СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ ОРГАНОВ Российский патент 2012 года по МПК A61K38/04 A61K9/08 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к раствору для консервации (сохранения), перфузии и/или реперфузии органов, особенно сердца, для трансплантации. Раствор содержит пептидный ингибитор (-ы) протеинкиназы С ε (РКС ε).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Успешное трансплантирование органов часто ограничено вследствие ишемических/реперфузионных повреждений. Изолированные человеческие сердца, лишенные кислорода более чем на четверть часа, постепенно теряют энергию и часто не выживают в реципиентах-хозяевах. Другие органы, такие как почки, печень, поджелудочная железа или легкие, также на тканевом и клеточном уровнях подвергаются повреждающим воздействиям при извлечении их из их хозяев для трансплантации. Такое повреждение является следствием гипоксии и утраты кровообращения, которое обычно обеспечивает снабжение физиологическими количествами кислорода и питательных веществ и удаляет токсичные компоненты, продуцируемые клетками органов. Трансплантаты органов более успешно приживаются, если пересадка происходит сразу же после извлечения органов из их хозяев.

Достижения последних лет повысили степень успешности пересадки органов, технологии органных трансплантатов и хирургии, например коронарное хирургическое шунтирование. Первое включает консервацию органов и растворы для перфузии органов. Второе касается усовершенствованных способов и средств для снабжения органа растворами для перфузии.

В последнее время кратковременное презервирование миокарда обеспечивалось за счет хранения в холоде после кардиоплегической остановки сердца. Существует много таких способов, различающихся составами используемых растворов, температурой презервирования и протокольными инструкциями. В кардиохирургии разработано большое количество различных растворов, применяемых в процессах остановки (торможения) сердца и его сохранения с тем, чтобы защитить миокард.

Примеры таких растворов включают: Krebs-Henseleit раствор, UW раствор, St.Thomas II раствор, Collins раствор и Stanford раствор (см., например, US патент 4798824 и 4938961; Southard and Belzer, Ann. Rev. Med. 46:235-247 (1995); Donelly and Djuric, Am. J.Hosp. Pharm. 48:2444-2460 (1991)). К сожалению, еще сохраняется отторжение органов вследствие ухудшения состояния трансплантируемого органа в период времени между моментом извлечения и моментом восстановления кровообращения в организме реципиента.

Восстановление кровотока есть первичная цель при работе с тканью органа, находящегося в состоянии продолжительной ишемии, например, в процессе трансплантации. Однако реперфузия кровотока вызывает повреждение эндотелия и миоцитов, приводя к органной дисфункции (Buerke et al. Am. J.Phisiol. 266:H128-136, 1994; Lucchesi and Mullane, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 26:2011-2024, 1986; Lucchesi et al. J.Mol. Cell Cardiol. 21:1241-1251, 1989). Последующие события, связанные с реперфузионным повреждением, инициируются повреждением эндотелия, что характеризуется уменьшением выделения базальными эндотелиальными клетками окиси азота (NO) в течение первых 2,5-5 минут после реперфузии (Tsao and Lefer, Am. J.Phisiol. 259:H1660-1666, 1990). Уменьшение получаемого из эндотелия NO связывают с адгезионным молекулярным регулированием на клеточных мембранах эндотелия и полиморфоядерных (PMN) лейкоцитов (Ма et al., Circ. Res. 72:403-412, 1993; Weyrich et al. J.Leuco. Biol. 57:45-55, 1995). Это событие провоцирует PMN/эндотелиальное взаимодействие, которое протекает в течение 10-20 мин после реперфузии, и последующая PMN инфильтрация в миокард наблюдается в течение 30 мин после реперфузии (Lefer and Hayward, In: The Role of Nitric Oxide in Ischemia-Reperfusion: Contemporary Cardiology, Loscaizo et al. (Eds.), Humana Press, Totowa, NJ, pp.357-380, 2000; Lefer and Lefer, Cardiovasc. Res. 32:743-751, 1996; Tsao et al. Circulation 82:1402-1412, 1990; Weyrich et al., J.Leuco. Biol. 57:45-55, 1995).

