защиты α-аминогрупп. В случае схемы защиты α-аминогрупп с использованием Fmoc, защита боковых групп должна быть устойчива в действию щелочных реагентов, используемых для удаления Fmoc. На практике эти защитные группы для боковых цепей обычно удаляют слабо кислотными реагентами после завершения сборки пептидной цепи. Если используется схема защиты α-аминогрупп с использованием Вос, защита боковых групп должна быть устойчива в действию слабо кислотного реагента, используемого для снятия группы Вос в каждом цикле. На практике эти защитные группы для боковых цепей в схеме защиты α-аминогрупп с помощью Вос обычно удаляют безводным HF после завершения сборки пептидной цепи. Таким образом, на практике повсеместно используемые для защиты боковых цепей группы в схеме с защитой α-аминогрупп с помощью Fmoc нестабильны в условиях, используемых для снятия с α-аминогрупп защитных групп Вос. Поэтому два типа схем защиты α-аминогрупп при сборке пептидной цепи в твердофазном синтезе пептидов не объединяют. Кроме того, хотя применяемую в пептидном синтезе наиболее дешевую полимерную смолу (хлорметилированный полистирол или «смола Мерифилда») широко используют вместе с аминокислотами, защищенными группами Вос, в литературе сделан вывод, что она неприменима в случае защиты α-аминогрупп группами Fmoc из-за ее нестабильности в щелочных условиях (см. Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2^nd ed., 1984). Настоящее изобретение нацелено на способ совместного использования в ходе твердофазного синтеза некоторых пептидов и Вос-защищенных, и Fmoc-защищенных аминокислот на смоле Мерифилда.

Известно, что Lanreotide®, который является аналогом соматостатина, ингибирует высвобождение гормона роста, а также ингибирует секрецию инсулина, глюкагона и экзокринную панкреатическую секрецию.

Патент США №4853371 раскрывает и заявляет Lanreotide®, способ его получения и способ ингибирования секреции гормона роста, инсулина, глюкагона и экзокринной панкреатической секреции.

Патент США №5147856 раскрывает применение Lanreotide® для лечения рестеноза.

Патент США №5411943 раскрывает применение Lanreotide® для лечения гепатомы.

Патент США №5073541 раскрывает применение Lanreotide® для лечения рака легких.

Заявка на патент США №08/089410, зарегистрированная 9 июля 1993 г., раскрывает применение Lanreotide® для лечения меланомы.

Патент США №5504069 раскрывает применение Lanreotide® для ингибирования ускоренного роста твердой опухоли.

Заявка на патент США №08/854941, зарегистрированная 13 мая 1997 г., раскрывает применение Lanreotide® для снижения веса тела.

Заявка на патент США №08/854943, зарегистрированная 13 мая 1997 г., раскрывает применение Lanreotide® для лечения устойчивости к инсулину и синдрома X.

Патент США №5688418 раскрывает применение Lanreotide® для продления жизнеспособности панкреатических клеток.

Заявка РСТ №PCT/US 97/14154 раскрывает применение Lanreotide® для лечения фиброза.

Заявка на патент США №08/855311, зарегистрированная 13 мая 1997 г, раскрывает применение Lanreotide® для лечения гиперлипидемии.

Заявка на патент США №08/440061, зарегистрированная 12 мая 1995 г., раскрывает применение Lanreotide® для лечения гиперамилинемии.

Заявка на патент США №08/852221, зарегистрированная 7 мая 1997 г., раскрывает применение Lanreotide® для лечения гиперпролактинемии и пролактином.

Содержание предшествующих патентов и патентных заявок включено сюда ссылкой.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предоставляет способ приготовления пептида, содержащего три или более аминокислотных остатков, имеющего N-концевую аминокислоту, предпоследнюю аминокислоту, прилегающую к N-концевой аминокислоте, и С-концевую аминокислоту, причем указанный способ включает следующие этапы:

(а) прикрепление первой аминокислоты к твердому носителю - смоле - эфирной связью с образованием продукта первого присоединения, что включает (i) проведение реакции водного раствора карбоната цезия со спиртовым раствором первой аминокислоты с образованием цезиевой соли первой аминокислоты, (ii) получение свободной от растворителя цезиевой соли первой аминокислоты, (iii) проведение реакции твердого носителя смолы с цезиевой солью первой аминокислоты в сухом (безводном) полярном апротонном растворителе с образованием продукта первого присоединения,

где первая аминокислота соответствует С-концевой аминокислоте пептида, аминогруппа небоковой (основной) цепи первой аминокислоты блокирована Воc, и первая аминокислота не имеет в боковой цепи функциональной группы, для которой требуется защита, и твердый носитель - смола - представляет собой смолу из хлорметилированного полистирола;

(б) снятие защиты (деблокирование) Воc с продукта первого присоединения кислотой с образованием деблокированного продукта первого присоединения;

(в) по усмотрению, присоединение к деблокированному продукту первого присоединения следующей аминокислоты, что включает проведение реакции следующей аминокислоты с деблокированным продуктом первого присоединения в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида, с получением блокированного (защищенного) продукта следующего присоединения, причем следующая аминокислота имеет в основной цепи аминогруппу, блокированную Воc, и если следующая аминокислота имеет одну или несколько функциональных групп в боковой цепи, тогда функциональные группы в боковой цепи не требуют защиты или функциональные группы в боковой цепи имеют защитные группы, которые устойчивы к кислотным или щелочным реагентам, используемым для снятия защиты соответственно Воc и Fmoc;

