ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА СВИНЕЙ (ТГС) И ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ДИАРЕИ СВИНЕЙ (ЭДС) ИЗ КИШЕЧНОГО ВИРУСА ИСКУССТВЕННО ЗАРАЖЕННЫХ БЕЗМОЛОЗИВНЫХ ПОРОСЯТ (ВАКЦИНА ТГЭДС) Российский патент 2009 года по МПК A61K39/225 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается изготовления и применения вакцины для специфической профилактики трансмиссивного гастроэнтерита (ТГС) и эпизоотической диареи свиней ЭДС. Они являются острыми и высококонтагиозными заболеваниями свиней, которые широко распространены во многих странах с развитым свиноводством и причиняют большой экономический ущерб. Заболеваниям подвержены свиньи всех возрастов, уровень летальности среди которых может достигать 100%. Заболевания сопровождаются изнуряющей диареей, рвотой и дегидратацией. Этиологическими агентами являются вирусы семейства Coronaviridae. Особую опасность заболевания представляют для крупных свиноводческих комплексов с непрерывными опоросами, где благодаря длительной персистенции вирулентных штаммов вирусов ТГС и ЭДС они зачастую приобретают энзоотическое течение и периодически вызывают массовую гибель поросят. Несмотря на сходную клиническую картину заболевания, вызываемую вирусами ТГС и ЭДС, и их принадлежность к одному семейству вирусов, эти возбудители отличаются друг от друга по антигенным свойствам и не вызывают перекрестного иммунитета. Если против ТГС в разных странах имеются удовлетворительные средства специфической защиты, то против ЭДС в мире таковых не существует. По этой причине многие страны терпят большой экономический ущерб. Специфическая профилактика ТГС и особенно ЭДС оказалась трудной задачей, которая несмотря на многочисленные исследования до сих пор не нашла своего окончательного решения. Трудность решения проблемы связана с тем, что поросята заражаются, как правило, в первые дни после рождения, что исключает создание у них активного иммунитета, а защита полностью зависит от пассивного колострального иммунитета.

С появлением и широким распространением в 90-х годах прошлого века природно-аттенуированного респираторного варианта вируса ТГС это заболевание в Западной Европе стало менее актуальным (5). Однако в США при циркуляции в популяции свиней аналогичного вируса проблема специфической профилактики ТГС не потеряла своего значения (2, 3, 6). Подобная ситуация сохраняется и в России. Новый вариант вируса ТГС, получивший название «респираторный коронавирус свиней» (РКВС), стали использовать для иммунизации свиней против ТГС (4, 6, 7). Для специфической профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней исследователями разных стран используется единая стратегия: активная иммунизация свиноматок с целью пассивной защиты потомства. Однако попытки достичь высокого уровня лактогенного иммунитета против ТГС не увенчались успехом. Для иммунизации было предложено множество различных вакцин и способов их применения, но все они оказались недостаточно эффективными (4). Основной недостаток предложенных ранее вакцин заключался в слабом иммунном ответе у вакцинированных супоросных свиноматок и, как следствие, недостаточно выраженный иммунитет у потомства.

В качестве прототипа вакцины против ТГС взята разработанная ранее комбинированная вакцина ТР-1 против ТГС, приготовленная из аттенуированного штамма вируса (1). Вакцина ТР-1 считалась наиболее приемлемым препаратом, который в течение многих лет применялся в промышленном свиноводстве. Данный препарат обеспечивал колостральный иммунитет и сохранность около 70% 3-5-дневных поросят при контрольном заражении вирулентным штаммом. Проведенные в последующем производственные испытания этого препарата показали, что в случае острого течения ТГС этот препарат обладает недостаточной эпизоотологической эффективностью (заболевание поросят может составить 40%). Кроме того, ее применение связано с необходимостью интраназального введения супоросным свиноматкам респираторного коронавируса свиней, что является трудно выполнимым техническим приемом.

Что касается специфической профилактики ЭДС, то прототипный препарат в мировой практике отсутствует.

Технический результат изобретения заключается в повышении специфической активности и эффективности вакцин за счет использования вирулентных штаммов вирусов ТГС и ЭДС и оптимальных условий их накопления в кишечнике искусственно зараженных безмолозивных поросят и превращения их в инактивированную вакцину. Вакцина ТГЭДС технически отличается от прототипа ТГС простотой изготовления в виде сорбированного препарата с гидратом окиси аллюминия (ГОА) в качестве адъюванта. Вакцина при 2-8°С сохраняет исходную активность не менее 12 месяцев. Вакцину вводят основным и ремонтным свиноматкам внутримышечно по 5,0 мл двукратно на 75-80 и 90-100 дней супоросности. Ремонтным свинкам, кроме того, вакцину вводят перед осеменением. Свиноматки, привитые таким способом, становятся иммунными и обеспечивают защиту поросят-сосунов от ТГС и ЭДС. Ниже приведены примеры изготовления вакцины ТГЭДС и ее эффективность.

В случае возникновения ЭДС кроме основных и ремонтных свиноматок вакцинируют поросят, которых прививают в 15-25-дневном возрасте внутримышечно в дозе 2,0 мл на голову и ревакцинируют через 2 недели в дозе 3,0 мл на голову.

Пример 1. Определение условий максимального накопления вируса в тонком отделе кишечника безмолозивных поросят.

Исследования в основном проводили с вирусом ТГС. Для заражения поросят использовали вирулентный штамм вируса, предварительно размноженный в организме безмолозивных поросят, с титром инфекционности 10⁷ ИД₅₀ (для безмолозивных поросят). Изучали влияние дозы заражения и время накопления вируса в тонком отделе кишечника поросят. Инфицированность поросят определяли по накоплению вирусного антигена методом иммуноферментного анализа (ИФА). Группу поросят по 8 голов заражали орально разными дозами вируса и убивали через 18, 20, 22, 24 часа после заражения. Из тонкого отдела кишечника поросят, зараженных каждой дозой вируса и убитых в указанные сроки, готовили среднюю пробу для исследования. Из тонко измельченной ткани кишечника готовили 25% суспензию на физиологическом растворе и осветляли центрифугированием. С целью количественного определения вирусного антигена суспензию разводили физиологическим раствором 1:2 - 1:64 и исследовали в ИФА. Данные трех опытов показали, что максимальное накопление вируса в кишечнике безмолозивных поросят при разных дозах заражения (10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷ ИД₅₀) имеют соответственно следующую временную зависимость:

10³ - 22 часа; 10⁴ - 22 часа; 10⁵ - 20 часов; 10⁶ - 18 часов; 10⁷ - 18 часов после заражения.

В эти периоды максимальное накопление вирусного антигена соответственно составляло 1:8; 1:16; 1:32; 1:16 и 1:32.

Таким образом, максимальное накопление вирусного антигена наблюдали при дозе заражения 10⁵ ИД₅₀ и сборе вируса через 20-22 часа после заражения. Эти условия в дальнейшем использовали при серийном размножении вируса с целью изготовления вакцины.

Пример 2. Матричные расплодки вируса служат исходным материалом для массового размножения вируса. Их готовят периодически 1-2 раза в год и хранят в жидком азоте.

Каждый раз заражают орально 30-60 безмолозивных поросят и использованием оптимальной дозы вируса (10⁵ ИД₅₀) и времени его сбора (20-22 часа после заражения).

Антигенную активность вирусных расплодок (25% осветленная суспензия тонкого отдела кишечника одновременно зараженных и убитых поросят) определяли в ИФА. Результаты анализа семи произвольно выбранных матричных расплодок вируса приведены в таблице 1.

Таблица 1. Антигенная активность матричных расплодок вируса ТГС. № п/п Дата приготовления матричных расплодок Разведение исходной суспензии, результат в ИФА Антигенная активность матричной расплодки 0 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1 15.05.2004 г. + + + + + + + 1:64 2 27.07.2004 г. + + + + + + - 1:32 3 10.10.2004 г. + + + + - - - 1:8 4 25.12.2004 г. + + + + + + - 1:32 5 07.02.2005 г. + + + + + - - 1:16 6 22.04.2005 г. + + + + + - - 1:16 7 23.06.20005 г. + + + + + - - 1:16 8 13.02.2006 г. + + + + + + + 1:64 9 12.05.2006 г. + + + + + - - 1:16

Полученные данные показали, что вирусный антиген методом ИФА выявлялся в суспензии кишечника, разведенный 1:8-1:64. Эти показатели антигенности значительно (в 2-8 раз) превышали аналогичные показатели вируса, размноженного в культуре клеток и использованного для изготовления вакцины против ТГС (8). Минимальный уровень антигенной активности кишечного вируса, установленный нами на основе экспериментальных данных, должен быть равен или выше 1:8. Только такой вирус пригоден для изготовления инактивированной вакцины из натурального кишечного вируса. Кроме того, определяли инфекционную активность матричных расплодок вируса титрованием на безмолозивных поросятах (таблица № 2).

Таблица 2. Инфекционная активность матричных расплодок вируса для безмолозивных поросят. Вирус Титр вируса (lg ИД₅₀/мл) Расплодка 1 Расплодка 2 Расплодка З ТГС 7,0 7,5 7,5 ЭДС 6,7 7,0 7,0

Полученные данные (таблица № 2) показали, что матричные расплодки вируса имели инфекционную активность в пределах 6,7-7,5 lg ИД₅₀/мл, которая оставалась без изменения при длительном хранении (12-18 месяцев) в жидком азоте. Такие матричные расплодки вируса служили исходным материалом для массового размножения вируса на безмолозивных поросятах с целью получения вирусного сырья для изготовления инактивированной вакцины.

Пример 3. Массовое размножение вируса на безмолозивных поросятах.

В 2004-2006 годах для изготовления вакцины получено 27 расплодок вируса с использованием более 4000 безмолозивных поросят. От каждого поросенка при оптимальном режиме заражения и убое поросят в среднем получали 30-40 г инфицированного кишечника в качестве сырья для изготовления вакцины.

Таблица 3. Антигенная активность кишечного вируса при массовой расплодке на безмолозивных поросятах.

Период изготовления Количество зараженных поросят Количество расплодок вируса Количество расплодок с антигенной активностью «1:8 1:8 1:16 1:32 04.2004 -12.2004 г. 1270 27 2 21 4 - 01.2005 - 2100 41 1 32 8 - 12.2005 г.             01.2006 -06.2006 г. 935 18 - 16 1 1

Из данных таблицы № 3 следует, что основное количество массовых расплодок вируса 83 из 86 по антигенной активности (>1:8) соответствовало требованиям изготовления вакцины. Выборочный контроль четырех партий такого вируса (антигенность в ИФА 1:8) на инфекционную активность для безмолозивных поросят также подтвердил их пригодность для изготовления вакцины (титр вируса 6,5-7,0 lg ИД₅₀.

Пример 4. Инактивация вируса.

Инактивацию вируса проводили формалином в конечной концентрации 0,2% при Т +37°С в течение 24 часов. Полноту инактивации вируса определяли следующим образом. Так пробу инактивированного вируса (10-15 мл) помещали в диализную целлофановую трубку, закрывали герметично с обоих концов и опускали в дистиллированную воду при соотношении 1:100 (объем/объем). Диализ с целью удаления не связанного формальдегидом из пробы вируса продолжается 16-18 часов при Т 2-8°С. Анализированную пробу вируса в дозе 3,0 мл вводят орально трем безмолозивным поросятам. Отсутствие заболевания у поросят в течение 5 дней свидетельствует о полной инактивации вируса.

Пример 5. Изготовление инактивированной вакцины ТГЭДС.

Массовые расплодки вирусов ТГС и ЭДС с антигенной активностью >1:8 смешивали в соотношении 1:1 (объем/объем), инактивировали и добавляли стерильный гидрат окиси аллюминия в количестве 20% к объему смеси вирусов. Инактивированную вакцину консервируют мертиолятом в конечной концентрации 1:10000. Готовую вакцину расфасовывают в стерильные флаконы, закрывают герметично стерильными резиновыми пробками и закатывают аллюминиевыми колпачками. Вакцина имеет красный цвет с рыхлым осадком белого цвета, легко разбивающимся при встряхивании. Вакцина должна быть стерильна, безвредна и не должна вызывать реакции у привитых животных.

Безвредность вакцины проверяют на 20-25-дневных поросятах. Трем поросятам вакцину вводят внутримышечно по 2,0 мл. Привитые поросята должны оставаться клинически здоровыми в течение 15 дней, не иметь видимых изменений на месте введения вакцины.

Пример 6. Эффективность применения вакцины в практических условиях.

Всего в период с 04.2004 г. по 06.2006 г. изготовлено и применено с практической целью более 129,8 тысяч доз инактивированной вакцины ТГЭДС, которую применяли в стационарно неблагополучном по ТГС и ЭДС в хозяйстве промышленного типа (70000 свиней). В результате длительного и систематического применения вакцины (2004-2006 гг.) удалось ликвидировать массовые коронавирусные энтериты и предотвратить гибель поросят в хозяйстве. Выраженная иммуногенность вакцины подтверждена также наличием высокого уровня специфических антител (1:256-1:1024) в молозиве вакцинированных свиноматок в день опороса и в сыворотке крови вакцинированных свиней. Установлено, что длительное применение вакцины ТГЭДС прекращает латентное носительство вируса ТГС и ЭДС в ранее инфицированной популяции свиней.

ЛИТЕРАТУРА

1. Алипер Т.И. Экспериментальная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней (ТР-1), оценка антигенности и оптимизация условий применения, автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук, Москва. 1987 г.

2. Алипер Т.И. и др. Вопросы вирусологии, 2002 г., 1, 39.

3. Сергеев В.А. и др. Ветеринария, 2003 г., 4, 3.

4. Сох Е. et al. Vaccine. 1993 г., 11, 267.

5. Pensaert M. et al. Vet.Q. 1986 г., 8, 257.

6. Saif L.J., Wesley R.D. Diseases of Swine. 1999 г., 295.

7. Wesley R.D. Woods R.D. Vet. Microbiol, 1993 г., 38, 40.

8. Сергеев В.А. и др. Ветеринария, 2006 г., № 5, 20.

Изобретение относится к области вирусологии. Вакцина содержит смесь инактивированных вирусов трансмиссивного гастроэнтерита и эпизоотической диареи свиней и адъювант. Источником вирусов является тонкий отдел кишечника искусственно зараженных безмолозивных поросят, где они накапливаются в титре 6,7-7,5 lg ИД₅₀/мл и имеют антигенную активность в ИФА не ниже 1:8. Суспензии вирусов взяты в отношении 1:1 по объему, к смеси которых добавляют 20% гидрата окиси алюминия в качестве адъюванта. Вакцина ТГЭДС безвредна, ареактогенна, обладает выраженными защитными свойствами. Изобретение может быть использовано в свиноводческих хозяйствах промышленного типа. 3 табл.

Инактивированная вакцина против вирусов трансмиссивного гастроэнтерита и вирусной диареи свиней, полученная размножением, сбором, инактивацией вирусов и добавлением адъюванта, отличающаяся тем, что она получена при использовании соответствующих инактивированных природных вирусов, размноженных в организме новорожденных поросят, с титром 6,7-7,5 lg ИД₅₀/мл и антигенностью в ИФА не ниже 1:8.