ДЕТЕКЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ СПОСОБОМ, ОСНОВАННЫМ НА СВЯЗЫВАНИИ МИШЕНЕСПЕЦИФИЧНОГО ГИБРИДА Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/68 C12P19/34 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в диагностических тест-системах различного назначения. Предложен способ детекции нуклеиновых кислот (НК)-мишеней, предусматривающий а) обогащение образца НК последовательностями-мишенями за счет образования ДНК-РНК гибрида между НК-мишенью и комплементарным, по меньшей мере, ее участку зондом, связывания полученных гибридов с твердым носителем и удаления негибридизованных и/или не связавшихся с подложкой НК; б) амплификацию обогащенных НК-мишенями образцов и с) детекцию НК-мишеней в полученном множестве с помощью олигонуклеотида, комплементарного первому участку НК-мишени, и зонда, комплементарного второму участку НК-мишени, где последовательность олигонуклеотида и последовательность зонда образуют с НК-мишенью ДНК-РНК гибрид, который и определяется любым из множества известных методов. Новый способ является высокочувствительным и высокоспецифичным и обеспечивает возможность различать высокогомологичные последовательности НК. 3 н. и 19 з.п. ф-лы, 19 табл.

1. Способ детекции, по крайней мере, одной нуклеиновой кислоты-мишени, включающий:
a) формирование множества обогащенных нуклеиновых кислот-мишеней, включающее:
i) смешивание, по крайней мере, одной нуклеиновой кислоты-мишени с нуклеиновой кислотой-зондом, комплементарным, по крайней мере, к участку, по крайней мере, одной нуклеиновой кислоты-мишени, для формирования ДНК-РНК гибрида-мишени, причем если нуклеиновая кислота-мишень является РНК, зонд является ДНК, и причем если нуклеиновая кислота-мишень является ДНК, зонд является РНК;
ii) связывание ДНК-РНК гибрида-мишени на твердом носителе; и
iii) удаление любой нуклеиновой кислоты, которая не образует ДНК-РНК гибрид-мишень, или которая не связана на твердом носителе, для формирования множества обогащенных нуклеиновых кислот-мишеней;
b) амплифицирование множества обогащенных нуклеиновых кислот-мишеней из стадии а) для формирования множества амплифицированных мишеней; и
c) детекцию, по крайней мере, одной нуклеиновой кислоты-мишени во множестве амплифицированных мишеней при
i) смешивании множества амплифицированных мишеней с выбираемым олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-зондом, причем выбираемый олигонуклеотид гибридизуется с первым участком амплифицированных мишеней, а нуклеиновая кислота-зонд является комплементарным ко второму участку амплифицированных мишеней, причем если амплифицированная мишень является ДНК, то выбираемый олигонуклеотид и нуклеиновая кислота-зонд являются РНК, и если амплифицированная мишень является РНК, то выбираемый олигонуклеотид и нуклеиновая кислота-зонд являются ДНК, для формирования комплекса ДНК-РНК гибрид-мишень /олигонуклеотид/ зонд; и
ii) детекции комплекса ДНК-РНК гибрид-мишень /олигонуклеотид/ зонд посредством ДНК-РНК гибрид-специфического связывающего агента, для детекции, по крайней мере, одной нуклеиновой кислоты-мишени.

2. Способ по п.1, в котором на стадии связывания (а) твердый носитель конъюгирован с ДНК-РНК гибрид-специфическим связывающим агентом, тем самым связывая, по крайней мере, одну нуклеиновую кислоту-мишень на твердом носителе.

3. Способ по п.1, в котором ДНК-РНК гибрид-специфический связывающий агент выбран из группы, состоящей из ДНК-РНК гибрид-специфического антитела, моноклонального или поликлонального антитела или их фрагментов, белка, каталитически неактивной рибонуклеазы Н, нуклеиновой кислоты, аптамера нуклеиновой кислоты и олигонуклеотида, и причем ДНК-РНК гибрид-специфический связывающий агент связывается с ДНК-РНК гибридом с образованием триплексной структуры.

4. Способ по п.2, в котором ДНК-РНК гибрид-специфический связывающий агент является ДНК-РНК гибрид-специфическим антителом.

5. Способ по п.2, в котором ДНК-РНК гибрид-специфический связывающий агент является нуклеиновой кислотой-зондом, комплементарным к нуклеиновой кислоте-мишени.

6. Способ по п.3, в котором ДНК-РНК гибрид-специфический связывающий агент мечен детектируемой меткой.

7. Способ по п.6, в котором метка обнаруживается методами колориметрии, хемилюминесценции, флуоресценции или светорассеивания.

8. Способ по п.1, в котором амплифицирование производится изотермической амплификацией.

9. Способ по п.8, в котором ДНК-полимераза используется в изотермической амплификации.

10. Способ по п.8, в котором случайные праймеры используются в изотермической амплификации.

11. Способ по п.10, в котором случайные праймеры являются пентамерами.

12. Способ по п.10, в котором случайные праймеры содержат субпопуляцию последовательностей праймеров, специфических для заболевания.

13. Способ по п.1, в котором выбираемые олигонуклеотиды связаны с твердым носителем.

14. Способ по п.1, в котором твердый носитель выбран из группы, состоящей из планшета, микропланшета, микротитровального планшета, предметного стекла, чашки, микрошарика, частицы, микрочастицы, стакана, нити, чипа, микрочипа, полоски, мембраны, микроматрицы и пробирки.

15. Способ по п.14, в котором твердый носитель изготовлен из материала, выбранного из группы, состоящей из стекла, силикона, пластика, полистирола, полиэтилена, полипропилена и поликарбоната.

16. Способ по п.14, в котором твердый носитель модифицирован для содержания карбоксильной, амино, гидразидной, альдегидной группы, нуклеиновой кислоты или нуклеотидных производных, первичной аминогруппы или красителя.

17. Способ по п.1, дополнительно включающий добавление зонда-блокатора.

18. Способ детекции каждой из, по крайней мере, одной нуклеиновой кислоты-мишени, включающий:
a) гибридизацию, по крайней мере, одной нуклеиновой кислоты-мишени с нуклеиновой кислотой-зондом, комплементарным, по крайней мере, к участку нуклеиновой кислоты-мишени, для формирования ДНК-РНК гибрида-мишени, причем если нуклеиновая кислота-мишень является РНК, зонд является ДНК, и причем если нуклеиновая кислота-мишень является ДНК, зонд является РНК;
b) связывание ДНК-РНК гибрида-мишени ДНК-РНК гибрид-специфическим антителом, конъюгированным с твердым носителем;
c) отделение несвязанной нуклеиновой кислоты-мишени от захваченного ДНК-РНК гибрида-мишени;
d) амплифицирование связанного ДНК-РНК гибрида-мишени для формирования множества амплифицированных мишеней, причем в амплифицировании используют случайные праймеры и ДНК-полимеразу;
e) гибридизацию нуклеиновой кислоты-зонда, комплементарного к первому участку амплифицированных мишеней, для формирования амплифицированного гибрида ДНК-РНК;
f) гибридизацию олигонуклеотида, конъюгированного с твердым носителем, со вторым участком амплифицированного гибрида ДНК-РНК, причем твердый носитель является выбираемым;
g) выбор амплифицированного гибрида ДНК-РНК при помощи выбираемого твердого носителя; и
h) детекцию, по крайней мере, одной амплифицированной нуклеиновой кислоты-мишени путем связывания ДНК-РНК гибрид-специфического связывающего агента с амплифицированным гибридом ДНК-РНК, причем присутствие амплифицированного гибрида ДНК-РНК указывает на присутствие нуклеиновой кислоты-мишени.

19. Способ по п.18, в котором твердый носитель, конъюгированный с олигонуклеотидами, является отличимым микрошариком.

20. Способ по п.19, в котором отличимый микрошарик имеет детектируемую метку, выбранную из группы, состоящей из флуоресцентной метки, метки золотом и ферментативной метки.

21. Мультиплексный способ детекции, по крайней мере, одной ДНК-мишени, включающий:
a) гибридизацию, по крайней мере, одной ДНК-мишени, по крайней мере, с одним первым РНК-зондом, который является комплементарным, по крайней мере, к участку, по крайней мере, одной ДНК-мишеии, для формирования, по крайней мере, одного ДНК-РНК гибрида;
b) связывание, по крайней мере, одного ДНК-РНК гибрида, по крайней мере, одним ДНК-РНК гибрид-специфическим антителом, конъюгированным с микрошариком;
c) отделение несвязанной нуклеиновой кислоты от, по крайней мере, одного ДНК-РНК гибрида для формирования, по крайней мере, одной обогащенной мишени;
d) амплифицирование, по крайней мере, одной обогащенной ДНК-мишени для формирования, по крайней мере, одной амплифицированной ДНК-мишени с использованием случайных праймеров и ДНК-полимеразы;
e) гибридизацию второго РНК-зонда, комплементарного к первому участку амплифицированной ДНК-мишени, для формирования амплифицированного ДНК-РНК гибрида;
f) гибридизацию ДНК-олигонуклеотида со вторым участком амплифицированной(ых) ДНК-мишени(ей), причем ДНК-олигонуклеотид конъюгирован, по крайней мере, с одним выбираемым микрошариком; и
g) детекцию, по крайней мере, одной амплифицированной ДНК-мишени посредством связывания ДНК-РНК гибрид-специфического антитела с амплифицированным ДНК-РНК гибридом и выбор амплифицированной мишени на основе конкретного выбираемого микрошарика.

22. Способ по п.1, в котором нуклеиновой кислотой-мишенью является нуклеиновая кислота HPV, причем нуклеиновые кислоты-зонды, комплементарные, по крайней мере, к участку нуклеиновой кислоты-мишени, включают последовательность, выбранную из SEQ ID NO:36-56, а последовательности олигонуклеотидов включают последовательность, выбранную из SEQ ID NO:66-124.