(г) снятие защиты Воc с блокированного продукта следующего присоединения, что включает проведение реакции блокированного продукта следующего присоединения с кислотой с получением деблокированного продукта следующего присоединения;

(д) по усмотрению, повторение этапов (в) и (г), причем в каждом цикле образуется деблокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения, где Х - номер необходимого повторения цикла;

(е) присоединение следующей аминокислоты к деблокированному продукту первого присоединения из этапа (б) или, по усмотрению, к деблокированному продукту (Х+1)-го следующего присоединения из этапа (д), что включает проведение реакции следующей аминокислоты с указанным продуктом первого присоединения или с указанным деблокированным продуктом (Х+1)-го следующего присоединения в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида с получением блокированного (защищенного) продукта следующего присоединения, причем следующая аминокислота имеет блокированную Fmoc аминогруппу основной цепи, при условии, что если следующая аминокислота имеет одну или несколько функциональных групп в боковой цепи, тогда функциональные группы в боковой цепи не требуют защиты или функциональные группы в боковой цепи имеют защитные группы, которые устойчивы к щелочным реагентам, используемым для снятия защиты Fmoc;

(ж) снятие защиты Fmoc с блокированного продукта следующего присоединения, что включает проведение реакции блокированного продукта следующего присоединения с первичным или вторичным амином, чтобы получить деблокированный продукт следующего присоединения;

(з) по усмотрению, повторение этапов (е) и (ж), причем в каждом цикле образуется деблокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения, где Х - номер необходимого повторения цикла, пока не будет включена в пептид и деблокирована предпоследняя аминокислота;

(и) присоединение N-концевой аминокислоты к деблокированному продукту (Х+1)-го следующего присоединения, что включает проведение реакции N-концевой аминокислоты с деблокированным продуктом (Х+1)-го следующего присоединения в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида, с получением блокированного продукта завершенного присоединения, где N-концевая аминокислота имеет аминогруппу основной цепи, блокированную Вос или Fmoc;

(й) снятие защитных групп Воc или Fmoc с блокированного продукта завершенного присоединения, включающее проведение реакции блокированного продукта завершенного присоединения с кислотой в случае Вос или с основанием в случае Fmoc, с образованием завершенного пептидного продукта на смоле;

(к) если на завершенном пептидном продукте на смоле имеются функциональные группы боковых цепей, тогда, по усмотрению, снятие защиты функциональных групп боковых цепей завершенного пептидного продукта на смоле, что включает проведение реакции завершенного пептидного продукта на смоле с подходящими снимающими защиту реагентами с получением завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой; и

(л) отщепление пептида от твердого носителя смолы в составе завершенного пептидного продукта на смоле или завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой с получением пептида, что включает проведение реакции завершенного пептидного продукта на смоле или завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой с аммиаком, первичным амином или вторичным амином до практического завершения отщепления пептида от смолы;

при условии, что этапы (е) и (ж) в синтезе пептида должны быть осуществлены по меньшей мере один раз.

Предпочтительным является способ согласно настоящему изобретению, где аммиак, первичный амин или вторичный амин в этапе (л) находятся в растворителе, содержащем спирт и, по усмотрению, апротонный полярный растворитель,

Предпочтительным является способ согласно настоящему изобретению, где этап (л) дополнительно включает следующие этапы:

осаждение отщепленного пептида из растворителя;

отделение фильтрованием твердого носителя смолы и осажденного пептида и

экстрагирование пептида кислотным раствором для выделения пептида.

Предпочтительным является способ согласно настоящему изобретению, где первая аминокислота представляет собой Boc-L-Thr.

Предпочтительным является способ согласно настоящему изобретению, где первая аминокислота представляет собой цезиевую соль Boc-L-Thr, дающую в качестве продукта первого присоединения Boc-L-Thr-смолу, а деблокированным продуктом первого присоединения является H-L-Thr-смола.

Предпочтительным является способ согласно настоящему изобретению, где кислотой, используемой для удаления защитной группы Воc в этапе (й), является трифторуксусная кислота (ТФУ).

Предпочтительным способом, относящимся к непосредственно предшествующему способу, является способ, где органическим растворителем является метилен-хлорид, хлороформ или диметилформамид, а реагентом для наращивания пептида является диизопропил-карбодиимид, дициклогексил-карбодиимид или N-этил-N'-(3-диметил-аминопропил)карбодиимид.

Предпочтительным способом, относящимся к непосредственно предшествующему способу, является способ, включающий проведение этапов (е) и (ж) шесть раз после образования деблокированного продукта первого присоединения формулы H-L-Thr-смола, где последующие аминокислоты присоединяются в порядке: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) и Fmoc-L-Cys(Acm) с образованием продукта Н-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

Предпочтительным способом, относящимся к непосредственно предшествующему способу, является способ, включающий присоединение Boc-D-β-Nal к H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Tnr-смоле согласно этапу (в) с получением Boc-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Сys(Аст)-Thr-смолы.

Предпочтительный способ, относящийся к непосредственно предшествующему способу, включает одновременное снятие группы Воc, защищающей D-β-Nal, группы O-t-Bu, защищающей Тyr, и группы Воc, защищающей Lys в Boc-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Тhr-смоле согласно этапу (и), с получением завершенного пептидного продукта на смоле формулы H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

Предпочтительный способ, относящийся к непосредственно предшествующему способу, включает отщепление пептида H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr от твердой смолы путем проведения реакции H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смолы с аммиаком в растворителе, содержащем спирт и, по усмотрению, апротонный полярный растворитель, до практически полного отщепления с получением H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH₂.