Хемотактные вещества, выделяющиеся из реперфузируемой ткани, и факторы, содержащиеся в плазме, активируют PMNs, которые повышают выделение PMN цитотоксических веществ (т.е. супероксидный анион) и вносят свой вклад в дисфункцию органа с последующей ишемией/реперфузией (Lucchesi et al. J.Moll. Cell. Cardiol. 21:1241-1251, 1989; Ма et al. Circ. Res. 69:95-106, 1991; Tsao et al., Circulation 82:1402-1412, 1990; и Tsao et al., Am. Heart J. 123:1464-1471, 1992).

Супероксид соединяется с NO с образованием пероксинитритного аниона, уменьшив тем самым биодоступность NO, и стимулирует дисфункцию эндотелия и инфильтрацию PMN после ишемии/реперфузии миокарда (Clansey et al., Clin. Invest. 90:1116-1121, 1992; Hansen, Circulation 91:1872-85, 1995; Lucchesi et al., J.Mol. Cell Cardiol. 21:1241-1251, 1989; Rubanyi and Vanhoutte, Am. J.Physiol 250:H815-821, 1986; Tsao et al., Am. Heart J. 123:1464-1471, 1992; и Weiss, New Eng. J.Med. 320:365-375, 1989).

Следовательно, сохраняется потребность в растворе улучшенного качества, который может увеличить продолжительность консервации органа для трансплантации и защитить орган от реперфузионного повреждения после ишемии, так чтобы орган мог вновь обрести свою функцию после возобновления кровообращения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается раствора для консервации, перфузии и/или реперфузии органа, особенно сердца, содержащего пептидный ингибитор (-ы) протеинкиназы С ε (РКС ε). Раствор предохраняет ткани и клетки органов от повреждений, в то время как орган изолирован от системы кровообращения или испытывает недостаточность кровообращения (ишемия). Авторами настоящего изобретения обнаружено, что пептидные ингибиторы РКС ε могут создавать протективные эффекты в отношении органов, подвергнувшихся ишемии/реперфузии.

В своем воплощении как изобретение раствор содержит около 1-10 µМ, предпочтительно около 1-5 µМ пептидного ингибитора РКС ε, растворенного в растворе, предпочтительно в физрастворе.

Раствор по настоящему изобретению может использоваться как перфузионный раствор или как консервирующий раствор. Как перфузионный раствор он может накачиваться в сосуды органа для защиты клеток и тканей органов. Как консервирующий раствор он служит в качестве омывающего раствора, в который погружен орган. Предпочтительно, когда орган подвергается перфузии раствора и одновременно погружен в него. Кроме того, данный раствор служит также и раствором для реперфузии при возобновлении кровообращения в органе после ишемии.

Настоящее изобретение включает также способы применения раствора по настоящму изобретению. Они включают способы консервации органа для трансплантации, для защиты ишемичного органа от повреждения, для смягчения дисфункции органа после ишемии и для защиты органа от повреждения при изолировании его от системы кровообращения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг.1 представлен график, показывающий динамику во времени LVDP (развившееся давление в левом желудочке = граница систолического давления в левом желудочке (LVESP) - граница диастолического давления в левом желудочке (LVEDP) в искусственных сердцах крыс при префузии I/R, I/R, I/R+PMNs и I/R+PMN+PKC ε пептидного ингибитора (5 µМ).

На фиг.2 представлен график, показывающий динамику во времени LVEDP в искусственных группах I/R, I/R, I/R+PMN и I/R+PMN+PKC ε пептидного ингибитора (5µМ).

На фиг.3 представлен график, показывающий начальный и конечный LVDPs, выраженные в мм рт.ст. от изолированных перфузируемых сердец крыс до ишемии (I) (Initial) и спустя 45 мин после реперфузии (Final). Сердца подвергали перфузии в присутствии и в отсутствие или PMNs. PMNs индуцировали значительную контрактильную дисфункцию, которая была аттенуирована (ослаблена) РКС ε пептидным ингибитором. Все величины выражены как значение ±SEM. Количество подвергнутых опытам сердец указано внизу полос.

На фиг.4 представлен график, показывающий начальные и конечные максимальные скорости LVDP (+dP/dt max), выражаемые в мм рт.ст. в сек в изолированных перфузируемых сердцах крыс до ишемии (Initial) и после реперфузии (Final). Сердца подвергали перфузии в присутствии или в отсутствие PMNs. PMNs индуцировали значительную контрактильную дисфункцию, которая аттенуировалась РКС ε пептидным ингибитором. Все величины выражены как значение ±SEM. Количество подвергнутых опытам сердец указано внизу полос.

На фиг.5 представлен график, показывающий коронарные кровотоки в семи группах экспериментов по кардиальной функции (искусств. I/R, искусств. I/R+РКС ε пептидный ингибитор (5 µM), I/R, I/R+РКС ε пептидный ингибитор (5 µМ), I/R+PMNs, и I/R+PMN+РКС ε пептидный ингибитор (1 и 5 µМ)).

На фиг.6 представлен график, показывающий ритм сердца в семи группах экспериментов по кардиальной функции (искусств. I/R, искусств. I/R+РКС ε пептидный ингибитор (5 µМ), I/R, I/R+РКС ε пептидный ингибитор (5 µМ), I/R+PMNs, и I/R+PMN+РКС ε пептидный ингибитор (1 и 5 µМ).

На фиг.7 представлен график, показывающий выделение NO из эндотелия аорты крыс в необработанных (базальных) сегментах по сравнению с обработанными РКС ε пептидным ингибитором сегментами (1, 5, и 10 µМ).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к раствору для консервации, перфузии и/или реперфузии органа, особенно сердца. Раствор содержит пептидный ингибитор (-ы) протеинкиназы ε (РКС ε). Предпочтительно пептидный ингибитор РКС ε содержится в растворе в количестве около 1-10 µM, более предпочтительно около 1-5 µM.

В предпочтительном варианте пептидный ингибитор с концентрацией 1-10 µМ, более предпочтительно около 3-5 µМ, имеет аминокислотную последовательность EAVSLKPT (SEQ ID NO: 1).Также, в других вариантах изобретения предпочтительно, чтобы пептидный ингибитор был миристоилирован, чтобы способствовать лучшей абсорбции внутри клеток органа. Миристоилирование предпочтительно на N-конце пептидного ингибитора.

В предпочтительном варианте пептидный ингибитор (-ы) растворяют в растворе соли, предпочтительно обычного физиологического раствора (0,9% NaCl).Пептидный ингибитор(-ы) может быть также растворен в известном консервирующем растворе, таком как Krebs-Henseleit растворе, UW растворе, St.Thomas П растворе, Collins растворе, Stanford растворе и т.п. Раствор может также содержать один или несколько (ионов) натрия (Na⁺), калия (K⁺), кальция (Ca²⁺), магния (Mg²⁺), глутамат, аргинин, аденозин, маннитол, аллопуринол, глутатион, раффинозу и лактобионовоую кислоту в концентрациях около 4-7 мМ, около 0,2-0,3 мМ, около 108-132 мМ, около 13-16 мМ, около 18-22 мМ, около 2-4 мМ, около 0,5-1 мМ, около 27-33 мМ, около 0,9-1,1 мМ, около 2,7-3,3 мМ, около 25-35 мМ, и около 80-120 мМ, соответственно. Na⁺ может быть в форме NaOH; K⁺ может быть в форме KCl и/или KH₂PO₄, наиболее предпочтительно при соотношении около 2-3,5 мМ KCl и около 2-3,5 KH₂PO₄; Ca²⁺ может быть в форме CaCl₂; а Mg²⁺ может быть в форме MgCl₂. Раствор может также содержать один или несколько пептидных ингибиторов протеинкиназы С β П (РКС β П), протеинкиназы С ζ (РКС ζ) и пептидного активатора (-ов) протеинкиназы С δ (РКС δ). Раствор предпочтительно сохраняется при физиологическом рН около 7,0-7,5, более предпочтительно около 7,2-7,4.

Раствор может быть использован в течение всех фаз, включая (но не только): 1) выделение органа из донора (кардиоплегический раствор); 2) консервация органа (гипотермическое хранение/транспорт); и 3) реимплантирование органа реципиенту (реперфузионный раствор).

Во время перфузии или реперфузии, особенно сердца, предпочтительно, чтобы орган перфузировали при скорости около 1 мл/мин в течение примерно 5 минут. Скорость перфузии может варьироваться, но она не должна превышать примерно 25 мл/мин. В конце концов скорость перфузии должна быть не настолько высокой, чтобы обременять высоким давлением сосудистую систему органа.

Раствор может быть приготовлен 1) растворением или разбавлением пептидного ингибитора (-ов) и других различных составляющих в дистиллированной воде; 2) доведением pH до примерно 7,2-7,4, например, с помощью NaOH; и 3) стерилизацией раствора, например, фильтрованием через 0,2 µм фильтр. Стерильный раствор затем хранят в условиях, исключающих попадание загрязнений из окружающей среды.

Без приведения дополнительного описания деталей можно рассчитывать, что специалист в данной области сможет, используя приведенное выше описание и следующие далее иллюстративные примеры, получить и использовать соединения настоящего изобретения, практически осуществив заявленные способы. Следующий далее пример дается для иллюстрации настоящего изобретения. Должно быть понятно, что изобретение не ограничивается теми конкретными условиями или деталями, которые приведены в этом примере.

Пример

Самцов Sprague Dawley крыс (273-275 г, Асе Animals, Boyertown, PA) анестезировали внутрибрюшинно (i.p.) пентабарбиталом натрия, 60 мг/кг. Был также введен i.p. натрий-гепарин (1000 U). Сердца быстро иссекали, в восходящие аорты были введены канюли и ретроградную перфузию сердца начинали с модифицированного Krebs буфера при поддержании 37°С и постоянном давлении 80 мм рт.ст. Krebs буфер имел следующий состав (в ммоль/л): 17 декстрозы, 120 NaCl, 25 NaHCO₃, 2,5 CaCl₂, 0,5 ЭДТА, 5,9 Kcl и 1,2 MgCl₂. Перфузат аэрировали 95% O₂ с 5% CO₂ и уравновешивали при pH 7,3-7,4. Два боковых рукава по линии перфузии, ближайшие к канюле притока в сердце, позволяли PMNs, плазме без РКС ε пептидного ингибитора (1 или 5 µM) непосредственно инфузироваться в коронарную приточную линию. Коронарный проток регистрировали с помощью проточного счетчика (Т106, Transonic System, Inc., Ithaca, NY). LVDP и +dP/dt_max регистрировали, используя датчик-преобразователь давления (SPR-524, Millar Instruments, Inc, Houston, TX), который был расположен в полости левого желудочка. Сердца погружали в резервуар с водяной рубашкой, содержащей 160 мл Krebs буфера при поддержании 37°С. Коронарный проток LVDP и +dP/dt_max регистрировали с помощью системы поглощения Powerlab Station (ADInstruments, Grand Junction, CO) в сочетании с компьютером.

LVDP, +dP/dt_max и коронарный проток измеряли каждые 5 мин в течение 15 мин до уравновешивания сердец и получали значение базовой линии. LVPP определяли граничное систолическое давление левого желудочка минус граничное диастолическое дaвлeниe лeвoго жeлyдoчкa. Спycтя 15 мин пoтoк Krebs бyфepa yмeньшaли дo нyля в течение 20 минут, чтобы индуцировать полную ишемию. При реперфузии сердца инфузировали в течение 5 мин 200×10⁶ PMN, ресуспендировали в 5 мл Krebs буфера плюс 5 мл плазмы со скоростью 1 мл/1 мин. В некоторых экспериментах РКС ε пептидный ингибитор (Geremed Synthesis, Inc., San Franscisco, CA) добавляли к плазме до конечной концентрации 1 или 5 µМ. Фиктивные I/R сердца не подвергались ишемии и не перфузировались PMNs.

Следующие группы изолированных перфузированных сердец крыс использовались:

Группа 1: Фальшивые I/R сердца не подвергали ишемии и не перфузировали PMNs, но перфузировали 5 мл плазмы (1 мл/мин) в течение 35-минутной перфузии (та же самая временная точка, в которой в I/R сердца должны были подавать 5 мл плазмы, 15 мин регистрируемой базовой линии плюс 20 минут ишемии). Эти сердца представляли собой контрольную группу для того, чтобы определить, может ли изолированное сердце сохранять LVDP и +dP/dt_max в течение всего 80 минутного протокола (n=6).

Группа 2: Фиктивные I/R с введенным РКС ε пептидным ингибитором (5 µM) сердца не подвергались ишемии и не перфузировались PMNs. В эти сердца вводили РКС ε пептидный ингибитор (5 µМ, растворенный в плазме из 5 µM маточного раствора в воде) 35 минут во время перфузии. Эту группу использовали для того, чтобы определить, вызывает ли РКС ε пептидный ингибитор кардиотонический или кардиоугнетающий эффект (n=6).

Группа 3: I/R сердца подвергали 20 мин ишемии и перфузировали 5 мл плазмы (1 мл/мин) в течение первых 5 мин реперфузии, но не перфузировали PMNs. Эти сердца представляли собой контрольную группу для определения, является ли 20 минутная ишемия с последующей реперфузией ошеломляющей для сердца, но будут ли восстановлены LVDP и +dP/dt_max до значений базовой линии (первоначальной) к концу 45-минутного реперфузионного периода? (n=7).

Группа 4: I/R с введенным ε пептидным ингибитором (5 µМ, растворенный в плазме) сердца были подвергнуты 20-минутной ишемии и не перфузированы PMNs. Эти сердца были перфузированы 5 мл плазмы + РКС ε пептидного ингибитора в течение первых 5 мин реперфузии. Эта группа использовалась для определения, оказывает ли РКС ε пептидный ингибитор кapдиoyгнeтaющий эффeкт в pядy I/R бeз PMNs (n=6).

Группа 5: I/R+PMNs сердца подвергали 20 минутной ишемии и перфузировали 5 мл плазмы (1 мл/мин) и PMNs (ресуспендировали в 5 мл Krebs буфера) в течение первых 5 минут реперфузии. Эти сердца представляли собой контрольную группу для определения, приводит ли 20-минутная ишемия с последующей 45-минутной реперфузией в просутствии PMNs (200×10⁶) к длительной, непрерывной контрактильной кардиальной дисфункции в течение 45 мин реперфузионного периода по сравнению с величинами базовой линии (n=7).

Группа 6: I/R+PMNs+(введенный) РКС ε пептидный ингибитор (1 µМ) сердца были подвергнуты 20 минутной ишемии и перфузированы с использованием 1 µМ РКС ε пептидного ингибитора (растворенного в плазме) и PMNs (200×10⁶) в течение 5 минут реперфузии. Эти сердца представляли собой группу для определения влияния РКС ε ингибирования в аттенуации PMN-индуцированной кардиальной контрактильной дисфункции (n=6).

Группа 7: I/R+PMNs+РКС ε пептидный ингибитор (5 µM) - сердца были подвергнуты 20 минутной ишемии и перфузированы с использованием 5 µМ РКС ε пептидного ингибитора (растворенного в плазме) и PMNs (200×10⁶) в течение первых 5 минут реперфузии. Эти сердца представляли группу для определения эффекта РКС ε ингибирования при более высоких концентрациях РКС ε пептидного ингибитора при аттенуации PMN-индуцированной кардиальной контрактильной дисфункции (n=6).

На фиг.1 показана динамика кардиальной контрактильной дисфункции (LVDP) на фиктивных I/R, I/R, I/R+PMN+I/R+PNM+РКС ε пептидный ингибитор (5 µМ) - группах и показаны изменения LVDP в течение 80 минут перфузионного периода. LVDP в сердцах с фиктивной I/R группой оставались на уровне величин LVDP 100±2% от первоначальной базовой линии в течение всего периода перфузии. LVDP в сердцах в I/R группе подвергались угнетению в течение первых стадий реперфузии, но к концу реперфузии они восстановились до 92±3% начальных значений базовой линии. Однако сердца в группе I/R+PMN показали очень сильную кардиальную контрактильную дисфункцию, которая восстанавливалась только на 55±5% от первоначальных значений базовой линии к концу реперфузии. Наоборот в сердцах группы I/R+PMN+РКС ε пептидный ингибитор (5 µМ) существенно восстанавливался LVDP через 15 мин реперфузии (88±9% первоначальных значений базовой линии) и продолжал увеличиваться в течение 45-минутного периода реперфузии и достигал 99±6% первоначальных значений базовой линии.

