КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЯЙЦА ПАРАЗИТОВ, И СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ ЯИЦ ПАРАЗИТОВ Российский патент 2012 года по МПК A61K35/56 A61P37/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая яйца гельминта (паразитического червя), и способ лечения, снижения выраженности, профилактики или излечивания аутоиммунного или аллергического заболевания у животного или человека, путем применения яиц, которые можно выделить из композиции. В настоящем изобретении также предложены способы выделения и хранения яиц гельминта, и способ получения фармацевтической композиции, включающей препарат гельминта. Яйца гельминта можно получить из свиного власоглава; Trichuris suis (TSO).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

TSO представляет собой исходный материал активного фармацевтического ингредиента, предназначенного для лечения аутоиммунных или аллергических заболеваний.

Применение материала паразитов для медицинского лечения воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) описано, например, в патенте США 6764838.

Причина воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), вероятно, связана как с генетическим фактором, так и воздействием окружающей среды. Современные теории предполагают, что ВЗК возникает в результате аномальной иммунной реакции на кишечные бактерии, инициированной неизвестными причинами. ВЗК распространено в индустриальных странах, в которых возникновение колоний гельминтов является редкостью. Наоборот, ВЗК редко встречается в тех регионах мира, в которых большинство людей заражено червями (глистами). Гельминты могут быть полезны при многих аутоиммунных или аллергических заболеваниях благодаря их уникальной способности уменьшать гиперреактивные иммунные ответы. Эту идею подтверждает то, что гельминты уменьшают воспаление кишечника как у мышей, так и человека.

Члены вида гельминтов Trichuris представляют собой круглых кишечных червей (власоглавов), имеющих характеристики, подходящие для терапевтического применения. Trichuris suis, свиной власоглав, генетически близок к Trichuris trichiura, власоглаву человеческому, но, как было показано экспериментально, колонизирует организм человека только на короткий период времени, не вызывая заболевания. Яйца Т. suis можно получить с помощью специальных свиней, свободных от патогенов, т.е. свиней, не имеющих инфекций, вызванных определенными патогенными микроорганизмами, и обработать таким образом, чтобы обеспечить отсутствие биологических загрязнений.

При любом производстве TSO существуют строгие допуски на загрязнение частицами и микробную активность раствора, применяемого в качестве среды:

1. Процесс выделения должен обеспечить загрязнение раствора частицами свыше 2% или 1% (по числу);

2. Процесс выделения должен обеспечить отсутствие яиц других паразитов;

3. Микробный профиль должен удовлетворять требованиям для перорального введения состава, содержащего неочищенный материал природного происхождения, согласно категории 3В Европейской Фармакопеи;

4. Среда, применяемая для хранения, должна обеспечить развитие яйца, не содержащего эмбрион (неинвазионного) в яйцо с развивающимся эмбрионом (инвазионное);

5. Среда предпочтительно не должна содержать антибиотики или другие химические вещества, которые могут вызвать аллергические реакции у потенциального пациента;

6. Среда, применяемая для хранения, должна обеспечить возможность продолжительного хранения (3-5 лет), не влияющего на инвазионную способность TSO, с тем чтобы способствовать увеличенному сроку годности медицинского продукта при хранении;

7. Способ должен обеспечить выделение высокого количества яиц.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Паразиты-гельминты

Определение гельминтов (паразитических червей) включает две группы. К первой группе относятся гельминты, которые легко колонизируют организм некоторых хозяев-млекопитающих, в том числе человека, а ко второй группе относятся гельминты, которые не могут успешно колонизировать некоторые виды млекопитающих, в том числе человека, но могут обеспечить защиту особи, если она инфицирована, благодаря стимулированию иммунной системы.

Гельминты, принадлежащие к первой группе, представляют собой многоклеточных червей со сложными жизненными циклами и развитием, приспособленным к конкретным видам млекопитающих. Нематоды (несегментированные круглые черви) и платигельминты (плоские черви) являются двумя группами гельминтов, которые могут колонизировать кишечник человека. В соответствии с настоящим изобретением, любой из многочисленных гельминтов, которые свободно колонизируют организм человека или животных, обеспечит желаемый результат. Нематодами, которые часто заселяют пищеварительный тракт человека, являются Ascaris lumbhcoides, Enterobius vermicularis (глист), Trichuris trichiura (власоглав), Ancylostoma duodenale и Necator americanus (анкилостомы) и Strongyloides stercoralis. Trichinella spiralis может инвазировать тонкую кишку на короткий промежуток времени, но является редкой.

Платигельминты включают трематоды и цестоды. Наиболее распространенными зрелыми трематодами, которые живут в кишечнике человека, являются виды Fasciolopsis, Echinostoma и Heterophyes. Виды, которые живут в системе желчных протоков, включают Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini, O.felineus и Fasciola hepatica и gigantica. Виды Schistosoma обитают в венозной системе, но несколько видов хронически поражают пищеварительный тракт за счет прохождения яиц через стенки кишечника. Зрелыми цестодами, обычно инвазирующими организм человека, являются виды Diphyllobothrium (широкий лентец), Taenia saginata (бычий цепень), Taenia solium (свиной солитер) и Hymenolepsis diminuta и Н.nana (карликовый цепень).

Другие представляющие интерес гельминты включают филярии и легочных сосальщиков. Эти виды не имеют кишечной фазы, но стимулируют сильные иммунные реакции (тип Th2).

Вторая общая группа гельминтов, которую можно применять в настоящем изобретении, включает гельминты, которые обычно не колонизируют организмы определенных видов млекопитающих, в том числе человека, но могут обеспечить защиту против заболеваний, в том числе аллергий, характеризующихся иммунными реакциями "Th1-типа". Эти виды включают Trichuris muris (мышиный власоглав), Trichinella spiralis, Nippostrongylus brasiliensis, Heligmosomoides polygyrus и Hymenolepsis nаnа, каждый из которых является кишечным гельминтом, заразным для мышей. Trichuris suis и Ascaris suum представляют собой гельминты свиней, которые могут инфицировать человека. Виды Trichuris vulpis, Toxocara, Toxascaris, Gna-thostoma и Ancylostoma являются гельминтами собак или кошек, которые также могут заражать людей. Anisakis и Pseudoterranova представляют собой нематоды морских млекопитающих, которые могут передаваться человеку. Птичьи шистосомы могут кратковременно инфицировать людей. Такие шистосомы включают S. douthitti, Trichobilharzia ocellata, Т. stagnicolae, T. physellae и Gigantobilharzia huronensis.

Заболевания, которые можно лечить согласно настоящему изобретению

А. Воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона, БК, и язвенный колит, ЯК).

Эпидемиологические данные указывают на генетическую предрасположенность к развитию болезни Крона (БК) и язвенного колита (ЯК). Заболеваемость БК в индустриальных обществах возросла с 1950 годов, и в настоящее время составляет от 1 до 8 случаев на 100000 человек в год. Это наводит на мысль, что неизвестные изменения в окружающей нас среде повлияли на частоту возникновения БК.

Хотя причина ВЗК остается неясной, это заболевание, как полагают, возникает в результате нарушения регуляции иммунной системы слизистой оболочки кишечника. Клетки воспаления в слизистой оболочке обычно защищают нас от содержимого просвета органа. Это высокоэффективное хроническое воспаление строго контролируют, чтобы ограничить повреждение тканей. ВЗК может возникать в результате мощных иммунных реакций на факторы просвета. По-видимому, БК представляет собой чрезмерно сильное воспаление Тh1-типа, при котором имеет место продукция ИФН-гамма и ФНО-альфа. Природа ЯК установлена менее хорошо.

Существует несколько моделей хронического кишечного воспаления на животных. Важным достижением является недавнее открытие того факта, что у некоторых мышей с созданными методами генетической инженерии делециями генов может развиться хроническое воспаление кишечника, сходное с ВЗК. Указанные мыши включают мышей-мутантов, несущих направленные делеции для IL-2, IL-10, МНС класса II или генов TCR (антиген-распознающих рецепторов Т-лимфоцитов), среди прочего. Применение некоторых из этих моделей показало, что нарушение регуляции иммунной системы само по себе может вызывать повреждение кишечника. Воспаление слизистой оболочки в некоторых из этих моделей приводит к наработке больших количеств ИФН-гамма и ФНО-альфа, что указывает на то, что избыточное продуцирование цитокинов Тh1-типа является общим механизмом, лежащим в основе патогенеза заболевания. Помимо этого, блокирование цепи Th1 предотвращает воспаление. БК также характеризуется высокой реакцией Тh1. Соответственно, эти модели могут иметь непосредственное применение для понимания иммунопатологии прогрессирования этого заболевания человека.

В. Ревматоидный артрит (РА).