Предпочтительным способом, относящимся к непосредственно предшествующему способу, является способ, где спиртом является метанол, а полярный апротонный растворитель - это диметилформамид.

Предпочтительный способ, относящийся к непосредственно предшествующему способу, включает одновременное удаление групп Асm, защищающих Сys, и циклизацию получающихся остатков Cys со снятой защитой в завершенном пептидном продукте формулы H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Сys(Асm)-Тhr-NH₂ путем проведения реакции H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH₂ с раствором йода в спирте до практически полных снятия защиты и циклизации с получением H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂.

Предпочтительным способом, относящимся к непосредственно предшествующему способу, является способ, где пептид представляет собой H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂.

Предпочтительным способом, относящимся к непосредственно предшествующему способу, является способ, где пептид является аналогом соматостатина.

Термины, использованные в описании настоящего изобретения, определяются следующим образом:

«первая аминокислота»: охватывает любую аминокислоту, у которой в основной цепи (не в боковой) аминогруппа защищена Воc, которая является коммерческим продуктом или может быть синтезирована согласно методам, известным специалисту с обычным опытом в данной области, например Boc-L-Тhr;

«продукт первого присоединения»: описывает продукт, который прикреплен к твердому - носителю - смоле, что является результатом присоединения первой аминокислоты к твердому носителю - смоле, например Boc-L-Thr-смола;

«деблокированный продукт первого присоединения»: описывает продукт, являющийся результатом удаления или снятия группы Воc с продукта первого присоединения - например, H-L-Тhr-смола, где «Н» представляет собой доступный водород аминогруппы основной цепи, появляющийся в результате этапа деблокирования;

«следующая аминокислота»: описывает любую аминокислоту, у которой в основной цепи аминогруппа защищена Воc или Fmoc, которая является коммерческим продуктом или может быть синтезирована согласно методам, известным специалисту с обычным опытом в данной области. Поскольку этап (в) и этап (е) могут входить в повторяющийся цикл, где этап осуществляется более одного раза, каждый раз при осуществлении этапа (в) или этапа (е) «следующая аминокислота» может быть независимо выбрана из группы известных или могущих быть синтезированными аминокислот, у которых в основной цепи аминогруппа защищена Воc или Fmoc;

«блокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения»: описывает продукт, присоединенный к твердому носителю смоле, который является результатом соединения следующей аминокислоты со «деблокированным продуктом следующего присоединения». Поскольку этапы (в) и (г) и этапы (е) и (ж) могут входить в повторяющийся цикл, где могут быть присоединены следующие аминокислоты, термин «блокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения» относится к продукту, получаемому в результате каждого из предшествующих циклов присоединения;

«деблокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения»: описывает продукт, являющийся результатом снятия группы Fmoc с «блокированного продукта (Х+1)-го следующего присоединения»;

«завершенный пептидный продукт на смоле»: описывает пептидный продукт, прикрепленный к твердому носителю смоле после того, как к пептидной цепи была присоединена N-концевая аминокислота, и после того, как снята или деблокирована защита с аминогруппы основной цепи N-концевой аминокислоты, но который еще имеет любые защитные группы на функциональных группах боковых цепей, не удаленные реакцией, осуществляющей снятие защитной группы с основной цепи N-концевой аминокислоты; и

«завершенный пептидный продукт на смоле со снятой защитой»: описывает пептидный продукт, прикрепленный к твердому носителю - смоле, где были удалены или сняты все защитные группы с функциональных групп боковых цепей аминокислот.

Примерами кислот, которые можно использовать для снятия защиты Воc, являются трифторуксусная кислота (ТФУ), метансульфоновая кислота и органические растворы, содержащие НСl.

Примерами первичных и вторичных аминов, которые могут быть использованы для снятия защиты Fmoc, являются 4-(аминометил)пиперидин, пиперидин, диэтиламин, DBU и трис(2-аминоэтил)амин.

Примерами ненуклеофильных оснований, которые можно использовать для нейтрализации солей ТФУ освобожденных аминогрупп (RNH₃ ⁺CF₃COO^-, эти соли должны быть превращены в «свободные» амины (NH₂) до или в ходе присоединения следующей аминокислоты, иначе присоединение не осуществится) являются диизопропилэтиламин (ДИЭА) и триэтиламин (ТЭА).

Примерами органических растворителей, которые могут быть использованы в реакциях присоединения аминокислот, являются метилен-хлорид, хлороформ, дихлорэтан, диметилформамид, диэтилацетамид, тетрагидрофуран, этилацетат, 1-метил-2-пирролидон, ацетонитрил или комбинация этих растворителей.

Примеры агентов для наращивания пептидов включают замещенные карбодиимиды, такие как: диизопропил-карбодиимид, дициклогексил-карбодиимид или N-этил-N'-(3-диметил-аминопропил)карбодиимид.

Карбоксильные группы и аминогруппы, которые участвуют в образовании пептидной амидной связи, называют соответственно карбоксильной группой или аминогруппой «небоковой (основной) цепи». С другой стороны, любые функциональные группы аминокислоты, которые не участвуют в образовании пептидной амидной связи, называют функциональными группами «боковой цепи».