Существенные различия между сердцами, обработанными РКС ε ингибитором, и контрольными I/R+PMN сердцами, наблюдаемые по динамике LVDP, в основном, могут быть объяснены границей диастолического давления. На фиг.2 показана динамика LVEDP в фиктивных группах I/R, I/R, I/R+PMN и I/R+PMN+РКС ε пептидный ингибитор (5 µМ). Там нет существенных различий в первоначальных LVEDP (5-8 мм рт.ст.). Однако существенные различия наблюдались между контрольными I/R+PMN и I/R+PMN+РКС ε ингибитор - обработанными сердцами сразу же в 15 минутный период после реперфузии и эта разница была постоянной (непрерывной) все 45 минут реперфузии. Контрольные I/R+PMN сердца мели финальный LVEDP 42±7 мм рт.ст. по сравнению с сердцами, обработанными I/R+PMN+РКС ε ингибитором, которые имели финальный LVEDP 16±2 мм рт.ст., и эта разница была значимой (p<0,01).

Для того чтобы установить, оказывает ли РКС ε пептидный ингибитор какие-либо непосредственные инотропные эффекты на кардиальную контрактильную функцию, фиктивные I/R сердца перфузировали, используя РКС ε пептидный ингибитор (5 µM). Эта группа служила одним из контролей опыта. Эти сердца не показали никаких значительных изменений LVDP (фиг.3) или +dP/dt_max (фиг.4) к концу 80 минутного реперфузионного периода, таким образом показывая, что в этой дозе РКС ε пептидный ингибитор не оказывал непосредственного влияния на кардиальную контрактильную дисфункцию. Фиг.3 и 4 показали начальные и конечные величины LVDP и +dP/dt_max из изолированных перфузированных сердец, соответственно. Существенной разницы между первоначальными значениями базовой линии во всех изучаемых группах не было. Также не было установлено существенной разницы между начальными и конечными величинами LVDP и +dP/dt_max для группы фиктивных образцов I/R, I/R, группы фиктивных образцов I/R+РКС с ε пептидным ингибитором и I/R+РКС с ε пептидным ингибитором (5 µМ). Тем не менее наблюдалась существенная разница между начальными и конечными величинами LVDP и +dP/dt_max для I/R+PMN группы. Наблюдалось значительное снижение (p<0,01) по сравнению с начальным значением базовой линии до 55±5% LVDP и 47±4% по +dP/dt_max в течение 45 минут после реперфузии. Доза в 5 µМ оказалась самой кардиопротективной, так что сердца в группе I/R+PMN+РКС ε пептидным ингибитором (5 µМ) восстанавливались до 99±6% и 87±5% по сравнению с начальной базовой линией через 45 минут после реперфузии по LVDP и +dP/dt_max, соответственно. Эти величины значительно отличались от I/R+PMN через 45 минут после реперфузии (p<0,01). Доза РКС ε пептидного ингибитора в 1 µМ не оказалась кардиопротективной, т.к. сердца в группе I/R+PMN+РКС ε пептидный ингибитор (1 µМ) восстановились только до 66±9% и 59±9% по LVDP и +dP/dt_max, соответственно. Конечные величины LVDP и +dP/dt_max в группе при 1 µМ дозе не отличались существенно от конечных величин в группе I/R+PMN.

Фиг.5 иллюстрирует коронарный проток по семи группам в опытах по исследованию функции сердца. Первоначальный коронарный проток не имел существенных различий (16-21 мм/мин). Контрольные группы I/R+PMN восстановились только до 34±8% от первоначального значения базовой линии, тогда как сердца, обработанные I/R+PMN ε ингибитором восстановились до 62±3% от первоначальной базовой линии и эта разница оказалась заметной (p<0,01).

На фиг.6 показан ритм сердец в семи группах в опытах по исследованию кардиальной функции. В начальном ритме сердец нет существенных различий (295-265 ударов/мин). Контрольные группы восстанавливаются только до 72±7% от первоначальной базовой линии, и эта разница была значительной (p<0,05).

