СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ МУКОВИСЦИДОЗА У ДЕТЕЙ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/573 G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины, в частности к пульмонологии, и может быть использовано для оценки течения и степени тяжести муковисцидоза.

Муковисцидоз (кистозный фиброз) - системное наследственное заболевание, обусловленное мутацией гена трансмембранного регулятора муковисцидоза и характеризующееся поражением желез внешней секреции, тяжелыми нарушениями функций органов дыхания и желудочно-кишечного тракта.

Известен способ диагностики муковисцидоза по определению хлора в потовой пробе, когда определение концентрации хлорида натрия проводят спектрофотометрически, а муковисцидоз диагностируют по возрастанию концентрации хлорида натрия в поте пациента (патент РФ №2141670).

Известен способ диагностики муковисцидоза в ногтях или в слюне, в котором проводят исследование слюны больного до и после воздействия на нее мукосальвином, затем морфометрически исследуют жидкокристаллические структуры (патент РФ №2009491).

Известен способ постнатальной ДНК-диагностики муковисцидоза (заявка на патент РФ №2008146602 от 26.11.2008 г.), который позволяет проводить экспресс амплификацию на наличие диагностически значимых мутаций в гене муковицидоза, что дает возможность своевременно проводить профилактические мероприятия.

Клиническая картина муковисцидоза полиморфна и складывается из симптомов поражения различных органов и систем, выраженных в неодинаковой степени.

Чаще всего при муковисцидозе поджелудочная железа не вырабатывает в достаточных количествах ни один фермент, более всего не хватает липазы.

Наиболее специфичным является снижение уровня панкреатической липазы (липазы поджелудочной железы) в крови - важнейшего фермента в процессе переваривания жиров, в отношении фиброза поджелудочной железы и муковисцидоза (Nagai К., Iguchi К., Yanaihara N. // Gastroent. Jap., 1993, Vol.28, 3, p.401-405).

Нарушения переваривающей функции желудочно-кишечного тракта при муковисцидозе определяют целый комплекс отклонений ряда систем и функций: витаминную недостаточность, повреждение систем гомеостаза, кроветворной функции. При муковисцидозе обнаружено снижение жирных кислот не только в крови, но и в тканях (печени, легких, сердце).

Общепринятым вариантом лечения муковисцидоза в период обострения является использование внутривенных курсов антибиотиков, муколитических препаратов, ферментов (наиболее эффективен препарат Креон) и кинезитерапия с обязательным включением в базисную терапию Капранов Н.И. «Муковисцидоз (современные достижения и проблемы)», М., 2003, 76 с.).

Известен способ оценки течения хронического воспалительного процесса в бронхолегочной системе больного муковисцидозом, при котором в мокроте больного определяют уровень α 1-ингибитора протеиназ и активность эластазы, отличающийся тем, что дополнительно определяют уровни интерлейкина 8 и фактора некроза опухоли-α и рассчитывают диагностический коэффициент К по формуле К=А+В+С/Д, где А - уровень интерлеикина-8 (нг/мл); В - уровень фактора некроза опухоли-α (нг/мл); С - уровень α 1-ингибитора протеиназ (мкг/мл); Д - активность эластазы (нмоль/мл × мин), и при значениях 2,5<К<5,5 оценивают течение хронического воспалительного процесса в бронхолегочной системе как среднетяжелое минимальной активности, при 6,0<К<9,0 - как среднетяжелое в период обострения, а при К>9,0 - как тяжелое (патент РФ №2216737). Способ не позволяет достаточно точно дать оценку активности течения хронического воспалительного процесса в бронхолегочной системе больного муковисцидозом.

Способ выбран нами в качестве прототипа.

Известна рабочая классификация муковисцидоза (Рачинский С.В. и др. 2000):

- по форме болезни: смешанная (легочно-кишечная); легочная; кишечная;

- по фазе и активность процесса: ремиссия; активность (малая, средняя);

- осложнения: абсцессы, ателектазы, пневмо- и пионевмоторакс, кровохарканье, гайморит, отечный синдром, цирроз печени;

- оценка тяжести состояния: хорошее: 71-100 баллов; удовлетворительное: 56-70 баллов; средней тяжести: 41-55 баллов; тяжелое: менее 40 баллов (Войтович Т.Н., 3-я детская ГКБ, "Медицинская панорама" №9, 2002).

Задачей изобретения является создание надежного способа, позволяющего дать оценку активности течения хронического воспалительного процесса в бронхолегочной системе больного муковисцидозом.

Сущность изобретения заключается в определение матрилизина - матриксной металлопротеиназы-7 (ММР-7), иммуноферментным методом.

Матрилизин (мнимая металлопротеаза или ММП) является недавно открытым представителем семейства матричных металлопротеаз. Матрилизин обладает способностью разлагать широкий спектр матричных субстратов, в том числе протеогликаны, желатины, фибронектин, эластин и ламинин. Его экспрессия была зафиксирована в одноядерных фагоцитах, эксплантатах матки крыс и в единичных случаях в опухолях. ММР-7 оказалась достаточно сильной протеиназой. Фермент гидролизует ряд белков матрикса: фибронектин, эластин, аггрикан, коллаген V типа, но не гидролизует интерстициальные коллагены - I, II, III типов и коллаген базальных мембран - IV типа. ММР-7 требует наличия остатка Leu в положении Р'1, хотя допускаются и другие гидрофобные и алифатические остатки. В положении Р1 предпочтительны остатки Gly и Ala.

Нами обследовано 185 больных с бронхолегочной патологией от 1 месяца и до 17,5 лет. 93 ребенка были с врожденными пороками развития бронхов и легких (ВПРБиЛ), 64 - с муковисцидозом (MB), остальные - с бронхиальной астмой, рецидивирующими бронхитами.

Исследовали металлопротеазу или ММР-7 как параметр протеазно-антипротеазного комплекса. Оказалось, что повышенный уровень ММР-7 был характерен только для больных с муковисцидозом. Было установлено, что определение содержания ММР-7 является доступным, информативным методом в диагностике муковисцидоза.

Диагноз Содержание ММР-7 Муковисцидоз общая группа n=64 6,98±0,84 Генетически подтвержденный MB - гетерозиготы n=28 7,71±0,97 MB гомозиготы n=15 7,62±0,8 MB не ясной этиологии n=21 5,31±0,57 Врожденные пороки бронхов и легких, общая группа n=93 3,43±0,11 Пневмосклероз n=42 3,11±0,17 Гипоплазия легкого n=20 3,21±0,17 Синдром Картагнера n=19 3,14±0,7 Бронхиальная астма n=Т0 2,74±0,07 Эмфизема n=11 3,53±0,3 Синдром Вильямса-Кемпбела n=7 2,28±0,24 Тубинфицированность n=22 3,48±0,34 Бронхоэктазы n=24 3,35±0,1 Фиброзирующий альвеолит n=7 5,19±0,22 Фиброз легочной ткани 5,4±0,58

Ложноотрицательные результаты наблюдают у больных с муковисцидозом, сопровождающимся бронхиальной астмой, тяжелой аллергией.

Ложноположительные результаты наблюдают у больных с тяжелой формой бронхолегочной патологии, сопровождающейся фиброзом легочной ткани и у больных после операции по поводу резекции части легкого (высокие цифры держатся 2-3 месяца после оперативного вмешательства).

Критерием для оценки степени тяжести заболевания у детей с муковисцидозом явилось повышенное содержание матриксной металлопротеиназы-7.

Степень тяжести муковисцидоза оценивают при значениях ММР-7 от 7,0 нг/мл и выше как тяжелую, при значениях от 5,0-7,0 нг/мл как среднюю, а при значениях 2,0-5,0 нг/мл как легкую.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят забор крови у детей натощак в количестве 5 мл в пробирки с литиевым гепарином. Плазму крови отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 500g, отстаивают 25-30 мин и хранят образец, обогащенный нейтрофилами при температуре - 18-24°С. Не допускается повторное оттаивание - замораживание. В день исследования образец размораживают при комнатной температуре и тщательно перемешивают на Vortxe. Содержание ММР-7 определяют иммуноферментным методом на иммуноферментном анализаторе «Мультискан» фирмы «Лабсистем» (Финляндия) с использованием стандартных наборов фирмы R and D. Для этого в микроплаты вносят моноклональные специфические антитела к ММР-7, затем вносят стандарты и пробы ММР-7. После 2-часовой инкубации на горизонтальном шейкере при 500 об/мин плашки промывают 4-кратно. Удаляют избыточное количество антител и добавляют субстрат. После 30-минутной инкубации реакцию (развивается окраска пропорционально содержанию ММР-7) останавливают добавлением столовой ложки раствора. Конечная окраска просматривается на иммуноферментном анализаторе при длине волны 450 нм. Считывание показаний происходит в течение не более чем 30 минут.

Степени тяжести заболевания муковисцидозом у детей определяют по повышенному содержанию матриксной металлопротеиназы - 7.

Известно, что больные муковисцидозом, подтвержденным генетически, в гомо- или гетерозиготном состоянии по мутации del F 508 страдают наиболее тяжелой формой заболевания. Нами было выявлено, что у этих детей содержание ММР-7 было самым высоким и составило 7,62±0,8 в гомозиготном состоянии и 7,71±0,97, у больных в гетерозиготном состоянии. Уровень ММР-7 у больных муковисцидозом с другими формами мутаций или неустановленными формами мутаций был несколько ниже, но значительно превышал показатели больных с ВПРБиЛ.

Содержание ММР-7 в диапазоне от 7,0 нг/мл и выше оценивали как тяжелую степень тяжести течения муковисцидоза, в диапазоне от 5,0-7,0 нг/мл - как среднюю степень тяжести, а в диапазоне 2,0-5,0 нг/мл - как легкую степень тяжести заболевания.

Клинические примеры осуществления способа.

Пример 1. Больная Б. 13 лет. У ребенка, со слов отца, с ясельного возраста отмечали «жирный» стул. Заболела в 12 лет. По результатам флюорографии по месту жительства была госпитализирована в институт туберкулеза с жалобами на кашель с отхождением гнойной мокроты, диагноз: диссеминированный процесс в легких неясной этиологии.

По результатам обследования был снят диагноз туберкулеза. Был проведен потовый тест на аппарате «Макродакт» - при обследовании хлориды пота 123 ммоль/л, исследование уровня хлора в поте по Гибсону и Кукку - 77 мэкв/л (классический метод навеска = 600 мг). Девочке был поставлен диагноз - муковисцидоз и назначена базисная терапия в полном объеме.

При поступлении в НЦЗД РАМН (и/б №2476) у ребенка наблюдали выраженный симптом «барабанных палочек» и ногтей по типу «часовых стекол», как на руках, так и на ногах на 2++, микрополиадения. Одышки в покое нет, однако при физической нагрузке отмечается одышка. Кашель продуктивный с отхождением мокроты гнойного характера в большом количестве, преимущественно утром и вечером. В легких жесткое дыхание. ЧДД (в покое) 30/мин. Тоны сердца звучные, ритмичные. ЧСС - 86 уд./мин. Живот слегка вздут, при пальпации безболезненный. Печень пальпируется по краю реберной дуги. Селезенка не пальпируется. Стул регулярный 2 раза в день. Дизурии нет. На основании данных анамнеза, клинической картины заболевания, данных лабораторного и рентгенологического обследования диагноз муковисцидоз подтвержден (генотип: мутация W11282X в гомозиготном состоянии).

Ребенку проводили определение содержания ММР-7 в плазме крови иммуноферментным методом. Забор крови осуществлялся натощак из вены в количестве 5 мл. Кровь забирали в пробирки с литиевым гепарином. Плазму отделяли центрифугированием 10 минут при 500g, допускалось также отстаивание 25-30 минут. Отбирали плазму, обогащенную нейтрофилами. Моноклональные специфические антитела к ММР-7 вносили предварительно в микроплаты, затем вносили стандарты и пробы ММР-7. После 2-часовой инкубации на горизонтальном шейкере при 500 об/мин плашки промывали 4-кратно. Удаляли избыточное количество антител и добавляли субстрат. После 30-минутной инкубации реакцию (развивается окраска пропорционально содержанию ММР-7) останавливали добавлением столовой ложки раствора. Конечная окраска просматривалась на иммуноферментном анализаторе при длине волны 450 нм. Считывание показаний происходило в течение не более 30 минут. Содержание ММР-7 у ребенка до лечения было 5,12 нг/мл, что соответствует средней тяжести заболевания, после курса терапии содержание ММР-7 уменьшилось до 4,63 нг/мл, что соответствует легкой степени заболевания. Характер изменения показателей идентичен как при КТ и рентгенографии, так и при проведении иммуноферментного метода исследования.

Клинический пример 2. Больная В., 13 лет (и/б №6669). Диагноз муковисцидоз был выставлен в возрасте 1 года. Астенического телосложения. Кожные покровы: периорбитальный цианоз, видимые слизистые влажные. Микрополиадения. Деформация концевых фаланг по типу «барабанных палочек» и ногтей по типу «часовых стекол» как на руках, так и на ногах. Кашель продуктивный с отхождением мокроты слизисто-гнойного характера в большом количестве. В легких жесткое дыхание. ЧДД (в покое) 22/мин. Тоны сердца приглушенные, ритмичные. ЧСС - 92 уд./мин. Живот мягкий, при пальпации безболезненный. Печень пальпируется по краю реберной дуги. Селезенка не пальпируется. Стул регулярный 1-2 раза в день. Дизурии нет. На основании данных анамнеза, клинической картины заболевания, данных лабораторного и рентгенологического обследования был выставлен диагноз - муковисцидоз, смешанная форма, тяжелое течение (генотип: мутация delF508 в гетерозиготном состоянии). Постоянный кашель с отхождением серозно-гнойной мокроты. Неоднократно находилась в стационаре на обследовании и лечении с диагнозом: муковисцидоз. Поступила в клинику в тяжелом состоянии. На рентгенограмме грудной клетки: признаки обострения бронхолегочного процесса. Терапию антибиотиками проводили амбулаторно, с положительной динамикой, получает базисную терапию (креон, пульмозим).

Содержания ММР-7 в плазме крови определяли с помощью иммуноферментного анализа. Забор крови осуществлялся натощак из вены в количестве 5 мл. Кровь забирали в пробирки с литиевым гепарином. Плазму отделяли центрифугированием 10 минут при 500g, допускалось также отстаивание 25-30 минут. Отбирали плазму, обогащенную нейтрофилами. Моноклональные специфические антитела к ММР-7 вносили предварительно в микроплаты, затем вносили стандарты и пробы ММР-7. После 2-часовой инкубации на горизонтальном шейкере при 500 об/мин плашки промывали 4-кратно. Удаляли избыточное количество антител и добавляли субстрат. После 30-минутной инкубации реакцию (развивается окраска пропорционально содержанию ММР-7) останавливали добавлением столовой ложки раствора. Конечная окраска просматривалась на иммуноферментном анализаторе при длине волны 450 нм. Считывание показаний происходило в течение не более 30 минут. До проведения комплексной терапии содержание ММР-7 составило 22,58 нг/мл, после проведения терапии отмечали незначительное снижение до 21,82 нг/мл.

На основании данных иммуноферментного анализа был поставлен диагноз - муковисцидоз тяжелой степени и пневмофиброз, что было подтверждено комплексным клинико-лабораторно-инструментальным исследованием.

Предложенный способ позволил повысить точность диагностики выраженности пневмофиброза у детей с муковисцидозом до 90%.

Способ доступен большинству лабораторий, специфичность метода по нашим данным 79,8%, что выше, чем потовые пробы, для которых специфичность чуть больше 50%.

Таким образом, определение ММР-7 при биохимическом исследовании крови является доступным информативным способом оценки степени тяжести муковисцидоза.

Изобретение относится к области медицины, в частности к пульмонологии, и может быть применено для оценки течения и степени тяжести муковисцидоза. Сущность способа заключается в том, что проводят определение в плазме крови больного содержания матриксной металлопротеиназы-7 (ММР-7). При значениях ММР-7 от 7,0 нг/мл и выше степень тяжести муковисцидоза оценивают как тяжелую, при значениях от 5,0-7,0 нг/мл как среднюю, при значениях 2,0-5,0 нг/мл как легкую. Использование способа позволяет повысить точность диагностики выраженности пневмофиброза у детей с муковисцидозом. 1 табл.

Способ оценки степени тяжести муковисцидоза у детей, включающий определение в биологическом материале содержания протеиназы, отличающийся тем, что в плазме крови больного определяют содержание матриксной металлопротеиназы-7 (ММР-7) и при значениях ММР-7 от 7,0 нг/мл и выше степень тяжести муковисцидоза оценивают как тяжелую, при значениях от 5,0-7,0 нг/мл как среднюю, а при значениях 2,0-5,0 нг/мл как легкую.