Термин «устойчивая к действию оснований группа» относится к защитным группам, используемым для защиты функциональных групп аминокислот, которые (1) устойчивы к действию оснований, например не могут быть удалены основаниями, такими как 4-(аминоэтил)пиперидин, пиперидин или трис(2-аминоэтил)амин, которые являются основаниями, обычно используемыми для удаления защитной группы Fmoc, и (2) могут быть удалены кислотой, такой как трифторуксусная кислота, или другим способом, таким как каталитическая гидрогенизация.

Символы «Fmoc» и «Воc» использованы здесь и в прилагаемой формуле для обозначения соответственно 9-флуоренил-метоксикарбонила и трет-бутил-оксикарбонила.

Описанный выше способ может быть применен для приготовления пептидов, предпочтительно аналогов соматостатина, таких как октапептид Lanreotide®, который имеет следующую формулу: H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂. Если нужно синтезировать H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Тhr-NH₂, устойчивыми к действию оснований защитными группами, используемыми для защиты функциональных групп боковых цепей Cys, Lys и Тyr, могут быть соответственно ацетамидометил (Асm), Воc и трет-бутил. Асm предпочтителен для Cys.

Под аналогом соматостатина подразумевается пептид, который проявляет биологическую активность, подобную (то есть агонист) или противоположную (то есть антагонист) активности соматостатина.

В формуле H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂ каждый из обычных трехбуквенных символов аминокислот (например, Lys) относится к структурному остатку аминокислоты. Например, символ Lys в приведенной выше формуле представляет -NН-СН((СН₂)₄NН₂)-СО-. Символ D-β-Nal- представляет аминокислотный остаток D-2-нафтилаланилил. Скобки обозначают дисульфидную связь, соединяющую свободные тиолы двух остатков Cys в пептиде, это указывает на то, что аминокислоты пептида внутри скобок образуют цикл.

На основании приведенного здесь описания специалист в данной области сможет в наиболее полной степени использовать настоящее изобретение.

Если не определено иное, все использованные здесь технические и научные термины имеют то же самое значение, какое обычно понимают специалисты с обычным уровнем подготовки в области, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, все публикации, патентные заявки, патенты и другие приведенные здесь ссыпки включены сюда ссылкой на них.

Пептид может быть приготовлен в соответствии со способом настоящего изобретения согласно следующей процедуре.

Раствор 0,5 молярных эквивалентов карбоната цезия в воде медленно добавляют к раствору 1 молярного эквивалента Вос-АА¹ (Bachem California, Torrance, СА), где АА¹ соответствует С-концевой аминокислоте, растворенной в спирте, предпочтительно метаноле. Полученную смесь перемешивают в течение около 1 ч при комнатной температуре, затем весь спирт и всю воду удаляют при пониженном давлении, получая сухой порошок цезиевой соли Вос-АА¹. Смолу Мерифилда, 1,0 эквивалент (хлор-метилированный полистирол, 200-400 меш, включение ионов хлора 1,3 мэкв/г, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky или Polymer Laboratories, Church Stretton, England) промывают хлорированным растворителем, предпочтительно дихлорметаном (ДХМ), спиртом, предпочтительно метанолом, и полярным апротонным растворителем, предпочтительно диметилформамидом (ДМФ). Порошок цезиевой соли Вос-АА¹ растворяют в безводном (сухом) полярном апротонном растворителе, предпочтительно ДМФ, и раствор объединяют с предварительно промытой смолой. Кашицу аккуратно перемешивают при приблизительно 45°-65°С, предпочтительно при 50°-60°С, в течение приблизительно от 48 до 106 ч, предпочтительно от 85 до 90 ч, в инертной атмосфере - такой как азот. Смолу отделяют фильтрованием и тщательно промывают полярным апротонным растворителем, предпочтительно ДМФ, водой и окончательно спиртом - таким как МеОН. Вос-АА¹-смолу сушат при пониженном давлении.

Вос-АА¹-смолу вносят в стеклянный реактор с фильтрующим дном из крупнопористого сплавленного стекла. Смолу промывают хлорированным растворителем - таким как ДХМ, деблокируют органической кислотой, предпочтительно 25% ТФУ в ДХМ, кратковременно промывают хлорированным раствором - таким как ДХМ, и спиртом - таким как МеОН, нейтрализуют органическим основанием, предпочтительно триэтиламином в ДХМ, и снова промывают ДХМ и полярным апротонным растворителем - таким как ДМФ, получая AA¹-смолу со снятой защитой.

Затем к АА¹-смоле со снятой защитой по усмотрению присоединяют любое необходимое число аминокислот. Если следующая аминокислота имеет α-аминогруппу с защитой Fmoc (Fmoc-AA^x), тогда группе боковой цепи либо не требуется защита (это, например, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe или Fmoc-Thr), либо боковую цепь необходимо защитить группой, устойчивой к действию основания. Молярный избыток Fmoc-AA^x (где х - номер положения аминокислоты в пептиде, отсчитываемый от С-конца) присоединяют в течение приблизительно 60 мин к АА¹-смоле со снятой защитой с помощью реагента для наращивания пептида - такого как диизопропилкарбодиимид (ДИК), в смеси ДХМ/ДМФ. Смолу с присоединением промывают ДМФ, спиртом и ДХМ, получая Fmoc-АА^x-АА¹-смолу. Прикрепление можно проверить нингидриновым методом Кайзера. Затем Fmoc-AA^x-АА¹-смолу промывают один раз ДМФ и после этого деблокируют раствором основания в органическом растворителе, таком как пиперидин в ДМФ, получая АА^x-АА¹-смолу. Затем AA^x-АА¹-смолу промывают ДМФ, после чего несколько раз промывают и спиртом, таким как МеОН, и ДХМ. После этого AA^x-АА¹-смолу промывают один раз ДМФ в течение приблизительно 3 мин, три раза изопропанолом, предпочтительно каждый раз в течение приблизительно 2 мин, и три раза ДХМ, предпочтительно каждый раз в течение приблизительно 2 мин. После этого смола готова для дальнейшего присоединения либо аминокислоты, защищенной Fmoc, как описано выше, либо аминокислоты, защищенной Воc, как описано далее.