Фиг.7 показывает выделение NO из аортального эндотелия крыс в необработанных (базальных) сегментах по сравнению с сегментами, обработанными РКС ε пептидным ингибитором (1-10 µМ). Ацетилхолин (Ach) (10 µМ) использовался как позитивный контроль. Наблюдали дозозависимый эффект в сегментах, обработанных РКС ε пептидным ингибитором, который значительно ингибировал базальное выделение NO от 2,12±0,39 пмоль/мг ткани до 0,66±0,28 (5 µM; p<0,05) и 0,26±0,42 (10 µM) пмоль/мг ткани. Несмотря на то что нарастание выделения выработанного эндотелиально NO обычно связывают с кардиопротектированием вследствие I/R, требует всестороннего изучения тот факт, что фермент, ответственный за выделение эндотелиального NO (eNOS) может изменить свое предназначение (специфичность) в процессе, когда выделяется супероксид, при том что субстрат (L-аргинин) или ко-фактор (BH₄) не так легко доступен во время начала реперфузии.

Несмотря на то что определенные предпочтительные в настоящее время варианты изобретения подробно описаны здесь, любому специалисту в данной области будет очевидно, что изобретение может охватывать и модификации самых различных вариантов воплощения настоящего изобретения, которые могут быть осуществлены без ущерба для идеи изобретения и его объема. Соответственно подразумевается, что изобретение ограничено объемом, охарактеризованным в формуле изобретения.

Настоящее изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, и касается раствора для консервации, перфузии и/или реперфузии органа, особенно сердца, предназначенного для трансплантации. Раствор содержит пептидный ингибитор протеинкиназы С ε (РКС ε). Способы применения заявленного раствора также описываются, включая методы консервации органа для трансплантации, для защиты органа в состоянии ишемии от повреждения, для ослабления органной дисфункции после ишемии, для поддержания выделения оксида азота и/или ингибирования выделения супероксида в ишемичном органе, а также для защиты органа от повреждений, когда он изолирован от системы кровообращения. 2 н. и 22 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Раствор для перфузии, консервации и/или реперфузии для консервации органов, включающий, по меньшей мере, один пептидный ингибитор протеинкиназы ε(РКСε).

2. Раствор по п.1, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один пептидный ингибитор растворен в солевом растворе.

3. Раствор по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает хлорид калия.

4. Раствор по п.1, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один пептидный ингибитор РКСε имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

5. Раствор по п.1, отличающийся тем, что концентрация, по меньшей мере, одного пептидного ингибитора РКСε составляет от 1 до 10 мМ.

6. Раствор по п.1, отличающийся тем, что орган представляет собой сердце.

7. Раствор по п.1, отличающийся тем, что орган представляет собой орган млекопитающего.

8. Раствор по п.7, отличающийся тем, что млекопитающее является человеком.

9. Раствор по п.1, отличающийся тем, что орган консервируют для трансплантации.

10. Способ консервации органа для трансплантации, сохранения органа в состоянии ишемии, аттенуирования органной дисфункции после ишемии или защиты органа от повреждения после изоляции от системы кровотока, отличающийся тем, что он включает стадию перфузирования органа раствором по п.1.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один пептидный ингибитор растворен в солевом растворе.

12. Способ по п.10, отличающийся дополнительным включением в раствор хлорида калия.

13. Способ по п.10, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один пептидный ингибитор имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

14. Способ по п.10, отличающийся тем, что концентрация, по меньшей мере, одного пептидного ингибитора РКСε составляет от 1 до 10 мМ.

15. Способ по п.10, отличающийся тем, что орган представляет собой сердце.

16. Способ по п.10, отличающийся тем, что орган представляет собой орган млекопитающего.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что млекопитающее является человеком.

18. Способ по п.10, отличающийся тем, что орган консервируют для трансплантации.

19. Способ по п.10, отличающийся тем, что пептидные ингибиторы миристолируют.

20. Способ по п.10, отличающийся тем, что он включает дополнительно стадию погружения органа в раствор по п.1.

21. Способ по п.10, отличающийся тем, что стадию перфузирования проводят со скоростью менее чем около 20 мл/мин.

22. Способ по п.10, отличающийся тем, что стадию перфузирования проводят при скорости около 1 мл/мин.

23. Способ по п.10, отличающийся тем, что стадию перфузирования проводят как ретроградную перфузию.

24. Способ по п.10, отличающийся тем, что стадия перфузии продолжается около 5 мин.