Штамм респираторного коронавируса свиней для изготовления вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 

(Л

С

Использование: ветеринария, вирусология, разработка средств специфической профилактики против трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Сущность изобретения: изолирован штамм респираторного коронавируса свиней, который прошел необходимый тест контрольных испытаний, чтобы называться вакцинным штаммом CAPM-V355 респираторного коронавируса свиней. Вакцинный штамм CAPM-V355 стабильно накапливается в высоких титрах в культуре клеток и обладает выраженными иммуногенными свойствами. Данный штамм апробирован с положительным результатом в лабораторных условиях. 6 табл.

Цель изобретения - специфическая профилактика трансмиссивного гастроэнтерита (ТГС) при помощи природно-аттену- ированного штамма респираторного коронавируса свиней (РКС).

В 1987 г из бронхоальвеолярной ткани здоровой свиньи был изолирован цитопати- ческий агент, который в дальнейшем был идентифицирован как РКС, имеющий тесное антигенное родство с вирусом ТГС. Дан- ный штамм прошел 50 пассажей в пермиссивной ткани линии клеток почки свиньи (линия СПЭВ). В результате был получен модифицированный вариант вируса, который прошел необходимый тест контрольных испытаний, чтобы называться атте- нуированным штаммом РКС, обозначенным ЛУК.

Штамм депонирован под номером CAPM-V355.

Предложенный штамм обладает следующими свойствами. Величина вирионов 90-130 нм. Вирусные частицы имеют сферическую форму и характерную для коронави- русов ультраструктуру с отходящими от тела вириона пепломерами Плавучая плотность в градиенте сахарозы 1,19-1,21 г/см3.

Штамм чувствителем к эфиру и хлороформу, умеренно чувствителен к трипсину. Прогревание при 60°С в течение 120 мин приводит к инактивации культурального вируса. Замораживание при -20°С и оттаивание снижаеттитр инфекционной активности в культуре клеток Фоточувствителен.

Штамм не агглютинирует эритроциты морской свинки, крупного рогатого скота, свиней и птиц

Размножается с развитием цитопатиче- ского действия в пермиссивных линиях почки и щитовидной железы свиньи (СПЭВ,

00 00

to

ППС и ЩС), достигая инфекционного титра 108-1010ТЦД50/мл.

Рассматриваемый штамм респираторного коронавируса свиней индуцирует синтез вируснейтрализующих антител к вирусу ТГС в организме свиней и морских свинок.

Антигенные свойства САРМ - V355 респираторного коронавируса свиней (п 5) приведены в табл. 1.

Антигенное родство с вирусом ТГС изучали при помощи перекрестной реакции нейтрализации.

Антигенное родство штамма САРМ - V355 РКС и штамма ТМК ТГС в реакции нейтрализации приведено втабл, 2.

Приведенные данные свидетельствуют о тесном антигенном родстве штамма САРМ - V355 респираторного коронавируса свиней и штамма ТМК вируса ТГС.

Реактогенные свойства штамма САРМ - V355 и патогенность штамма САРМ -V355 для естественно-восприимчивых и лабораторных животных (п 10) приведены в табл.3.

Приведенные данные свидетельствуют об отсутствии реактогенных свойств у штамма САРМ-V355.

Приобретенные эволюционные свойства авирулентности штамм САРМ - V355 РКС сохраняет в течение 6 последовательных пассажей на естественно-восприимчивых животных (поросятах-гнотобиотах).

Реверсибельность штамма САРМ - V355 на поросятах-гнотобиотах (п 3) приведена в табл. 4.

В лиофилизированном состоянии при 4-10°С штамм хранится в течение года, практически не снижая инфекционной активности.

У вакцинированных поросят-гнотобио- тов и свиноматок штамм САРМ - V355 стимулирует формирование локального и системного иммунитета (табл. 5 и 6) при контрольном заражении вирулентным штаммом вируса ТГС в дозе 2x10 ЛДзо.

Иммуногенность штамма САРМ - V355 РКС (индукция активного иммунитета) приведена в табл. 5.

Сравнительная иммуногенность штаммов САРМ - V355 и ЛУК респираторного коронавируса свиней (индукция пассивного иммунитета) приведена в табл. 6.

Установлено, что титры специфических антител к вирусу ТГС в молозиве и молоке свиноматок, иммунизированных штаммом САРМ-V355 вируса РКС. достигают уровня 1:5000-1:10000 в ИФА и сохраняют на достаточно высоком уровне до конца лактации.

П р и м е р 1 Расплодку контрольного штамма САРМ - V355 для приготовления

вакцины проводили в роллерной культуре клеток СПЭВ. Из роллера со сформированным монослоем сливали ростовую среду, отмывали монослой 3 раза раствором

Хенкса и вносили 10 мл культурального штамма САРМ - V355 РКС при множественности заражения 10 ТЦД/клетка. После адсорбции при 37°С в течение 1,5 ч инокулят удаляли и вносили поддерживающую среду

с добавлением трипсина 5 мкг/мл. Урожай культурального вируса собирали через 48 ч после заражения и инкубирования вируса в культуре клеток до проявления цитопа- тического действия на 50%. После замораживания-оттаивания культуральную вируссодержащую жидкость соединяли со средой высушивания, антибиотиками и лио- филизировали. При этом титр инфекционной активности культурального штамма

САРМ - V355 составлял 109 ТЦДбо/мл. Свиноматок вакцинировали двукратно, на 70 и 100 дни супоросности, интраназально и внутримышечно, Оценку иммуногенности вакцины проводили по результатам контрольного заражения поросят вирулентным штаммом вируса ТГС в дозе 2 х 103 ЛДбо. Сохранность поросят в группе вакцинированных свиноматок составила 76%, а в группе контрольных свиноматок - 8%.

П р и м е р 2. Выращивание культурального штамма САРМ - V355 РКС проводили аналогичным способом с некоторыми изменениями. Монослой при заражении раствором Хенкса отмывали 4 раза. Температура при адсорбции и инкубировании вируса составляла 38°С. Множественность заражения составляла 1 ТЦД/клетка, Время инкубирования вируса после заражения составляло 60 ч при проявлении цитопатического действия на 60%.Лиофи- лизацию проводили в условиях (по примеру 1). Титр инфекционной активности культурального штамма САРМ - V355 РКС составлял 1085 ТЦДбо/мл. Схема вакцинации свиноматок и условия контрольного заражения поросят были аналогичными примеру 1. Сохранность поросят в группе вакцинированных свиноматок составила 74%, а в пометах контрольных свиноматок - 3%.

Предлагаемый штамм апробирован с положительным результатом в лабораторных условиях.

В отличие от известного штамма ЛУК штамм САРМ - V355 РКС стабильно накапливается с высоким титром в культуре клеток (не ниже 1О8 ТЦДзо/мл) и обладает более выраженными иммуногенными свойствами.

Штамм САРМ - V355 найдет широкое применение при разработке средств специфической профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней в свиноводческих хозяйствах страны.

Примечание. - реципрокные величины среднегеометрических титров.

Формула изобретения Штамм респираторного коронавируса свиней САРМ - V355 для изготовления вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

Т а б л и ц а .1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6