Подобным же образом, если любая подлежащая присоединению к АА¹-смоле со снятой защитой последующая аминокислота выбрана с защищенной Воc α-аминогруппой (Вос-АА^x), тогда либо для группы боковой цепи не требуется защита (это могут быть Boc-Gly, Boc-Ala, Boc-Phe или Boc-Thr), либо боковая цепь должна быть защищена группой, устойчивой к удалению и кислотой, и основанием, - это может быть Boc-Cys(Acm). Если выбрана Вос-АА^x, ее присоединяют с помощью таких же реагентов и растворителей, как в описанном выше случае для Fmoc-аминокислот, и полноту (завершение) присоединения можно проверить нингидриновым методом Кайзера. После этого с Вос-АА^x-АА¹-смолы снимают защиту раствором кислоты в органическом растворителе - таким как ТФУ в ДХМ, получая CF₃CO^- H⁺-AA^x-АА¹-смолу. Затем эту смолу несколько раз промывают хлорированными растворителями, такими как ДХМ, спиртом, таким как МеОН, и нейтрализуют ненуклеофильным основанием, таким как триэтиламин в ДХМ, после чего промывают еще несколько раз хлорированным растворителем, таким как ДХМ, получая АА^x-АА¹-смолу. После этого смола готова для дальнейшего присоединения защищенной Воc или Fmoc аминокислоты, как описано выше.

В зависимости от требуемой последовательности пептида и типа использованной аминокислоты с защищенной α-аминогруппой (либо с защитой Fmoc, либо с защитой Воc) используют подходящую комбинацию описанных выше процедур присоединения, в зависимости от того, какая аминокислота должна занять место в пептидной последовательности - с боковой цепью, имеющей защитную группу, которую можно удалить либо основанием, необходимым для снятия Fmoc с α-аминогруппы, либо кислотой, необходимой для снятия Воc с α-аминогруппы. Такой защищенной аминокислотой может быть N-α-Boc-N'-ε-Fmoc-лизин или N-α-Fmoc-N'-ε-Вос-лизин. Если это имеет место, все выбираемые защитные группы для α-аминогрупп последующих аминокислот, вплоть до N-концевой аминокислоты, должны быть совместимыми с выбранной для этого положения защитой боковой группы. Это означает, что защитные группы боковых цепей должны быть устойчивы к деблокирующему агенту, используемому для снятия защиты с α-аминогрупп последующих аминокислот. Для N-концевой аминокислоты в качестве защиты α-аминогруппы можно использовать либо Воc, либо Fmoc, так как снятие защиты с N-концевой аминокислоты может одновременно снять защиту с некоторых из защищенных боковых цепей без нежелательного воздействия на стратегию синтеза пептида, поскольку никакие аминокислоты больше не добавляются.

С завершенной пептидной цепи, которая еще прикреплена к смоле, должна быть снята защита и она должна быть деблокирована. Чтобы удалить все устойчивые к действию оснований защитные группы и группу, блокирующую α-аминогруппу N-концевой аминокислоты, если они применимы, пептид на смоле обрабатывают кислотой в органическом растворителе - такой как ТФУ в ДХМ. Чтобы удалить все устойчивые к действию кислоты защитные группы и группу, блокирующую α-аминогруппу N-концевой аминокислоты, если они применимы, пептид на смоле обрабатывают органическим основанием - таким как пиперидин в ДМФ. Или же устойчивые к кислоте группы можно оставить впредь до удаления при последующем отщеплении пептида аммиаком или аминным основанием. Затем пептид на смоле со снятой защитой промывают хлорированным растворителем - таким как ДХМ, спиртом - таким как МеОН, и сушат до постоянного веса при пониженном давлении.

Пептид отщепляют от смолы и С-конец переводят в амид, суспендируя пептид на смоле в смеси 3:1 МеОН/ДМФ. Суспензию охлаждают до температуры приблизительно ниже 10°С в атмосфере азота и под поверхность растворителя вводят безводный газообразный аммиак до насыщения им раствора, при этом температуру поддерживают ниже приблизительно 10°С. Кашицу аккуратно перемешивают в течение приблизительно 24 ч, позволяя при этом температуре повыситься до приблизительно 20°С. Степень завершения реакции проверяют по исчезновению метил-эфирного промежуточного соединения в ВЭЖХ при подходящих условиях, зависящих от типа пептида. Реакционную смесь охлаждают и добавляют необходимое количество безводного аммиака, пока при ВЭЖХ площадь пика, соответствующего метиловому эфиру, не станет меньше 10% площади пика целевого продукта. Кашицу охлаждают до температуры ниже приблизительно 10°С и продолжают перемешивание в течение ночи для осаждения пептида. Осадок и смолу отделяют фильтрованием и промывают холодным МеОН. Осадок и смолу сушат при пониженном давлении, продукт экстрагируют из смолы водным раствором уксусной кислоты.