РА является хроническим заболеванием, которое характеризуется продолжительным воспалением синовиальной оболочки, обычно затрагивающим периферические суставы при симметричном распространении. Это воспаление может привести к эрозиям костей, повреждению хрящей и разрушению суставов. Это болезнь поражает примерно 1% населения. Заболеваемость увеличивается с возрастом, при этом женщины болеют более часто, чем мужчины. Распространение РА представляет собой иммунологически опосредуемое явление, направляемое CD4+ клетками Тh1 (гиперчувствительность III типа).

С. Инсулинозависимый, юношеский сахарный диабет (СД) (тип 1).

СД 1 типа представляет собой заболевание, которое обычно начинается во время раннего периода полового созревания и причиной которого является неспособность вырабатывать инсулин в ответ на увеличение концентрации сахара в крови. Недостаток инсулина приводит к постоянно высоким уровням сахара в крови и неспособности усваивать надлежащим образом глюкозу, вызывает нарушения обмена веществ, которые, в конечном счете, приводят к повреждениям глаз, почек, сердца и других органов. Парентеральное введение инсулина позволяет частично контролировать эти проблемы с метаболизмом. СД 1 типа возникает вследствие аутоиммунной атаки на бета-клетки поджелудочной железы, которые являются источником инсулина. Активированные макрофаги и цитотоксические Т-клетки окружают и разрушают бета-клетки поджелудочной железы. Генетическая предрасположенность и плохо изученные факторы окружающей среды инициируют развитие заболевания.

D. Красная волчанка (KB).

KB является системным аутоиммунным заболеванием, которое наиболее часто встречается у женщин в возрасте от раннего до среднего периода полового созревания. Повреждение тканей вызывают аутоиммунные антитела и гиперактивные регуляторные Т-клетки. Аномальная иммунная реакция делает возможным продолжительное продуцирование патогенных аутоантител и иммунных комплексов, возможно, связанных с гиперчувствительностью III типа. Это приводит к повреждению тканей костей и мышц, кожи, тканей кровеносной системы, тканей почек и тканей других систем. Аномальная иммунная реакция, возможно, зависит от взаимодействия многофакторной наследственности и факторов окружающей среды.

Е. Саркоидоз.

Саркоидоз представляет собой хроническое гранулематозное заболевание легких и других органов, возникающее по неизвестной причине. Возраст большинства пациентов составляет 20-40 лет. Наиболее частым симптомом является одышка. Заболевание возникает в результате чрезмерной клеточной иммунной реакции Тh1-типа, возможно, на ограниченное количество антигенов. Саркоидоз распространен по всему миру и поражает все расы. Однако существует заметные различия частоты заболеваемости саркоидозом среди определенных этнических и расовых групп. Например, это заболевание является редким в Польше, Юго-Восточной Азии и Индии.

F. Рассеянный склероз (PC).

PC является хроническим рецидивирующим, многоочаговым воспалительным заболеванием центральной нервной системы, которое приводит к очаговой демиелинизации и рубцеванию мозга. PC - часто встречающееся заболевание, от которого страдает примерно 1 млн человек в западном мире и которое часто начинается во время раннего - среднего периода полового созревания. PC является аутоиммунным заболеванием, опосредуемым, по меньшей мере частично, Th1 клетками. Патологические изменения при PC имеют сходство с повреждениями, вызванными аллергическими реакциями замедленного типа, которые содержат активированные Т-клетки и макрофаги. Это заболевание умеренного климата, уровень распространения которого возрастает с расстоянием от экватора.

G. Псориаз

Псориаз является хроническим рецидивирующим дерматитом, который можно найти у 2-3% популяций западных государств. Это заболевание обычно впервые диагностируется у пациентов в возрасте 10-30 лет и связано с ненормальными иммунными реакциями. Анормальная иммунная реакция, возможно, зависит от многофакторной наследственности и плохо изученных факторов окружающей среды.

Н. Аутизм

Аутизм характеризуется отклонениями в поведении и развитии, которые приводят к слабой социальной адаптации. Аутизм обнаруживается у 1% населения, однако уровень заболеваемости постепенно растет. Этиология заболевания неизвестна, но существует сильный генетический компонент, и заболевание особенно распространено в семьях с предрасположенностью к аутоиммунным заболеваниям, и, следовательно, в его развитии могут участвовать аутоиммунные реакции.

I. Аллергия

Что касается классических аутоиммунных заболеваний (например, заболеваний, упомянутых выше), значимость инфекции гельминтами для модификации гиперреактивных иммунных реакций в фенотипах аллергических заболеваний (например, заболеваниях гиперчувствительности I типа, таких как атопия, пищевая аллергия, астма, аллергический ринит и атопический дерматит) следует рассматривать в контексте гигиенической гипотезы. Коэффициенты заболеваемости этими заболеваниями неуклонно растут в промышленно развитых странах с высоким уровнем гигиены и санитарии.

Исследования по данным наблюдений воздействия микробов максимально согласованно свидетельствовали о том, что, в частности, инфекция гельминтами связана с уменьшением риска атопии и аллергических заболеваний. Как правило, инфекция гельминтами характеризуется высоким уровнем антитела IgE в сыворотке, наблюдаемым, кроме этого случая, только при аллергическом заболевании. Однако у пациентов, страдающих аллергией, IgE против, например, пыльцы, инициирует аллергическое воспаление в результате активации и дегрануляции тучных клеток, сопровождающееся прямыми симптомами (например, вздутиями, чиханием и слезотечением), в то время как инфекция гельминтами часто является бессимптомной вследствие состояния гипореактивности к гельминтам. Инфицирование различными видами гельминтов (например, шистосомами или анкилостомой) связывают со снижением риска атопии, что указывает на общий биологический механизм. Состояние гипореактивности во время гельминтной инфекции демонстрирует иммунологические характеристики, аналогичные характеристикам, наблюдаемым во время эффективной иммунотерапии аллергенами при лечении аллергического ринита, в том числе продуцирование цитокина IL-10, и IgG4, специфичного по отношению к антигенам/аллергенам. Как аллергические реакции, так и инфекция гельминтами характеризуются так называемым Th2-цитокиновым профилем (IL-4, IL-5 и IL-13). Однако при протекании хронической инфекции гельминтами этот профиль меняют цитокины IL-10, и TGFβ (ФНО-бета), которые, как полагают, обладают противовоспалительными регуляторными свойствами. Модели инфекции гельминтами и аллергических заболеваний на мышах подтверждают указанные наблюдения, сделанные на людях.

Основанные на наблюдениях исследования фокусировались главным образом на связи между астмой и гельминтами, и эти исследования также указывают на то, что наблюдаемое снижение риска развития астмы могло бы быть более существенным для инфекции, вызванной видом гельминтов с системной фазой в организме человека-носителя, и/или могло бы быть увеличено при возрастании интенсивности инфекции, измеряемой количеством яиц в фекалиях. В настоящее время полагают, что гельминты или их продукты выделения - характерные (уникальные) молекулы, которые особенно подходят для природной индукции устойчивой противовоспалительной регулирующей сети, которая могла бы предотвратить или ослабить симптомы аллергического заболевания. Подтверждение прямой причинно-следственной связи между инфекцией гельминтами и снижением риска аллергического заболевания было получено в исследованиях, показывающих, что противоглистное лечение в эндемических зонах эффективно удаляет значительную массу червей, но такое лечение имеет временную связь с увеличением положительных кожных реакций на аллергены (атопия).

Распространение указанных групп заболеваний (A-G) было в различной степени описано у домашних животных, хотя фон и клинические проявления могут отличаться от эквивалентного заболевания у человека. Однако имеется веская причина полагать, что указанные заболевания у животных также можно лечить согласно настоящему изобретению. Данные о вышеупомянутых аутоиммунных и аллергических заболеваниях, а также их излечении или улучшении состояния необходимы для принятия решения о необходимости лечения и для контроля протекания лечения. Для измерения клинических параметров указанных заболеваний у человека можно применять следующие методики.

1. Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК)

Оценка воспаления: У мышей клинические проявления заболевания включают потерю веса, диарею, выпадение прямой кишки и гистологическое подтверждение воспаления кишечника. Таким образом, улучшение этих параметров означало бы снижение выраженности (облегчение) заболевания.

Для оценки степени кишечного воспаления у животных моделей удаляют ткань, сворачивают в виде т.н. «швейцарского рулета» и заливают парафином в соответствии со стандартными методиками. Срезы окрашивают гематоксилином и эозином. Степень воспаления толстой кишки оценивает один патологоанатом слепым способом. Оценка - полуколичественная, степень может принимать значение от 0 до 4 баллов. Применяют стандартизованный метод: 0=воспаление отсутствует; 1=низкий уровень воспаления; 2=средний уровень воспаления; 3=высокий уровень воспаления с утолщением стенок; и 4=трансмуральная инфильтрация, и потеря бокаловидных клеток с утолщением стенок.

Чтобы подсчитать тучные клетки, образцы кишечной ткани отдельных мышей подготавливают по методике «швейцарского рулета», фиксируют в фиксаторе Карнуа, заливают парафином, а затем окрашивают синим и сафранином. Пятьдесят смежных полей каждого среза проверяют на наличие тучных клеток слизистой оболочки в собственной пластинке слизистой оболочки и слоях мышц. Тучные клетки идентифицируют по их характерному внутриклеточному зернистому окрашиванию альциановым синим. Все пробы оценивают слепым методом.

Активность заболевания у человека контролируют с применением различных клинических, лабораторных и гистологических критериев. Существует несколько четко установленных показателей активности ВЗК, которые позволяют отслеживать клинические параметры, такие как частота диареи и боли в животе. Одним особенно полезным индексом для оценки болезни Крона является индекс активности болезни Крона или ИАБК. ИАБК включает 8 переменных, связанных с активностью заболевания, он применялся в большинстве недавних исследований терапевтических препаратов, применяемых при болезни Крона. Он включает число раз жидкого или очень мягкого стула, интенсивность боли или спазма живота, общее самочувствие, наличие внекишечных проявлений заболевания, наличие или отсутствие брюшной массы, применение противодиарейных лекарств, гематокрит и массу тела. Комбинированный балл лежит в диапазоне от 0 до примерно 600. Баллы ниже 150 указывают на ремиссию и баллы выше 450 указывают на тяжелое заболевание.

Для оценки динамики терапии можно также применять стандартный вопросник качества жизни для конкретной болезни до и после лечения. Ирвайновский вопросник для пациентов с воспалительным заболеванием кишечника содержит 32 пункта. Он позволяет оценить качество жизни в отношении функционирования кишечника (например, частый жидкий стул и боль в животе), системных симптомов (утомление и измененная структура сна), социальной функции (посещение работы и необходимость отмены общественных мероприятий) и эмоционального состояния (сердитое, подавленное или раздражительное). Количество баллов варьирует от 32 до 224, при этом более высокие баллы указывают на лучшее качество жизни. Пациенты в стадии ремиссии обычно имеют балл между 170 и 190.

Кроме того, полезными являются эндоскопические, рентгеновские и гистологические оценки активности заболевания кишечника. В качестве системных индикаторов воспаления можно также контролировать уровни С-реактивных белков и скорость оседания эритроцитов.

2. Ревматоидный артрит

Оценка воспаления: Для мышей с артритом, индуцированным коллагеном, мышей осматривают через день и оценивают их лапы следующим образом: 0, нормальные; 1, эритема и умеренное опухание, ограниченное голеностопным суставом или пальцами нижних лап; 2, эритема и умеренное опухание, распространившееся от лодыжки до середины стопы; 3, эритема и сильное опухание, распространившееся от лодыжки до плюсневых суставов; и 4, анкилозирующая деформация с опуханием суставов. Эти баллы артрита могут коррелировать с гистологическими изменениями в пораженных артритом суставах. Успешное лечение приводит к снижению баллов артрита и улучшению гистологии.

Для артритов, индуцированных пристаном, суставы можно измерить микрометром для обнаружения опухания. У человека РА оценивают на основе измерения опухания суставов, эритемы, ограниченности подвижности и боли. Кроме того, можно анализировать синовиальную жидкость на концентрацию цитокина и белка воспаления, а также на состав и функцию лейкоцитов методами, известными в данной области. Биопсии синовиальной жидкости предоставляют ткань для гистологического анализа методами, известными в данной области.

3. Красная волчанка

Оценка воспаления: Нормальное развитие и функционирование иммунной системы во многом зависит от удаления нежелательных клеток в результате процесса, называемого апоптозом. Этот процесс часто инициируют взаимодействия между клетками через особые молекулы на поверхности клеток и рецепторы к ним. Одну такую систему называют FAS и FAS-лигандами. У мышей с дефектом по FAS (мыши LPR-I) или лиганду (мыши GLD-I) развивается иммунное заболевание, подобное волчанке.

Колонии мышей LPR или GLD содержат в микроизолированных клетках в особых условиях, исключающих присутствие патогенных микроорганизмов. У этих мышей может самопроизвольно развиться аутоиммунитет, но искусственная индукция повышает вероятность его развития. Чтобы вызвать заболевание, 8-недельным мышам вводят препарат, подобный пристану. В пределах двух месяцев, у мышей развивается аутоиммунное заболевание. В данной области хорошо известны многие клинические, гистологические и иммунологические критерии, применяемые для оценки индукции и снижения выраженности заболевания как у мышей, так и у человека.

4. Юношеский инсулинозависимый сахарный диабет (1 типа)

Оценка воспаления: У мыши NOD вследствие аутоиммунного разрушения панкреатических бета клеток развивается сахарный диабет 1 типа, аналогичный человеческому диабету. Клиническое, биохимическое, иммунологическое и гистологическое исследование известными в данной области методами позволяет оценить индукцию и снижение выраженности этого заболевания у мышей.

5. Саркоидоз

Оценка воспаления: В модели легочного воспаления эмболизацией гранулами антигены связывают с гранулами серофазы, которые при инъекции в хвостовые вены мышей эмболизируют легкие. Животных обычно предварительно сенсибилизируют к связанному антигену. Иммунная система хозяина выдает бурную иммунную реакцию на раздражающую гранулу. Эти очаговые воспалительные реакции, которые могут продолжаться в течение нескольких недель, можно исследовать гистологическими методами, оценивая размер. Также их можно выделить из ткани и исследовать состав клеток и продуцирование цитокина. Более того, для обследования легко получить лимфатические узлы корней легкого и селезенки.

Саркоидоз, заболевание людей, обычно поражает легкие. Определить саркоидоз и степень заболевания можно методами, известными в данной области. Тесты на функцию легких позволяют оценить растяжимость и функционирование легких. Кроме того, при промывании бронхов получают клетки воспаления, которые проникли в бронхиальное дерево в процессе воспаления. Можно исследовать состав и функционирование этих клеток. Для саркоидоза характерны инфильтраты легких и лимфаденопатия корней легкого. Соответственно периодический рентген грудной клетки или компьютерная томография могут помочь оценить активность заболевания. Для измерения степени и активности заболевания можно применять серологические тесты, такие как измерение ангиотензина, изменяющего активность ферментов, согласно способам, известным в данной области.

6. Рассеянный склероз

Оценка воспаления: Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит у восприимчивых мышей индуцируют путем многократных инъекций соответствующих сенсибилизирующих антигенов миулина. Мышей оценивают клинически согласно следующим критериям: 0, заболевания нет; 1, атония хвоста; 2, слабость задних конечностей; 3, паралич задних конечностей; 4, паралич задних конечностей и паралич или слабость передних конечностей; 5, умирающие. Для гистологического анализа выделяют и фиксируют в формалине спинной мозг и головной мозг. Залитые парафином срезы окрашивают и исследуют под световым микроскопом. Рассеянные спленоциты и клетки из других участков можно исследовать in vitro. Эти параметры помогают измерить улучшение состояния или положительную динамику заболевания.

У людей активность PC измеряют путем контроля развития и улучшения невротических признаков и симптомов. Наиболее широко применяемое определение по результатам называют расширенной шкалой состояния нетрудоспособности (Expanded disability status scale). Для контроля активности заболевания можно также применять анализ состава белков содержания клеток цереброспинальной жидкости, которые исследуют согласно методам, известным в данной области. Более того, последовательное изучение результатов магнитного резонанса демонстрирует новые усиленные гадолинием повреждения головного мозга.

7. Псориаз

Псориаз можно оценивать просто путем оценки процента кожи, которая поражена дерматитом, или более адекватно, с помощью подсчета баллов PASI (индекса активности и тяжести псориаза), которые отражают интенсивность повреждений кожи в динамике во времени в комбинации с размером площади поврежденной поверхности кожи.

8. Аутизм

Аутизм представляет собой расстройство поведения, и тяжесть симптомов можно оценить только путем изучения поведения.

9. Аллергия

Аллергия представляет собой группу заболеваний, связанных с такими непосредственными симптомами, как вздутие, чихание и слезотечение. Оценку заболевания, среди прочего, выполняют путем измерения тяжести специфических симптомов, вызванных воздействием соответствующего аллергена.

КОМПОЗИЦИИ СОГЛАСНО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Согласно первому аспекту настоящего изобретения, предложена композиция для хранения яиц гельминтов, таких как свиной власоглав Trichuris suis, которая дополнительно содержит жидкий носитель, имеющий значение рН ниже 7 при температуре от 0°С до 30°С или от 5°С до температуры окружающей среды.

Жидкий носитель может представлять собой серную кислоту, H₂SO₄, такую как H₂SO₄, имеющая рН ниже 6, такую как H₂SO₄, имеющая рН 0-6, такую как H₂SO₄, имеющая рН 0-5, такую как H₂SO₄, имеющая рН 0-1; такую как H₂SO₄, имеющая рН 1-2; такую как H₂SO₄, имеющая рН 2-3; такую как H₂SO₄, имеющая рН 3-4; такую как H₂SO₄, имеющая рН 4-5; такую как H₂SO₄, имеющая рН 5-6. рН от 0 до 2 является предпочтительным. Можно также применять другие кислотные жидкие носители и добавку антибиотиков.

Согласно одному или более вариантам реализации первого аспекта изобретения, гельминтов можно выбирать из родов нематод, таких как Ascaris, Enterobius, Trichuris, Ancylostoma, Necator и Strongyloides.

Первый аспект изобретения также охватывает вариант реализации, при котором гельминт представляет собой платигельминт. Также в рамках реализации первого аспекта изобретения, если гельминта выбирают из группы, включающей трематоды и цестоды.

В одном или нескольких вариантах реализации первого аспекта настоящего изобретения, гельминта выбирают из рода паразитов Fasciolopsis, Echinostoma, Heterophyes, Clonorchis, Opisthorchis, Fasciola, Schistosoma, Diphyllobothrium, Taenia и Hymenolepsis.

Также в одном варианте реализации первого аспекта настоящего изобретения, гельминта выбирают из группы, включающей филярий и легочных сосальщиков.

Более того, первый аспект изобретения охватывает вариант (варианты) реализации, при которых гельминта выбирают из группы, включающей семейства Heligmosomoides, Hymenolepsis, Angiostrongylus, Ascaris, Toxocara, Gnathostoma, Ancylostoma, Anisakis and Pseudoterranova.

В предпочтительном варианте реализации первого аспекта изобретения, гельминт представляет собой Trichuris suis. Согласно настоящему изобретению, композицию можно получить способом, включающим стадии инфицирования животного, такого как свинья, Т. suis, выделения яиц, содержащихся в фекалиях животных, через соответствующее время, например через примерно 5-30 недель или через примерно 5-11 недель, например, через примерно 7-9 недель после инокуляции, и добавления к выделенным яйцам жидкого носителя, имеющего значение рН ниже 7, в интервале температур от 0°С до 30°С или от 5°С до температуры окружающей среды.

Предпочтительно, чтобы стадия выделения включала процедуру промывания с осуществлением серии промывок с применением сертифицированных сит (таких как, например, сита с размерами ячейки 1000, 500, 250, 100, 80, 70, 60, 50, и 20 мкм) большого диаметра (например, ⌀ 450 мм), причем на следующих промывках применяют сита с меньшим размером ячеек, чем на предыдущих, что позволяет эффективно промыть и отделить яйца от, например, непереваренного растительного материала в фекальных массах. Предпочтительно, чтобы яйца паразитов содержались в просеянной фракции и имели размер частиц от 20 до 50 мкм.

В случае, когда яйца гельминтов принадлежат виду Trichuris suis (TSO), первый аспект изобретения также охватывает вариант реализации, при котором композицию получают способом, включающим стадию извлечения яиц паразитов из червей, выделенных непосредственно из кишечника свиней или из содержимого кишечника, добавления указанных яиц к жидкому носителю, имеющему рН менее 7 в интервале температур от 0°С до 30°С. Согласно настоящему изобретению выделенных червей перед извлечением яиц можно промыть один или несколько раз в среде, возможно содержащей один или несколько антибиотиков. Предпочтительно, чтобы хранить выделенных червей in vitro в питательной среде, возможно, дополненной антибиотиками, в которой выделенные черви откладывают свои яйца. Перед добавлением к указанному жидкому носителю яйца можно отделить от питательной среды путем фильтрации на сите (например, 50 мкм).

СПОСОБЫ СОГЛАСНО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Согласно второму аспекту настоящего изобретения, предложен способ выделения и хранения яиц свиного власоглава Trichuris suis. Способ согласно второму аспекту изобретения включает стадии

a) выделения яиц паразитов либо 1) in vitro, при этом черви, извлеченные из кишечника свиней, откладывают свои яйца в подходящую среду, либо 2) из фекальных масс свиней, в которые черви, присутствующие в кишечнике, откладывают яйца, и

b) хранения выделенных и, возможно, очищенных яиц в кислой среде, такой как, например, H₂SO₄, такой как H₂SO₄, имеющая рН 0-2, или 0-1, или 1-2, обеспечивающей развитие яиц (эмбрионизацию) и инактивацию любых загрязняющих бактерий и вирусов.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предложен способ выделения и хранения яиц свиного власоглава Trichuris suis, который включает стадии

a) выделения яиц паразитов либо 1) in vitro, при этом черви, извлеченные из кишечника свиней, откладывают свои яйца в подходящую среду, либо 2) из фекальных масс свиней, в которые черви, присутствующие в кишечнике откладывают яйца,

b) фильтрования выделенного материала с целью снижения загрязнения частицами и яйцами чужеродных паразитов свиней,

c) флотации выделенного материала с целью снижения загрязнения частицами,

d) промывания выделенного материала в кислой среде, такой как, например, серная кислота, H₂SO₄, такой как H₂SO₄, имеющая рН 0-2, или 0-1, или 1-2, с целью снижения количества чужеродных патогенных микроорганизмов (бактерий, грибов и вирусов) путем как разбавления, так и инактивации,

e) хранения выделенных и очищенных яиц в кислой среде, такой как например H₂SO₄, такой как H₂SO₄, имеющая рН 0-2 или 0-1 или 1-2, обеспечивающей развитие яиц (эмбрионизацию) и дальнейшую инактивацию и предотвращение роста бактерий, грибов и вирусов,

f) фильтрования и флотации яиц с развивающимся эмбрионом с выделением фракции яиц, имеющих самую высокую степень эмбрионизации (биотический потенциал исходного фармацевтического материала), и

g) хранения выделенных яиц с развивающимся эмбрионом в кислой среде, такой как, например H₂SO₄, такой как H₂SO₄, имеющая рН 0-2, или 0-1, или 1-2, которая обеспечивает поддержание биотического потенциала и предотвращение роста патогенных микроорганизмов.

Для способов согласно второму и третьему аспектам изобретения предпочтительно, чтобы кислотная среда, применяемая для хранения яиц, представляла собой жидкий носитель, имеющий значение рН ниже 7. Жидкий носитель может представлять собой серную кислоту H₂SO₄, такую как H₂SO₄, имеющая рН ниже 6, такую как H₂SO₄ имеющая рН 0-6, такую как H₂SO₄, имеющая рН 0-5, такую как H₂SO₄, имеющая рН 0-1; такую как H₂SO₄, имеющая рН 1-2; такую как H₂SO₄, имеющая рН 2-3; такую как H₂SO₄, имеющая рН 3-4; такую как H₂SO₄, имеющая рН 4-5; такую как H₂SO₄, имеющая рН 5-6. Предпочтительным является рН от 0 до 2. Можно также применять другие жидкие носители и добавление антибиотиков.

Что касается способов согласно второму и третьему аспектам изобретения, то указанные способы также охватывают варианты реализации, дополнительно включающие стадию, на которой яйца, хранящиеся в кислой среде, развиваются из яиц, не содержащих эмбрионы (содержащих недифференцированные клетки) в яйца с развивающимися эмбрионами (содержащие стадии инвазионных личинок), в результате чего получают суспензии яиц с развивающимися эмбрионами в кислой среде. Если кислая среда, содержащая яйцо с развивающимся эмбрионом, представляет собой H₂SO₄, имеющую рН в диапазоне 0-2, то появляется возможность ввести суспензию пероральным способом.

Для способа согласно третьему аспекту изобретения, в соответствии с одним вариантом реализации стадия b) является необязательной. Также в рамках реализации третьего аспекта изобретения стадия с) является необязательной. Третий аспект изобретения также охватывает варианты реализации, в которых стадия d) является необязательной и/или в которых стадия f) является необязательной.

Согласно четвертому аспекту изобретения, предложен способ производства фармацевтической композиции, содержащей препарат гельминтов, включающий стадии:

(1) выращивания животного для получения препарата в особой среде, не содержащей патогенов человека;

(2) получения первого изолята гельминта из указанного животного для получения препарата;

(3) извлечения яиц из указанного первого изолята гельминта, in vitro или из фекальных культур;

(4) хранения яиц с развивающимся эмбрионом, извлеченных из указанного первого изолята гельминта, в композиции, содержащей дополнительно жидкий кислый носитель; и

(5) эмбрионизации яиц, извлеченных из указанного изолята гельминта, в подходящих условиях в указанном кислом жидком носителе с получением фармацевтической композиции.

В рамках одного варианта реализации четвертого аспекта изобретения, способ дополнительно включает стадию:

(6) хранения яиц с развивающимся эмбрионом, извлеченных из указанного изолята гельминта, в подходящих условиях в кислом жидком носителе.

Кроме того, для четвертого аспекта изобретения предпочтительно, чтобы кислый жидкий носитель имел значение рН ниже 7. Жидкий кислый носитель может представлять собой серную кислоту, H₂SO₄, такую как H₂SO₄, имеющая рН ниже 6, такую как H₂SO₄, имеющая рН 0-6, такую как H₂SO₄, имеющая рН 0-5, такую как H₂SO₄, имеющая рН 0-1; такую как H₂SO₄, имеющая рН 1 -2; такую как H₂SO₄, имеющая рН 2-3; такую как H₂SO₄, имеющая рН 3-4; такую как H₂SO₄, имеющая рН 4-5; такую как H₂SO₄, имеющая рН 5-6. Предпочтительным является рН от 0 до 2. Можно также применять другие жидкие носители и добавление антибиотиков.

В рамках одного из вариантов реализации четвертого аспекта изобретения, стадия выделения гельминта включает получение стула от животного для получения препарата и выделение гельминта из указанного стула. В этом случае стадия выделения гельминта может включать извлечение ткани из указанного животного для получения препарата и выделение гельминта или его яиц из указанной ткани. В предпочтительном случае ткань может представлять собой внутренний орган, такой как кишечник. Также предпочтительно, чтобы стадия выделения указанного гельминта дополнительно включала стадии:

(1) иссечения ткани указанного животного для получения препарата, в результате которого получают макроскопический препарат червей, из которого получают культуру червей, в которой черви откладывают яйца,

(2) фильтрования глистной культуры с получением фильтрата с яйцами;

и

(3) выделения яиц из указанного фильтрата, обеспечивающего извлечение яиц из указанного первого изолята гельминта.

Согласно одному варианту реализации четвертого аспекта изобретения, препарат гельминта может содержать паразита, который представляет собой нематоду.

Четвертый аспект изобретения также охватывает один или более вариантов реализации, в которых препарат гельминта содержит паразита, выбранного из группы, включающей род Ascaris, Enterobius, Trichuris, Ancylostoma, Necator, Strongyloides.

Также в рамках реализации четвертого аспекта изобретения, препарат гельминта содержит паразита, который является платигельминтом. Также в рамках реализации четвертого аспекта изобретения, препарат гельминта содержит паразита, выбранного из группы, включающей трематоды и цестоды.

В рамках одного или нескольких вариантов реализации четвертого аспекта изобретения, препарат гельминта содержит паразита, выбранного из группы, включающей семейства Fasciolopsis, Echinostoma, Heterophyes, Clonorchis, Opisthorchis, Fasciola, Schistosoma, Diphyllobothrium, Taenia и Hymenolepsis. Также в рамках варианта реализации четвертого аспекта изобретения находится случай, когда препарат гельминта содержит паразита, выбранного из группы, включающей филярий и легочных сосальщиков.

Кроме того, четвертый аспект изобретения охватывает вариант (варианты) реализации, в которых препарат гельминта содержит паразита, выбранного из группы, включающей род Trichuris, Nippostrongylus, Heligmosomoides, Hymenolepsis, Angiostrongylus, Ascaris, Toxocara, Gnathostoma, Ancylostoma, Anisakis и Pseudoterranova.

В предпочтительном варианте реализации четвертого аспекта изобретения, гельминт представляет собой Trichuris suis.

Согласно пятому аспекту настоящего изобретения, предложен способ профилактического, облегчающего или излечивающего лечения аутоиммунного или аллергического заболевания у конкретного человека или животного, который включает стадии получения композиции согласно варианту реализации, выбранному из любого из вариантов реализации первого аспекта изобретения, выделения гельминтных червей из кишечника, инкубации выделенных червей в подходящих условиях роста, при которых они будут откладывать яйца, отделения яиц от среды или выделения яиц из содержимого кишечника, переноса яиц в кислый жидкий носитель, с получением суспензии яиц гельминтов, смешивания яиц с фармацевтически приемлемым носителем с получением фармацевтической композиции и введения указанной фармацевтической композиции в фармацевтически эффективном количестве пациенту, человеку или животному, страдающему аутоиммунным или аллергическим заболеванием, или с целью предотвращения возникновения указанных заболеваний.

Согласно шестому аспекту настоящего изобретения, предложен способ лечения аутоиммунного или аллергического заболевания у конкретного человека или животного, который включает стадии получения композиции согласно варианту реализации, выбранному из любых вариантов реализации первого аспекта изобретения, эмбрионизации яиц гельминта в подходящих условиях в кислом жидком носителе, с получением фармацевтической композиции, и введения указанной фармацевтической композиции в фармацевтически эффективном количестве конкретному человеку или животному, страдающему аутоиммунным или аллергическим заболеванием, или с целью предотвращения возникновения указанного заболевания.

Согласно реализации пятого или шестого аспекта изобретения, аутоиммунное заболевание может представлять собой воспалительное заболевание кишечника. Воспалительное заболевание кишечника может представлять собой болезнь Крона (БК) или язвенный колит (ЯК).

Также в рамках реализации пятого или шестого аспекта изобретения, аутоиммунное заболевание может представлять собой ревматоидный артрит.

Согласно одному из вариантов реализации пятого или шестого аспекта изобретения, аутоиммунное заболевание может представлять собой красную волчанку.

Также в рамках реализации пятого или шестого аспекта изобретения, аутоиммунное заболевание может представлять собой сахарный диабет 1 типа.

Также в рамках реализации пятого или шестого аспекта изобретения, аутоиммунное заболевание может представлять собой саркоидоз. Пятый или шестой аспект изобретения также охватывает вариант реализации, в котором аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз.

Также в рамках реализации пятого или шестого аспекта изобретения, аутоиммунное заболевание может представлять собой псориаз, или аутоиммунное заболевание может представлять собой аутизм.

Согласно варианту реализации пятого или шестого аспекта изобретения заболевание может представлять собой аллергию.

Согласно седьмому аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения избыточного иммунного ответа у человека или животного, который включает стадии получения композиции согласно варианту реализации, выбранному из любых вариантов реализации первого аспекта изобретения, эмбрионизации яиц гельминта в подходящих условиях в кислом жидком носителе с получением фармацевтической композиции и введения указанной фармацевтической композиции в количестве, эффективном для снижения избыточного иммунного ответа у пациента, человека или животного. Согласно настоящему изобретению избыточный иммунный ответ может представлять собой усиленный иммунный ответ Th1.

Согласно восьмому аспекту настоящего изобретения предложен способ увеличения срока выживания аллотрансплантата органа у пациента, человека или животного, который включает подавление иммунной активности Th1 у человека или животного путем фармацевтической композиции, обладающей стимулирующей активностью в отношении Th2, в количестве, эффективном для активации Th2, при этом способ включает стадии получения композиции согласно варианту реализации, выбранному из любых вариантов реализации первого аспекта изобретения, эмбрионизации яиц гельминтов в подходящих условиях в кислом жидком носителе с получением фармацевтической композиции, обладающей стимулирующей активностью в отношении Th2, и введения указанной фармацевтической композиции в количестве, эффективном для увеличения срока выживания аллотрансплантата органа у человека или животного за счет подавления активности Th1 у этого пациента.

Также в рамках реализации восьмого аспекта изобретения, указанное лечение может являться облегчающим, профилактическим или излечивающим лечением.

В рамках варианта реализации пятого, шестого, седьмого или восьмого аспекта изобретения, пациент представляет собой млекопитающее, такое как человек или домашнее животное.

Согласно девятому аспекту настоящего изобретения, предложено применение композиции согласно любому из вариантов реализации первого аспекта изобретения, в изготовлении лекарственного препарата или фармацевтической композиции для лечения аутоиммунного или аллергического заболевания у человека или животного, которые нуждаются в указанном лечении. В данном случае аутоиммунное заболевание может представлять собой воспалительное заболевание кишечника. Воспалительное заболевание кишечника может представлять собой болезнь Крона (БК) или язвенный колит (ЯК).

Согласно одному варианту реализации девятого аспекта изобретения, аутоиммунное заболевание может представлять собой ревматоидный артрит.

Девятый аспект изобретения также охватывает вариант реализации, в котором аутоиммунное заболевание представляет собой красную волчанку.

В одном из вариантов реализации девятого аспекта изобретения, аутоиммунное заболевание может представлять собой сахарный диабет 1 типа. Кроме того, девятый аспект изобретения охватывает вариант реализации, в котором аутоиммунное заболевание представляет собой саркоидоз, и вариант реализации, в котором аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз.

Также в рамках варианта реализации девятого аспекта изобретения, аутоиммунное заболевание может представлять собой псориаз или аутоиммунное заболевание может представлять собой аутизм.

Согласно еще одному варианту реализации девятого аспекта изобретения аутоиммунное заболевание может представлять собой аллергию.

Также в рамках варианта реализации девятого аспекта изобретения, промышленное производство лекарственного препарата включает способ, выбранный из любых вариантов реализации четвертого аспекта изобретения.

Согласно десятому аспекту настоящего изобретения, предложено применение композиции согласно любому варианту реализации первого аспекта изобретения, в изготовлении лекарственного препарата или фармацевтической композиции для лечения избыточного иммунного ответа человека или животного, которые нуждаются в указанном лечении. В данном случае, избыточный иммунный ответ может представлять собой усиленный ответ Th1.

В рамках варианта реализации девятого или десятого аспекта изобретения, указанное лечение является облегчающим, профилактическим или излечивающим лечением. Также в рамках варианта реализации девятого или десятого аспекта изобретения, пациент представляет собой млекопитающее, такое как человек или домашнее животное.

Дополнительные особенности и преимущества изобретения станут более очевидными при рассмотрении чертежей и описания предпочтительных вариантов реализации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой схему, иллюстрирующую способ выделения яиц паразита из фекалий (отложенных кишечными червями in situ) или из червей в культуре (отложенных выделенными червями in vitro), полученных из свиней, инфицированных власоглавом Trichuris suis согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения,

Фиг.2 представляет собой схему, иллюстрирующую способ снижения загрязнения частицами и удаления яиц чужеродных паразитов в суспензии яиц свиного власоглава Trichuris suis согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения,

Фиг.3 представляет собой схему, иллюстрирующую способ эмбрионизации, хранения и подготовки яиц свиного власоглава Trichuris suis, применяемых в качестве исходного материала для фармацевтического препарата для перорального введения согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, и

Фиг.4 иллюстрирует жизненный цикл свиного власоглава Trichuris suis.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже (стадии 1-9) дано подробное описание вариантов реализации настоящего изобретения. Указанные варианты реализации охватывают извлечение яиц паразита (1, 2), уменьшение загрязнения частицами (3, 4), удаление яиц чужеродных паразитов (5), промывание в кислой среде (6), эмбрионизацию яиц паразита (7), хранение яиц паразита (8) и введение суспензии из яиц паразита (9).

1. Извлечение яиц паразита из фекалий (черви in situ)

Свиньи, инфицированные обычным кишечным червем T. suis, будут выделять яйца паразитов с фекалиями приблизительно через 7-9 недель после заражения. Эти яйца можно в больших количествах собрать из фекалий. Процесс выделения яиц основан на процедуре промывки на серии сертифицированных стальных сит (например, с размерами ячеек 1000, 500, 250, 100, 80, 70, 60, 50 и 20 мкм) большого диаметра (например, ⌀ 450 мм). Процедура многократных промывок на ситах с уменьшающимися размерами ячеек позволяет эффективно отмыть яйца от непереваренных растительных волокон, содержащихся в фекальных массах. Яйца паразитов содержатся в просеянной фракции с размером частиц 20-50 мкм. Фракцию 20-50 мкм повторно суспендируют в H₂SO₄ (например, при рН 0-2), затем добавляют антибиотики, чтобы минимизировать рост патогенных микроорганизмов, и затем обрабатывают на стадиях 3 и/или 4, описанных ниже.

2. Извлечение яиц паразитов из червей (черви in vitro)

В качестве альтернативы, яйца можно извлечь в меньших количествах из червей, которые получают непосредственно из кишечника свиней. После многократной промывки в среде с антибиотиками червей содержат in vitro в питательной среде с антибиотиками или другими консервантами, в которой они откладывают свои яйца. Яйца отделяют от среды путем фильтрации на 50-мкм сите с последующей фильтрацией на 20-мкм сите. Образовавшуюся 20-50 мкм фракцию обрабатывают затем на стадиях 3 и/или 4, описанных ниже.

3. Снижение загрязнения частицами с помощью флотации

Суспензии яиц, полученные на стадии 1 и/или стадии 2, составляют исходный материал для дальнейшего снижения содержания нежелательных частиц. В этих суспензиях все частицы имеют размер между 20 и 50 мкм, но яйца имеют более низкую плотность, чем большинство других частиц (растительных волокон и минеральных частиц). Поэтому яйца можно флотировать на поверхности флотационных потоков с удельной массой более 1.18 г на мл, таких как насыщенная суспензия соли и сахара, таких как хлорид натрия - глюкоза, или яйца можно флотировать на поверхности растворов сульфата магния или хлорида цинка. При центрифугировании яйца будут всплывать на поверхность, а инородные вещества оседать. Плавающие на поверхности яйца выделяют, промывают на 20 мкм сите и повторно суспендируют в H₂SO₄ (например, при рН 0-2).

4. Снижение загрязнения частицами путем фильтрации

Суспензии яиц, полученные на стадиях 1, 2 и/или 3, содержащие частицы с размером в диапазоне 20-50 мкм, очищают далее посредством фильтрации в одноразовой нейлоновой сетке с сертифицированным размером ячейки 30-35 мкм, извлекая яйца на 20-25 мкм нейлоновой сетке.

5. Удаление яиц чужеродных паразитов путем фильтрации

Фильтрация суспензии при размере ячеек 30-35 мкм гарантирует удерживание яиц чужеродных паразитов, которые, возможно, находились в исходном растворе фекалий, задержатся. Хотя яйца Trichuris suis достигают до 80 мкм в длину, их ширина составляет лишь примерно 23-30-мкм в ширину, они являются тонкими и имеют форму лимона, и будут ориентироваться в продольном направлении потока раствора, который проходит через сито. Так, эксперименты показали, что яйца T. suis будут проходить через 30 мкм сито. Другие яйца, которыми могут быть инфицированы свиньи, проходить через такое сито не будут: Ascaris suum (50-84 мкм), Metastrongylus (38-64 мкм), Strongyloides (30-57 мкм), Globocephalus (40-72 мкм), Oesophagostomum (38-83 мкм), Hyostrongylus (31-76 мкм), Macracanthorhynchus (65-110 мкм). Яйца обычного круглого червя, заражающие собак и кошек, Toxocara (75-90 мкм) также будут задержаны.

6. Промывка и инактивация патогенных микроорганизмов с помощью H₂SO₄ (например, при рН 0-2)

После фильтрации суспензию многократно промывают в H₂SO₄ (например, при рН 0-2), с целью снижения содержания любых патогенов и их спор путем разбавления. Дальнейший рост патогенов предотвращают с помощью H₂SO₄ (например, при рН 0-2).

7. Эмбрионизация яйца Trichuris suis (TSO) в H₂SO₄ (например, при рН 0-2)

Суспензию хранят в инкубаторе при температурах 15-30°С, чтобы яйца, не содержащие эмбрионы превратились в яйца с развивающимися эмбрионами. Этот процесс, эмбрионизация, занимает 2-6 месяцев в зависимости от температуры инкубации.

8. Хранение яиц Trichuris suis (TSO) в H₂SO₄ (например, при рН 0-2)

После эмбрионизации исходный фармацевтический материал можно хранить до нескольких лет при температуре в диапазоне 1-10°С, без изменения инвазионной способности. При таком хранении личинка внутри яйца будет сохранять инфекционную способность в течение этого периода. Кислота будет препятствовать росту патогенных микроорганизмов.

9. Пероральное введение суспензии яиц (TSO) в H₂SO₄ (например, при рН 0-2)

Суспензию, содержащую яйца гельминтов с развивающимся эмбрионом (с заразной личинкой), можно ввести непосредственно пациенту (человеку или животному) в виде пероральной суспензии в капсулах или другими способами.

Способы и/или варианты реализации, касающиеся настоящего изобретения, описаны также в схемах, показанных на фиг.1-3.

Фиг.1 представляет собой схему, иллюстрирующую способы выделения яиц паразита из фекалий (черви in situ) или кишечных червей (черви in vitro) у свиней, инфицированных власоглавом Trichuris suis согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения.

На фиг.1 исходной точкой является инокуляция свиней материалом паразитов 101. Затем, чтобы извлечь яйца паразитов, можно следовать двум способам. Первый способ на фиг.1 соответствует стадии 2, описанной выше, и включает стадии: удаления кишечника 102а; сбора червей 103а; промывания червей 104а; извлечения in vitro яиц в среду, применяемую для культивирования червей 105а; фильтрования и повторного суспендирования яиц в серной кислоте (H₂SO₄) с целью минимизации роста бактерий 106а; и получения исходного материала для снижения загрязнения частицами 107. Второй способ на фиг.1 соответствует стадии 1, рассмотренной выше, и включает стадии: сбора фекальных масс 102b; суспендирования и просеивания фекальных масс 103b; извлечения просеянной фракции 104b; выделения in vitro яиц из фекальных масс 105b; фильтрования и повторного суспендирования яиц в серной кислоте (H₂SO₄) с целью минимизации роста бактерий 106b; и получения исходного материала для снижения загрязнения частицами 107.

Фиг.2 представляет собой схему, иллюстрирующую способ снижения загрязнения частицами и удаления яиц чужеродных паразитов из суспензии яиц свиного власоглава Trichuris suis согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения.

Этот способ, описанный на схеме на фиг.2, соответствует стадиям 3-6, обсуждавшимся выше. Отправной точкой является исходный материал из яиц, извлеченных из червей или фекалий согласно стадии 107 на фиг.1. Способ, проиллюстрированный на фиг.2, включает также стадии: просеивания и повторного суспендирования яиц в сахарно-солевой флотационной жидкости 201; центрифугирования и выделения плавающих на поверхности яиц 202; отбрасывания осадка с чужеродными частицами с плотностью большей, чем плотность сахарно-солевой флотационной жидкости 203; повторного суспендирования плавающих на поверхности яиц в серной кислоте H₂SO₄ 204; фильтрования суспензии яиц через нейлоновую сетку с размером ячеек 30-50 микрометров 205, с последующим удалением частиц и яиц чужеродных паразитов с размером больше 30 микрометров; фильтрования суспензии яиц на нейлоновой сетке с размером ячеек 20 микрометров, что позволяет удалить частицы меньше 20 микрометров 206; многократного промывания в серной кислоте 207 с целью снижения содержания патогенов путем разбавления; регулирования концентрации яиц в растворе 208; и хранения яиц в серной кислоте 209, в результате чего получают исходный материал для эмбрионизации яиц.

Фиг.3 представляет собой схему, иллюстрирующую способ эмбрионизации, хранения и подготовки яиц свиного власоглава Trichuris suis, применяемых в качестве исходного материала для фармацевтического препарата для перорального введения согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения. Способ, показанный в схеме на фиг.3, соответствует стадиям 7-9, описанным выше. Отправной точкой является исходный материал из яиц, очищенных путем флотации и на стадии просеивания 209 (фиг.2). Кроме того, этот способ, проиллюстрированный на фиг.3, включает стадии: эмбрионизации яиц в серной кислоте при 15-30°С в течение 2-6 месяцев при многократном перемешивании или встряхивании 301 и непрерывном наблюдении за развитием недифференцированных яиц в яйца, содержащие личинку (эмбрионизация) 302; эмбрионизации позволяют протекать до тех пор, пока коэффициент эмбрионизации не составит 60-90% или выше 90% 303; промывания яиц при 2-10°С в серной кислоте H₂SO₄ 304; регулирование концентрации яиц в растворе для хранения яиц в большом объеме 305; хранения яиц при 1-10°С в серной кислоте (H₂SO₄), в которую со временем добавляют антибиотики, что позволяет предотвратить рост патогенных микроорганизмов 306; регулирования концентрации яиц в растворе в соответствии с требованиями, предъявляемыми к исходному фармацевтическому материалу 307, после чего может следовать приготовление стандартизованной суспензии; дозу раствора с яйцами могут помещать в контейнеры для перевозки 308, после чего могут следовать упаковка и маркировка, контроль, выпуск и распределение.

Фиг.4 иллюстрирует жизненный цикл свиного власоглава Trichuris suis. Зрелых червей находят в толстой кишке свиньи 402 и на ее стенках 401. Яйца червя можно получить двумя способами: 1) червей переносят в чашку для культивирования, где их инкубируют в среде 403, в которой они откладывают яйца, или 2) яйца извлекают непосредственно из фекалий путем просеивания фекальных масс. Яйца, полученные способами 1) или 2), не содержат эмбрионов 404 и содержат недифференцированный материал. После хранения в кислой среде, в которую со временем добавляют антибиотики, в течение 2-6 месяцев, в яйцах развивается эмбрион 405 с четко видимой внутри структурой личинки. Именно эти яйца с развивающимся эмбрионом составляют активное фармацевтическое вещество для перорального введения, яйца Trichuris suis (TSO).

Специалистам в данной области будут очевидны другие варианты реализации. Следует иметь в виду, что предшествующее подробное описание дано только для ясности и является чисто иллюстративным. Идея и объем настоящего изобретения не ограничены указанными примерами, но отражены в приведенной ниже формуле изобретения.

Группа изобретений относится к области фармацевтики. Композиция для лечения, облегчения, профилактики или излечения аутоиммунного или аллергического заболевания у животного или человека содержит эффективное количество яиц Trichuris suis и жидкий носитель. Жидкий носитель представляет собой серную кислоту, Н₂SO₄, имеющую значение рН ниже 6 при температуре в диапазоне от 0 до 30°С. Группа изобретений также включает способы выделения, эмбрионизации и сохранения яиц гельминтов, в частности свиного власоглава. Группа изобретений позволяет значительно упростить весь процесс обработки и хранения выделенных яиц, сократить число операций, уменьшить расходы на приобретение необходимых реагентов и дополнительную промывку, обеспечить возможность получения исходного материала для фармацевтической композиции - эмбрионизированных яиц Trichuris suis - и сохранения указанного материала в течение длительного времени без потери инвазионной способности. 7 н. и 36 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Композиция для получения фармацевтической композиции для лечения, облегчения, профилактики или излечения аутоиммунного или аллергического заболевания у субъекта, представляющего собой животное или человека, содержащая эффективное количество яиц Trichuris suis и жидкий носитель, представляющий собой серную кислоту, Н₂SO₄, имеющую значение рН ниже 6 при температуре в диапазоне от 0 до 30°С.

2. Способ выделения и хранения яиц свиного власоглава Trichuris suis, включающий стадии:
a) выделения яиц паразитов способом 1), включающим стадии выделения яиц из червей, которых извлекли из кишечника свиней и вырастили в питательной среде, подходящей для такого роста, причем указанные черви откладывают свои яйца в указанной подходящей питательной среде, или способом 2), включающим стадии применения свиньи, инфицированной Trichuris suis, или инфицирования свиньи Trichuris suis, и выделения яиц из фекальных масс, полученных от указанной свиньи, и
b) хранения выделенных и, возможно, очищенных яиц в серной кислоте, H₂SO₄, имеющей значение рН ниже 6, для инактивации любых загрязняющих бактерий, грибов и вирусов; и
c) эмбрионизации яиц Trichuris suis путем хранения композиции яиц и серной кислоты в инкубаторе при температуре 15-30°С в течение 2-6 месяцев для развития яиц из неэмбрионизированных в эмбрионизированные.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что на стадии с) эмбрионизацию яиц Trichuris suis продолжают до достижения значения коэффициента эмбрионизации (процент недифференцированных яиц, для которых произошло развитие в яйца, содержащие личинки), превышающего 60%.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в процессе эмбрионизации яиц Trichuris suis непрерывно наблюдают за развитием недифференцированных яиц в яйца, содержащие личинки, для определения, таким образом, коэффициента эмбрионизации.

5. Способ по любому из пп.2-4, дополнительно включающий стадию хранения полученной эмбрионизированной композиции при температуре в диапазоне от 1 до 10°С.

6. Способ выделения и хранения яиц свиного власоглава Trichuris suis, включающий стадии:
a) выделения яиц паразита способом 1), включающим стадии выделения яиц из червей, которых извлекли из кишечника свиней и вырастили в питательной среде, подходящей для такого выращивания, причем указанные черви откладывают свои яйца в указанной подходящей питательной среде, или способом 2), включающим стадии применения свиньи, инфицированной Trichuris suis, или инфицирования свиньи Trichuris suis, и выделения яиц из фекальных масс, полученных от указанной свиньи, и
b) хранения выделенных яиц в серной кислоте, Н₂SO₄, имеющей рН ниже 6 для инактивации любых бактерий, грибов и/или вирусов, в случае их присутствия,
c) эмбрионизации яиц Trichuris suis путем хранения композиции яиц и серной кислоты в инкубаторе при температуре 15-30°С в течение 2-6 месяцев для развития яиц из неэмбрионизированных в эмбрионизированные; и
d) фильтрования и флотации эмбрионизированных яиц для выделения фракции яиц, которые имеют самую высокую степень эмбрионизации, и
e) хранения выделенных и эмбрионизированных яиц в серной кислоте, H₂SO₄, имеющей рН ниже 6, с обеспечением, таким образом, поддержания биотического потенциала и предотвращения роста патогенных микроорганизмов.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что на стадии с) эмбрионизацию яиц Trichuris suis продолжают до достижения значения коэффициента эмбрионизации (процент недифференцированных яиц, развившихся в яйца, содержащие личинки), превышающего 60%.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что в процессе эмбрионизации яиц Trichuris suis непрерывно наблюдают за развитием недифференцированных яиц в яйца, содержащие личинки, для определения, таким образом, коэффициента эмбрионизации.

9. Способ по любому из пп.6-8, отличающийся тем, что на стадии е) композицию эмбрионизированных яиц и серной кислоты хранят при температуре в диапазоне от 1 до 10°С.

10. Способ получения фармацевтической композиции, содержащей препарат Trichuris suis, включающий стадии:
(1) выращивания животного для получения препарата в конкретной среде, не содержащей патогенов человека;
(2) получения изолята Trichuris suis от указанного животного для получения препарата;
(3) извлечения яиц из указанного изолята Trichuris suis;
(4) хранения неэмбрионизированных яиц из указанного изолята Trichuris suis в композиции, дополнительно содержащей кислый жидкий носитель, представляющий собой серную кислоту, Н₂SO₄, имеющую рН ниже 6;
(5) эмбрионизации яиц из указанного изолята Trichuris suis путем хранения композиции яиц и серной кислоты в инкубаторе при температуре от 15 до 30°С в течение 2-6 месяцев для развития яиц из неэмбрионизированных в эмбрионизированные с получением фармацевтической композиции; и
(6) хранения эмбрионизированных яиц из указанного изолята Trichuris suis в подходящих условиях в указанном кислом жидком носителе.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что на стадии (5) эмбрионизацию яиц Trichuris suis продолжают до достижения значения коэффициента эмбрионизации (процент недифференцированных яиц, для которых произошло развитие в яйца, содержащие личинки), превышающего 60%.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в процессе эмбрионизации яиц Trichuris suis непрерывно наблюдают за развитием недифференцированных яиц в яйца, содержащие личинки, для определения, таким образом, коэффициента эмбрионизации.

13. Способ по любому из пп.10-12, отличающийся тем, что на стадии (6) эмбрионизированные яйца хранят в указанном кислом жидком носителе при температуре в диапазоне от 1 до 10°С.

14. Способ по п.10, отличающийся тем, что стадия выделения Trichuris suis включает получение стула от указанного животного, предназначенного для получения препарата, и выделение Trichuris suis из указанного стула.

15. Способ по п.10, отличающийся тем, что стадия выделения Thchuris suis включает забор ткани от указанного животного, предназначенного для получения препарата, и выделение Trichuris suis или его яиц из указанной ткани.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанная ткань представляет собой кишечник.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что стадия выделения Trichuris suis дополнительно включает стадии:
(1) иссечения ткани указанного животного, предназначенного для получения препарата, с обеспечением макроскопического выделения червей с получением культуры червей, при этом указанные черви откладывают яйца,
(2) фильтрования культуры червей с получением фильтрата с яйцами; и
(3) выделения яиц из указанного фильтрата и, тем самым, извлечения яиц из указанного изолята Trichuris suis.

18. Способ лечения аутоиммунного или аллергического заболевания у субъекта, представляющего собой человека или животное, включающий стадии обеспечения композиции, содержащей яйца от Trichuris suis и жидкий носитель, представляющий собой серную кислоту, H₂SO₄, имеющую значение рН ниже 6 при температуре в диапазоне от 0 до 30°С, эмбрионизации яиц Trichuris suis путем хранения указанной суспензии в инкубаторе при температуре от 15 до 30°С в течение 2-6 месяцев для развития яиц из неэмбрионизированных в эмбрионизированные с получением, таким образом, фармацевтической композиции и введения указанной фармацевтической композиции в фармацевтически эффективном количестве субъекту, страдающему аутоиммунным или аллергическим заболеванием, или для предотвращения возникновения указанных заболеваний.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что эмбрионизацию яиц Trichuris suis продолжают до достижения значения коэффициента эмбрионизации (процент недифференцированных яиц, для которых произошло развитие в яйца, содержащие личинки), превышающего 60%.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что в процессе эмбрионизации Trichuris suis непрерывно наблюдают за развитием недифференцированных яиц в яйца, содержащие личинки, для определения, таким образом, коэффициента эмбрионизации.

21. Способ по любому из пп.18-20, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию, полученную в процессе эмбрионизации, хранят в указанном кислом жидком носителе при температурах в диапазоне от 1 до 10°С.

22. Способ по п.18, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника.

23. Способ по п.18, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит.

24. Способ по п.18, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой сахарный диабет 1 типа.

25. Способ по п.18, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой красную волчанку.

26. Способ по п.18, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой саркоидоз.

27. Способ по п.18, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз.

28. Способ по п.18, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой псориаз.

29. Способ по п.18, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой аутизм.

30. Способ по п.18, отличающийся тем, что заболевание представляет собой аллергию.

31. Способ по любому из пп.18-20 или 22-30, отличающийся тем, что указанное лечение является облегчающим, профилактическим или излечивающим.

32. Способ по любому из пп.18-20 или 22-30, отличающийся тем, что субъект является человеком.

33. Способ лечения избыточного иммунного ответа у субъекта, включающий стадии получения композиции, содержащей яйца от Trichuris suis и жидкий носитель, представляющий собой серную кислоту, Н₂SO₄, имеющую значение рН ниже 6 при температуре в диапазоне от 0 до 30°С, эмбрионизации яиц Trichuris suis путем хранения указанной суспензии в инкубаторе при температурах от 15 до 30°С в течение 2-6 месяцев для развития яиц из неэмбрионизированных в эмбрионизированные с получением, таким образом, фармацевтической композиции и введения субъекту указанной фармацевтической композиции в количестве, эффективном для снижения избыточного иммунного ответа у субъекта.

34. Способ по п.33, отличающийся тем, что эмбрионизацию яиц Trichuris suis продолжают до достижения значения коэффициента эмбрионизации (процент недифференцированных яиц, для которых произошло развитие в яйца, содержащие личинки), превышающего 60%.

35. Способ по п.34, отличающийся тем, что в процессе эмбрионизации яиц Trichuris suis непрерывно наблюдают за развитием недифференцированных яиц в яйца, содержащие личинки, для определения, таким образом, коэффициента эмбрионизации.

36. Способ по любому из пп.33-35, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию, полученную путем процесса эмбрионизации, хранят в указанном кислом жидком носителе при температурах в диапазоне от 1 до 10°С.

37. Способ по п.33, отличающийся тем, что избыточный иммунный ответ представляет собой усиленный иммунный ответ Тh1.

38. Способ по любому из пп.33-35 или 37, отличающийся тем, что указанное лечение является облегчающим, профилактическим или излечивающим.

39. Способ по любому из пп.33-35 или 37, отличающийся тем, что субъект является человеком.

40. Способ увеличения срока жизни аллотрансплантата органа у субъекта, включающий понижающую регуляцию иммунной активности Th1 у субъекта путем введения субъекту эффективного для повышающей регуляции Th2 количества фармацевтической композиции, обладающей активностью в отношении повышающей регуляции Th2, при этом указанный способ включает дополнительные стадии обеспечения композиции, содержащей яйца от Trichuris suis и жидкий носитель, представляющий собой серную кислоту, Н₂SO₄, имеющую значение рН ниже 6 при температуре в диапазоне от 0 до 30°С, эмбрионизацию яиц Trichuris suis путем хранения указанной суспензии в инкубаторе при температурах от 15 до 30°С в течение 2-6 месяцев для развития яиц из неэмбрионизированных в эмбрионизированные с получением, таким образом, фармацевтической композиции, обладающей активностью в отношении повышающей регуляции Th2, и введение указанной фармацевтической композиции в количестве, достаточном для увеличения срока жизни аллотрансплантата органа у субъекта посредством понижающей регуляции активности Тh1 у субъекта.

41. Способ по п.40, отличающийся тем, что эмбрионизацию яиц Trichuris suis продолжают до достижения значения коэффициента эмбрионизации (процент недифференцированных яиц, для которых произошло развитие в яйца, содержащие личинки), превышающего 60%.

42. Способ по п.41, отличающийся тем, что в процессе эмбрионизации яиц Trichuris suis непрерывно наблюдают за развитием недифференцированных яиц в яйца, содержащие личинки, для определения, таким образом, коэффициента эмбрионизации.

43. Способ по любому из пп.40-42, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию, полученную путем процесса эмбрионизации, хранят в указанном кислом жидком носителе при температурах в диапазоне от 1 до 10°С.