Если пептид в своей последовательности содержит защищенные остатки Сys, защиту с тиольных групп можно снять и циклизовать остатки согласно следующей процедуре. Содержащий защищенные Асm группы Cys пептид растворяют в водном растворе уксусной кислоты в атмосфере азота. Раствор быстро перемешивают и добавляют в одной порции раствор йода в спирте. Смесь перемешивают и проверяют с помощью ВЭЖХ полноту снятия защиты. Затем реакцию останавливают титрованием 2% раствором тиосульфата натрия до исчезновения окраски раствора. Неочищенную смесь подвергают очистке с помощью препаративной хроматографии на патроне С8 с градиентом ацетонитрила в 0,1 буфере ацетата аммония, обессоливают на патроне С8 с градиентом ацетонитрила в 0,25 н уксусной кислоте и лиофилизуют, получая целевой пептид.

Пример осуществления изобретения

Следующий пример приведен для того, чтобы проиллюстрировать способ согласно настоящему изобретению, и он не должен рассматриваться как ограничение его охвата.

Пример 1. H₂-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂

А) Boc-L-Thr-смола

Раствор 2,58 г карбоната цезия в 2,5 мл воды медленно добавляли к раствору 3,48 г Boc-L-треонина (Bachem California, Torrance, СА), растворенного в 7 мл метанола. Полученную смесь перемешивали в течение приблизительно 1 ч при комнатной температуре, затем удаляли весь метанол и всю воду при пониженном давлении, получая сухой порошок цезиевой соли Boc-L-треонина. 10 г смолы Мерифилда (хлорметилированный полистирол, 200-400 меш, включение хлора 1,3 мэкв/г, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) промыли дихлорметаном (ДХМ), метанолом (МеОН) и диметилформамидом (ДМФ) (каждым 2 раза по 70 мл). Порошок цезиевой соли Boc-L-треонина растворили в 60 мл сухого ДМФ и объединили раствор с промытой, как указано выше, смолой. Кашицу аккуратно перемешивали при температуре приблизительно 50°-60°С в течение приблизительно от 85 до 90 ч в атмосфере азота. Смолу отделили фильтрованием и тщательно промыли ДМФ, деионизованной водой и напоследок МеОН. Смолу с Вос-треонином сушили при пониженном давлении при приблизительно 40°С. Включение треонина составило 0,85±0,15 мэкв/г сухой смолы.

Б) H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола

2,0 г смолы с Вос-треонином из этапа (А) внесли в стеклянный реактор объемом 50 мл с дном-фильтром из крупнопористого сплавленного стекла (загрузка 1,74 ммоль). Смолу промыли 2 раза ДХМ (20 мл), каждый раз в течение приблизительно 5 мин, деблокировали 25% ТФУ в ДХМ (30 мл) - первый раз в течение приблизительно 2 мин и второй раз в течение приблизительно 25 мин, промыли 3 раза в течение приблизительно 2 мин ДХМ (20 мл), изопропанолом (20 мл) и ДХМ (20 мл), нейтрализовали дважды в течение около 5 мин 10% раствором триэтиламина в ДХМ (20 мл), промыли 3 раза в течение приблизительно 2 мин ДХМ и промыли один раз ДМФ (20 мл) в течение приблизительно 5 мин.

К деблокированной смоле добавили 1,8 г (4,35 ммоль, 2,5 экв.) Fmoc-L-цистеина(Асm) (Bachem, СА) и 683 мкл (4,35 ммоль, 2,5 экв.) диизопропил-карбодиимида (ДИК) в 14 мл смеси 2:1 ДХМ/ДМФ приблизительно на 1 ч. После присоединения смолу промыли 1 раз в течение около 3 мин ДМФ (20 мл), 3 раза в течение около 2 мин изопропанолом и 3 раза в течение около 2 мин ДХМ (20 мл). Связывание проверили нигидриновым методом Кайзера.

После присоединения смолу промыли 1 раз ДМФ и затем деблокировали раствором пиперидина в ДМФ. Затем деблокированную смолу с присоединением промыли ДМФ и несколько раз одновременно МеОН и ДХМ. Смолу с присоединением промыли 1 раз в течение около 3 мин ДМФ (20 мл), 3 раза в течение около 2 мин изопропанолом (20 мл) и 3 раза ДХМ (20 мл) в течение около 2 мин каждый раз. Связывание проверили нингидриновым методом Кайзера.

Каждую из следующих защищенных аминокислот присоединяли к промытой смоле, используя ДИК в смеси ДМФ/ДХМ, и деблокировали, как описано выше, в следующей последовательности: Fmoc-L-валин, Fmос-L-лизин(Вос), Fmoc-D-триптофан, Fmoc-L-тирозин(О-t-Bu) и Fmос-L-цистеин(Асm) (все от фирмы Bachem California), Boc-D-2-нафтилаланин (Synthethech, Albany, OR).

С завершенной пептидной цепи снимали блокировку и защиту дважды смесью 75:20:5 ДХМ/ТФУ/анизол (30 мл) в течение около 2 мин и около 25 мин, промыли 3 раза в течение около 2 мин каждый раз ДХМ (20 мл), изопропанолом (10 мл) и ДХМ (20 мл), нейтрализовали 2 раза в течение около 5 мин 10% раствором триэтиламина в ДХМ (20 мл) и промыли 3 раза в течение около 2 мин ДХМ (20 мл) и МеОН (20 мл). Смолу сушили при пониженном давлении. Сухой вес был равен 3,91 г (103% от теоретического выхода).

B) H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH₂

2,93 г нагруженной пептидом смолы из этапа (Б) (1,3 ммоль-экв.) суспендировали в 50 мл смеси 3:1 МеОН/ДМФ. Суспензию охладили до температуры приблизительно ниже 10°С в атмосфере азота и продували сухой газообразный аммиак до насыщения им раствора, при этом температуру поддерживали ниже приблизительно 10°С. Кашицу аккуратно перемешивали в течение приблизительно 24 ч, позволяя температуре повыситься до приблизительно 20°С. Степень завершения реакции проверяли по исчезновению метил-эфирного промежуточного соединения с помощью ВЭЖХ (сорбент VYDAC®, размер зерен 5 мкм, размер пор 100 Å, С18, элюирование в изократических условиях 26% CH₃CN в 0,1% ТФУ, скорость 1 мл/мин, регистрация при 220 мм; в этих условиях время ретардации Rt ~ 14 мин для метилового эфира и ~ 9,3 мин для амидного продукта). Реакционную смесь охлаждали и добавляли избыток безводного аммиака, пока при ВЭЖХ площадь пика, соответствующего метиловому эфиру, не стала меньше 10% площади пика целевого продукта. Кашицу охладили до температуры приблизительно ниже 10°С, перемешивание продолжали в течение ночи для осаждения пептида. Осадок и смолу отделили фильтрованием и промыли 15 мл холодного МеОН. Осадок и смолу высушили при пониженном давлении, продукт экстрагировали из смолы 50% водным раствором уксусной кислоты (3 порции по 30 мл). Анализ методом ВЭЖХ показал наличие в смеси 870 мг (0,70 ммоль) титульного продукта (96% чистота в изократической системе ВЭЖХ).

Г) H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂

500 мг (0,40 ммоль) пептида из этапа (В) растворили в 300 мл 4% уксусной кислоты и нагрели до приблизительно 55°С в атмосфере азота. Раствор быстро перемешали и добавили одной порцией 2% раствор (вес к объему) йода в 7,7 мл МеОН (0,60 ммоль). Смесь перемешивали в течение приблизительно 15 мин, затем реакцию остановили титрованием 2% раствором тиосульфата натрия до исчезновения окраски (~ 2 мл). Смесь охладили до комнатной температуры и профильтровали. Смесь подвергли очистке с помощью препаративной хроматографии на колонке С8 (YMC, Inc., Wilmington, NC) с градиентом ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония, обессолили на колонке С8 YMC с градиентом ацетонитрила в 0,25 н уксусной кислоте и лиофилизовали, получив 350 мг целевого пептида с чистотой 99%.

На основании приведенного выше описания специалист данной области может легко выяснить существенные характеристики настоящего изобретения и без выхода за пределы его идеи и области охвата сделать различные изменения и модификации изобретения для приспособления его к различным применениям и условиям. Таким образом, другие варианты осуществления изобретения также охватываются формулой изобретения.

Изобретение относится к твердофазному способу синтеза пептида формулы H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂, в котором используются и Вос-защищенные, и Fmoc-защищенные аминокислоты и смола из хлорметилированного полистирола. 10 з.п. ф-лы.

1. Способ приготовления пептида формулы H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂, причем указанный способ включает следующие этапы:
(а) прикрепление первой аминокислоты к твердому носителю смоле эфирной связью с образованием «продукта первого присоединения», что включает (i) проведение реакции водного раствора карбоната цезия со спиртовым раствором первой аминокислоты с образованием цезиевой соли первой аминокислоты, (ii) получение свободной от растворителя цезиевой соли первой аминокислоты, (iii) проведение реакции твердого носителя смолы с цезиевой солью первой аминокислоты в безводном полярном апротонном растворителе с образованием «продукта первого присоединения»,
где первая аминокислота представляет собой Boc-L-Thr, что соответствует С-концевой аминокислоте этого пептида, а твердый носитель смола представляет собой смолу из хлорметилированного полистирола;
(б) снятие защиты Вос с продукта первого присоединения кислотой с образованием «деблокированного продукта первого присоединения»;
(в) по усмотрению, присоединение к «деблокированному продукту первого присоединения» «следующей аминокислоты», что включает проведение реакции «следующей аминокислоты» с «деблокированным продуктом первого присоединения» в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида, с получением «блокированного продукта следующего присоединения», причем «следующая аминокислота» имеет в основной цепи аминогруппу, блокированную Вос, и если эта «следующая аминокислота» имеет одну или несколько функциональных групп в боковой цепи, тогда функциональные группы в боковой цепи не требуют защиты или эти функциональные группы в боковой цепи имеют защитные группы, которые стабильны к кислотным или щелочным реагентам, используемым для снятия защиты соответственно Вос и Fmoc;
(г) снятие защиты Вос с «блокированного продукта следующего присоединения», что включает проведение реакции этого «блокированного продукта следующего присоединения» с кислотой с получением «деблокированного продукта следующего присоединения»;
(д) по усмотрению, повторение этапов (в) и (г), причем в каждом цикле образуется «деблокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения», где Х обозначает число желаемых повторений циклов;
(е) присоединение «следующей аминокислоты» к «деблокированному продукту первого присоединения» из этапа (б) или, по усмотрению, к «деблокированному продукту (Х+1)-го следующего присоединения» из этапа (д), что включает проведение реакции «следующей аминокислоты» с указанным «деблокированным продуктом первого присоединения» или с указанным «деблокированным продуктом (Х+1)-го следующего присоединения» в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида с получением «блокированного продукта следующего присоединения», причем эта «следующая аминокислота» имеет блокированную Fmoc аминогруппу основной цепи, при условии, что если эта «следующая аминокислота» имеет одну или несколько функциональных групп в боковой цепи, тогда функциональные группы в боковой цепи не требуют защиты или функциональные группы в боковой цепи имеют защитные группы, которые устойчивы к щелочным реагентам, используемым для снятия защиты Fmoc;
(ж) снятие защиты Fmoc с «блокированного продукта следующего присоединения», что включает проведение реакции «блокированного продукта следующего присоединения» с первичным или вторичным амином, чтобы получить «деблокированный продукт следующего присоединения»;
(з) по усмотрению, повторение этапов (е) и (ж), причем в каждом цикле образуется «деблокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения», где Х - желаемое число повторений цикла, пока не будут включена в пептид и деблокирована предпоследняя аминокислота;
(и) присоединение N-концевой аминокислоты к «деблокированному продукту (Х+1)-го следующего присоединения», что включает проведение реакции N-концевой аминокислоты с «деблокированным продуктом (Х+1)-го следующего присоединения» в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида, с получением «блокированного продукта завершенного присоединения», где «N-концевая аминокислота» имеет аминогруппу основной цепи, блокированную Вос или Fmoc;
(й) снятие защитных групп Вос или Fmoc с «блокированного продукта завершенного присоединения», включающее проведение реакции «блокированного продукта завершенного присоединения» с кислотой в случае Вос или с основанием в случае Fmoc, с образованием завершенного пептидного продукта на смоле;
(к) если на «завершенном пептидном продукте на смоле» имеются функциональные группы боковых цепей, тогда, по усмотрению, снятие защиты функциональных групп боковых цепей «завершенного пептидного продукта на смоле», что включает проведение реакции «завершенного пептидного продукта на смоле» с подходящими снимающими защиту реагентами с получением «завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой»; и
(л) отщепление пептида от твердого носителя смолы в составе «завершенного пептидного продукта на смоле» или «завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой» с получением пептида, что включает проведение реакции «завершенного пептидного продукта на смоле» или «завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой» с аммиаком, первичным амином или вторичным амином до практического завершения отщепления пептида от смолы;
при условии, что этапы (е) и (ж) в синтезе пептида осуществляют шесть раз после образования «деблокированного продукта первого присоединения» формулы H-L-Thr-смола, где последующие аминокислоты присоединяются в порядке: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) и Fmoc-L-Cys(Acm) с образованием продукта H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

2. Способ согласно п.1, где аммиак, первичный амин или вторичный амин в этапе (л) находятся в растворителе, содержащем спирт и, по усмотрению, апротонный полярный растворитель.

3. Способ согласно п.1, где этап (л) дополнительно включает следующие стадии:
(i) осаждение отщепленного пептида из растворителя;
(ii) отделение фильтрованием твердого носителя смолы и осажденного пептида и
(iii) экстрагирование пептида кислотным раствором для выделения пептида.

4. Способ согласно любому из пп.1-3, где первая аминокислота представляет собой цезиевую соль Boc-L-Thr, дающую в качестве продукта первого присоединения Boc-L-Thr-смолу, а «деблокированным продуктом первого присоединения» является H-L-Thr-смола.

5. Способ согласно п.4, где кислотой, используемой для удаления защитной группы Вос в этапе (й), является трифторуксусная кислота (ТФУ).

6. Способ согласно п.5, где органическим растворителем является метилен-хлорид, хлороформ или диметилформамид, а реагентом для наращивания пептида является диизопропил-карбодиимид, дициклогексил-карбодиимид или N-этил-N'-(3-диметил-аминопропил)карбодиимид.

7. Способ согласно п.6, включающий присоединение Boc-D-β-Nal к H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смоле согласно этапу (и) с получением Boc-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смолы.

8. Способ согласно п.7, включающий одновременное снятие группы Вос, блокирующей D-β-Nal, группы O-t-Bu, защищающей Тyr, и группы Воc, защищающей Lys в Boc-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смоле, согласно этапу (й) с получением завершенного пептидного продукта на смоле формулы H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.

9. Способ согласно п.8, включающий отщепление пептида H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr от твердой смолы путем проведения реакции H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смолы с аммиаком в растворителе, содержащем спирт и, по усмотрению, апротонный полярный растворитель, до в основном полного отщепления с получением H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH₂.

10. Способ согласно п.9, где спиртом является метанол, а полярный апротонный растворитель - это диметилформамид.

11. Способ согласно п.10, включающий одновременное удаление групп Асm, защищающих Cys, и циклизацию получающихся остатков Cys со снятой защитой в «завершенном пептидном продукте на смоле» формулы H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH₂ путем проведения реакции H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH₂ с раствором йода в спирте до в основном полных снятия защиты и циклизации с получением H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂.