АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА К ДЕЛЬТА-ПОДОБНОМУ ЛИГАНДУ-4 ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2012 года по МПК C07K16/18 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Notch-сигнальный путь представляет собой систему передачи информации между клетками, используемый широким спектром эукариот во многих биологических процессах, в том числе клеточной дифференциации, пролиферации и гомеостаза. Дельта-подобный 4 (Dl4) или дельта-подобный лиганд-4 (Dll4), далее именуемый “Dll4”) входит в дельта-семейство Notch-лигандов и с высокой селективностью экспрессируется сосудистым эндотелием (Shutter et al. (2000) Genes Develop. 14:1313-1318). Dll4 выполняет функции лиганда для Notch-рецепторов, в том числе рецепторов Notch-1 и Notch-4. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности для Dll4 человека приведены в последовательностях SEQ ID №: 1-2 соответственно.

Способы получения антител, полезных в качестве лекарственных препаратов для человека, включают производство химерных антител и гуманизированных антител (см., например, патент US 6949245). См., например, WO 94/02602 (Abgenix) и патент US 6596541 (Regeneron Pharmaceuticals), где описаны способы создания не относящихся к человеку трансгенных мышей, способных производить антитела человека.

В заявке на патент Японии 2003/047470A2 (Asahi Kasei Kogyo) описаны антитела к внеклеточной части белка Notch-лиганда человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к антителам человека, предпочтительно рекомбинантным антителам человека, которые специфически связывают дельта-подобный лиганд-4 человека (hDll4). Для этих антител характерно связывание с hDll4 с высокой аффинностью и способность нейтрализовать активность Dll4. Антитела по изобретению способны блокировать связывание Dll4 с Notch-рецептором (рецепторами) и тем самым ингибировать передачу сигнала через Dll4. Антитела могут быть полноразмерными (например, антитела IgG1 или IgG4) или включать только антиген-связывающую часть (например, фрагмент Fab, F(ab')₂ или scFv) и могут быть модифицированы с целью воздействовать на функциональность, например удалять остаточные эффекторные функции (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557, 573, 589, 605, 621, 637, 653, 669, 685, 701, 717, 733, 749, 765, 781, 797, 813, 893, 897, 901, 905, 909, 913, 917, 921, 925, 935, 939, 943 и 947, или ее существенно идентичную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения HCVR является аминокислотной последовательностью SEQ ID №: 429 или 901.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 405, 421, 437, 453, 469, 485, 501, 517, 533, 549, 565, 581, 597, 613, 629, 645, 661, 677, 693, 709, 725, 741, 757, 773, 789, 805, 821, 895, 899, 903, 907, 911, 915, 919, 923, 927, 937, 941, 945 и 949, или ее существенно идентичную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения LCVR является аминокислотной последовательностью SEQ ID №: 437 или 903.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит HCVR, выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557, 573, 589, 605, 621, 637, 653, 669, 685, 701, 717, 733, 749, 765, 781, 797, 813, 893, 897, 901, 905, 909, 913, 917, 921, 925, 935, 939, 943 и 947, или ее существенно идентичную последовательность, и LCVR, выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 405, 421, 437, 453, 469, 485, 501, 517, 533, 549, 565, 581, 597, 613, 629, 645, 661, 677, 693, 709, 725, 741, 757, 773, 789, 805, 821, 895, 899, 903, 907, 911, 915, 919, 923, 927, 937, 941, 945 и 949, или ее существенно идентичную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения HCVR/LCVR являются парами аминокислотной последовательности SEQ ID №: 429/437 или 901/903.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится определяющая комплементарность область 1 (CDR1) тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278 294, 310, 326, 342, 358, 374, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559, 575, 591, 607, 623, 639, 655, 671, 687, 703, 711, 719, 735, 751, 767, 783, 799, 815, 831, 847, 863 и 879, или ее существенно идентичная последовательность.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится определяющая комплементарность область 2 (CDR2) тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 401, 417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561, 577, 593, 609, 625, 641, 657, 673, 689, 705, 721, 737, 753, 769, 785, 801, 817, 833, 849, 865 и 881, или ее существенно идентичная последовательность.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится определяющая комплементарность область 3 (CDR3) тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 403, 419, 435, 451, 467, 483, 499, 515, 531, 547, 563, 579, 595, 611, 627, 643, 659, 675, 691, 707, 723, 739, 755, 771, 787, 803, 819, 835, 851, 867 и 883, или ее существенно идентичная последовательность.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278 294, 310, 326, 342, 358, 374, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559, 575, 591, 607, 623, 639, 655, 671, 687, 703, 711, 719, 735, 751, 767, 783, 799, 815, 831, 847, 863 и 879, или ее существенно идентичная последовательность; CDR2 тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 401, 417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561, 577, 593, 609, 625, 641, 657, 673, 689, 705, 721, 737, 753, 769, 785, 801, 817, 833, 849, 865 и 881, или ее существенно идентичная последовательность; и CDR3 тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 403, 419, 435, 451, 467, 483, 499, 515, 531, 547, 563, 579, 595, 611, 627, 643, 659, 675, 691, 707, 723, 739, 755, 771, 787, 803, 819, 835, 851, 867 и 883, или ее существенно идентичная последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, выбранные из группы, содержащей SEQ ID №: 431/433/435; 374/376/378; 783/785/787 и 799/801/803.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 407, 423, 439, 455, 471, 487, 503, 519, 535, 551, 567, 583, 599, 615, 631, 647, 663, 679, 695, 711, 727, 743, 759, 775, 791, 807, 823, 839, 855, 871 и 887, или ее существенно идентичная последовательность.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR2 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 409. 425, 441, 457, 473, 489, 505, 521, 537, 553, 569, 585, 601, 617, 633, 649, 665, 681, 697, 713, 729, 745, 761, 777, 793, 809, 825, 841, 857, 873 и 889, или ее существенно идентичная последовательность.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR3 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 18, 34, 50, 66, 82, 98, 11, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 587, 603, 619, 635, 651, 667, 683, 699, 715, 731, 747, 763, 779, 795, 811, 827, 843, 859, 875 и 891, или ее существенно идентичная последовательность.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 407, 423, 439, 455, 471, 487, 503, 519, 535, 551, 567, 583, 599, 615, 631, 647, 663, 679, 695, 711, 727, 743, 759, 775, 791, 807, 823, 839, 855, 871 и 887, или ее существенно идентичная последовательность; CDR2 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 409. 425, 441, 457, 473, 489, 505, 521, 537, 553, 569, 585, 601, 617, 633, 649, 665, 681, 697, 713, 729, 745, 761, 777, 793, 809, 825, 841, 857, 873 и 889, или ее существенно идентичная последовательность; и CDR3 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 18, 34, 50, 66, 82, 98, 11, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 587, 603, 619, 635, 651, 667, 683, 699, 715, 731, 747, 763, 779, 795, 811, 827, 843, 859, 875 и 891, или ее существенно идентичная последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, выбранные из группы, содержащей SEQ ID №: 439/441/443; 382/384/386; 791/793/795 и 807/809/811.

Во втором аспекте настоящего изобретения приводятся молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела или антиген-связывающие области изобретения. Настоящее изобретение также охватывает рекомбинантные векторы экспрессии, несущие нуклеиновые кислоты настоящего изобретения, которые кодируют антитела, и клетки-хозяева, в которые включаются такие векторы, а также способы приготовления антител настоящего изобретения путем культивирования клеток-хозяев изобретения.

В одном из осуществлений настоящего изобретения антитело содержит HCVR, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572, 588, 604, 620, 636, 652, 668, 684, 700, 716, 732, 748, 764, 780, 796, 812, 892, 896, 900, 904, 908, 912, 916, 920, 924, 934, 938, 942 и 946, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит LCVR, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, 580, 596, 612, 628, 644, 660, 676, 692, 708, 724, 740, 756, 772, 788, 804, 820, 894, 898, 902, 906, 910, 914, 918, 922, 926, 936, 940, 944 и 948, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит HCVR, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572, 588, 604, 620, 636, 652, 668, 684, 700, 716, 732, 748, 764, 780, 796, 812, 892, 896, 900, 904, 908, 912, 916, 920, 924, 934, 938, 942 и 946, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%, и LCVR, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, 580, 596, 612, 628, 644, 660, 676, 692, 708, 724, 740, 756, 772, 788, 804, 820, 894, 898, 902, 906, 910, 914, 918, 922, 926, 936, 940, 944 и 948, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 тяжелой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574, 590, 606, 622, 638, 654, 670, 686, 702, 718, 734, 750, 766, 782, 798, 814, 830, 846, 862 и 878, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, содержащий CDR2 тяжелой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 100, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576, 592, 608, 624, 640, 656, 672, 688, 704, 720, 736, 752, 768, 784, 800, 816, 832, 848, 864 и 880, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR3 тяжелой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, 578, 594, 610, 626, 642, 658, 674, 690, 706, 722, 738, 754, 770, 786, 802, 818, 834, 850, 866 и 882, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 тяжелой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574, 590, 606, 622, 638, 654, 670, 686, 702, 718, 734, 750, 766, 782, 798, 814, 830, 846, 862 и 878, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%; CDR2 тяжелой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 100, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576, 592, 608, 624, 640, 656, 672, 688, 704, 720, 736, 752, 768, 784, 800, 816, 832, 848, 864 и 880, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%; и CDR3 тяжелой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, 578, 594, 610, 626, 642, 658, 674, 690, 706, 722, 738, 754, 770, 786, 802, 818, 834, 850, 866 и 882, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, кодируемые последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, содержащей SEQ ID №: 430/432/434; 373/375/377; 782/784/786 и 798/800/802.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, содержащий CDR1 легкой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566, 582, 598, 614, 630, 646, 662, 678, 694, 710, 726, 742, 758, 774, 790, 806, 822, 838, 854, 870 и 886, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR2 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568, 584, 600, 616, 632, 648, 664, 680, 696, 712, 728, 744, 760, 776, 792, 808, 824, 840, 856, 872 и 888, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR3 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 586, 602, 618, 634, 650, 666, 682, 698, 714, 730, 746, 762, 778, 794, 810, 826, 842, 858, 874 и 890, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566, 582, 598, 614, 630, 646, 662, 678, 694, 710, 726, 742, 758, 774, 790, 806, 822, 838, 854, 870 и 886, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%; CDR2 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568, 584, 600, 616, 632, 648, 664, 680, 696, 712, 728, 744, 760, 776, 792, 808, 824, 840, 856, 872 и 888, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%, и CDR3 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 586, 602, 618, 634, 650, 666, 682, 698, 714, 730, 746, 762, 778, 794, 810, 826, 842, 858, 874 и 890, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, кодируемые последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, содержащей SEQ ID №: 438/440/442; 381/383/385; 790/792/794 и 806/808/810.

В третьем аспекте настоящего изобретения приводится выделенное антитело человека или фрагмент антитела, с которым специфическим образом связывается hDll4 человека, и в котором содержатся CDR 1, 2 и 3, выбранные из группы, включающей (a) область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸ (SEQ ID №: 928), где X¹ - Gly; X² - Phe или Tyr; X³ - Thr; X⁴ - Phe; X⁵ - Ser, Thr или Asn; X⁶ - Ser, Asn или Tyr; X⁷ - Tyr или Phe; и X⁸ - Gly или Ala; (b) область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸ (SEQ ID №: 929), где X¹ - Ile или Leu; X² - Trp или Ser; X³ - Tyr, Ala или Gly; X⁴ - Asp, Ser или Tyr; X⁵ - Gly или Asp; X⁶ - Ser, Gly, Thr или Val; X⁷ - Asn или Asp; и X⁸ - Lys или Arg; (c) область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹-X¹²-X¹³-X¹⁴-X¹⁵-X¹⁶ (SEQ ID №: 930), где X¹ - Ala или Ser; X² - Arg или Lys; X³ - Asp или Tyr; X⁴ - Ser, Gly или His; X⁵ - Asp, Ala или Trp; X⁶ - Asn или Phe; X⁷ - Tyr, Arg или Lys; X⁸ - His или Ser; X⁹ - Gly или Trp; X¹⁰ - Tyr или Phe; X¹¹ - Glu или Asp; X¹² - Gly, His или Pro; X¹³ - Tyr, Trp или отсутствует; X¹⁴ - Phe или отсутствует; X¹⁵ - Asp или отсутствует; и X¹⁶ - Pro или отсутствует.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело человека или фрагмент антитела содержит последовательности CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи, выбранные из группы, включающей (a) область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸ (SEQ ID №: 928), где X¹ - Gly; X² - Phe; X³ - Thr; X⁴ - Phe; X⁵ - Ser или Asn; X⁶ - Ser или Asn; X⁷ - Tyr или Phe; и X⁸ - Gly или Ala; (b) область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸ (SEQ ID №: 929), где X¹ - Ile или Leu; X² - Trp или Ser; X³ - Tyr или Gly; X⁴ - Asp или Ser; X⁵ - Gly; X⁶ - Ser, Thr или Val; X⁷ - Asn или Asp; и X⁸ - Lys или Arg; (c) область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹-X¹²-X¹³-X¹⁴-X¹⁵-X¹⁶ (SEQ ID №: 930), где X¹ - Ala или Ser; X² - Arg или Lys; X³ - Asp; X⁴ - Gly или His; X⁵ - Asp или Ala; X⁶ - Phe; X⁷ - Tyr или Arg; X⁸ - Ser; X⁹ - Gly; X¹⁰ - Tyr; X¹¹ - Glu; X¹² - Gly или His; X¹³ - Tyr или Trp; X¹⁴ - Phe или отсутствует; X¹⁵ - Asp или отсутствует; и X¹⁶ - Pro или отсутствует.

В еще одном варианте осуществления изобретения выделенное антитело человека или фрагмент антитела также содержит (d) область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷ (SEQ ID №: 931), где X¹ - Gln; X² - Ser; X³ - Val; X⁴ - Arg, Ser или Thr; X⁵ - Ser или Gly; X⁶ - Ser или Tyr; и X⁷ - Tyr или отсутствует; (e) область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³ (SEQ ID №: 932), где X¹ - Gly или Asp; X² - Ala или Thr; и X³ - Ser; и (f) область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹ (SEQ ID №: 933), где X¹ - Gln; X² - Gln или His; X³ - Tyr, Arg или Ser; X⁴ - Gly, Ser или Ala; X⁵ - Ser, Asn или Phe; X⁶ - Trp или Ser; X⁷ - Pro; X⁸ - Trp, Pro или Arg; и X⁹ - Thr.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения выделенное антитело человека или фрагмент антитела также содержит (d) область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷ (SEQ ID №: 931), где X¹ - Gln; X² - Ser; X³ - Val; X⁴ - Arg или Ser; X⁵ - Ser; X⁶ - Ser или Tyr; и X⁷ - Tyr или отсутствует; (e) область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³ (SEQ ID №: 932), где X¹ - Gly или Asp; X² - Ala или Thr; и X³ - Ser; и (f) область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹ (SEQ ID №: 933), где X¹ - Gln; X² - Gln или His; X³ - Tyr или Arg; X⁴ - Gly или Ser; X⁵ - Ser или Asn; X⁶ - Trp или Ser; X⁷ - Pro; X⁸ - Pro или Arg; и X⁹ - Thr.

В четвертом аспекте настоящего изобретения приводится полностью человеческое антитело или фрагмент антитела, с которым связывается hDll4 с концентрацией IC₅₀ менее 10 нМ, согласно результатам измерения in vitro или анализа блокирования Dll4 на основе ELISA (описано ниже). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения IC₅₀ антитела составляет приблизительно 500 пМ или менее. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения IC₅₀ антитела составляет приблизительно 100 пМ или менее.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения приводится полностью человеческое моноклональное антитело, которое специфическим образом связывает и ингибирует Dll4 человека и имеет IC₅₀ менее или равное приблизительно 150 пМ, 100 пМ, 75 пМ или 50 пМ, согласно результатам измерения биологической активности индуцируемой Notch-рецептором люциферазы с hDll4-Fc. Как показано в разделе примеров ниже, антитела против hDll4 настоящего изобретения не вступают в перекрестную реакцию с близкородственными дельта-белками, такими как hDll1 и hDll3.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу человека или его антиген-связывающей области, которые связывают hDll4 с константой аффинности (K_D) менее чем приблизительно 500 пМ, предпочтительнее менее чем приблизительно 300 пМ, еще предпочтительнее менее чем приблизительно 100 пМ, менее чем приблизительно 50 пМ, менее чем приблизительно 10 пМ, по данным поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE™), например, с применением димерного hDll4 (таблица 2).

Настоящее изобретение относится к антителу против hDll4 с модифицированной картиной гликозилирования. В некоторых случаях может оказаться полезным удалить нежелательные сайты гликозилирования или использовать антитело без фукозного фрагмента в олигосахаридной цепи, например для усиления функции антителозависимой клеточно-обусловленной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В других вариантах использования может осуществляться модификация галактозилирования, с тем чтобы изменить комплементзависимую цитотоксичность (CDC).

Настоящее изобретение относится к антителам против hDll4, которые связывают конкретные эпитопы hDll4 и способны блокировать биологическую активность hDll4. Внеклеточный домен Dll4 состоит из N-терминального домена, домена Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) и восьми тандемных ЭФР (эпидермальный фактор роста) - подобных повторов. В общем, ЭФР домены находятся примерно в области аминокислотных остатков 218-251 (домен 1), 252-282 (домен 2), 284-322 (домен 3), 324-360 (домен 4) и 362-400 (домен 5), домен DSL - примерно в области аминокислотных остатков 173-217, а N-терминальный домен - примерно в области аминокислотных остатков 27-172 hDll4 (SEQ ID №: 2).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения блокирующее антитело по изобретению связывается с аминокислотными остатками с 27 по 524 последовательности SEQ ID №: 2. В более конкретном варианте осуществления блокирующее антитело по изобретению связывается с эпитопом в N-терминальном-DSL доменах 27-217 последовательности SEQ ID №: 2; в еще более конкретном варианте осуществления блокирующее антитело связывается с эпитопом примерно в области аминокислотных остатков 27-172 (N-терминальный домен) или 173-217 (домен DSL). В другом варианте осуществления блокирующее антитело по изобретению связывается с эпитопом ЭФР-2 примерно в области аминокислотных остатков 252-282 последовательности SEQ ID №: 2.

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей рекомбинантное антитело против hDll4 человека и приемлемый носитель. Изобретение также включает векторы и состоящие из клеток-хозяев векторы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитело против hDll4 человека по настоящему изобретению, а также способы получения таких новых антител, заключающиеся в культивировании клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против hDll4 человека по настоящему изобретению или фрагмент такого антитела, в условиях, допускающих продукцию белка и выделение продуцированного таким образом белка.

В шестом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования активности hDll4 с помощью приведенного в настоящем изобретении антитела или его антиген-связывающей области. В одном из вариантов осуществления способ включает взаимодействие hDll4 с антителом по настоящему изобретению или его антиген-связывающей областью таким образом, что при этом происходит ингибирование активности hDll4 в результате связи с Notch-рецептором, например рецептором Notch-1. В другом варианте осуществления способ включает введение антитела по настоящему изобретению или его антиген-связывающей области человеку, страдающему нарушением, состояние при котором улучшается при ингибировании активности Dll4. Такие нарушения включают болезни или патологические состояния, которые могут быть купированы, облегчены, ослаблены или предотвращены за счет блокирования, ингибирования или снижения активности Dll4, например патологическое развитие кровеносной сети, связанное с ангиогенезом в опухолях и раком, иммунодефицитные состояния, отторжение трансплантатов или воспаление, а также нейродегенеративные нарушения, например связанные с прионными заболеваниями. Настоящее изобретение также предусматривает использование антитела или антиген-связывающей области антитела в соответствии с приведенным выше описанием при производстве лекарственных препаратов, применяемых для смягчения или ингибирования заболеваний или нарушений в организме человека, опосредованных Dll4.

Другие цели и преимущества станут очевидными при ознакомлении с приведенным ниже подробным описанием.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Прежде чем переходить к описанию представляемых способов, необходимо отметить, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными способами и изложенными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут меняться. Следует также понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена исключительно для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не носит ограничительного характера, поскольку охват настоящего изобретения будет лимитироваться только прилагаемыми пунктами формулы изобретения.

Использование в данном описании и в прилагаемых пунктах формулы изобретения единственного числа подразумевает ссылку на множественное число, за исключением случаев, когда из контекста явно следует обратное. Так, например, упоминание «способа» подразумевает один или несколько способов и/или стадий описанного в тексте типа, и/или методов или стадий, которые будут очевидны специалистам в данной области при ознакомлении с описанием настоящего изобретения.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, которое общеизвестно рядовым специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя на практике или при проверке настоящего изобретения могут использоваться любые способы и материалы, аналогичные или идентичные описанным в настоящем документе, ниже приводится описание предпочтительных способов и материалов.

Определения

Термины «дельта-подобный лиганд-4», «Dll4», «hDll4» являются взаимозаменяемыми при обозначении белка, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID №: 1, и белка, содержащего последовательность аминокислоты SEQ ID №: 2.

Используемый в настоящем документе термин «антитело» предназначен для обозначения молекул иммуноглобулина, составленных из четырех полипептидных цепей, при этом две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи связываются друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе HCVR, или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе LCVR, или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена: CL. Области VH и VL могут далее подразделяться на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), перемежаемые областями с более высоким уровнем консервативности, называемыми остовными областями (FR). Каждая область VH и VL образована тремя CDR и четырьмя FR, расположенными от амино-терминального конца к карбокси-терминальному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Используемый в настоящем документе термин «антитело высокой аффинности» относится к антителам, имеющим аффинность связывания с hDll4 не менее 10^-8М; предпочтительно 10^-9М; еще более предпочтительно 10^-10М, по результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™, или результатам измерения аффинности в растворе методом иммуноферментного анализа (ELISA).

Под используемым в настоящем документе термином “медленно диссоциирующее” или “Koff” подразумевается антитело, комплекс которого с hDll4 диссоциирует с константой скорости 1×10^-3 сек^-1 или ниже, предпочтительно 1×10^-4 сек^-1 или ниже, по результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™.

Под используемым в настоящем документе термином «нейтрализующее», или «блокирующее» антитело понимается антитело, связывание которого с Dll4 приводит к ингибированию биологической активности Dll4. Такое ингибирование биологической активности Dll4 может оцениваться посредством измерения одного или нескольких показателей биологической активности Dll4. Данные показатели биологической активности Dll4 могут оцениваться при помощи одного или нескольких методов анализа in vitro или in vivo, известных специалистам (см. примеры ниже). Способность антитела нейтрализовать активность Dll4 предпочтительно должна оцениваться по ингибированию связывания Dll4 с Notch-рецептором.

Используемый в настоящем документе термин «антиген-связывающая область» антитела (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела») обозначает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном (например, hDll4). Было показано, что антиген-связывающая функция антитела может осуществляться фрагментами всей последовательности антитела. К примерам связывающих фрагментов, включенных в термин «антиген-связывающая область» антитела, относятся (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')₂, бивалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH отдельной области антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), состоящий из домена VH; и (vi) изолированный CDR. Более того, несмотря на то что два домена во фрагменте Fv, VL и VH кодируются различными генами, их можно объединить, используя рекомбинантные технологии, посредством синтетического линкера, который позволяет построить из них единую белковую цепочку, в которой области VL и VH связываются с образованием моновалентных молекул (известных как одиночная цепь Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включаются в сферу охвата термина «антиген-связывающая область» антитела. Сюда же входят и другие формы одноцепочечных антител, например диатела. Диатела представляют собой бивалентные биспецифичные антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но длина соединяющего их линкера слишком мала для связывания двух доменов на одной и той же цепи, что заставляет домены одной цепи связываться с комплементарными доменами другой цепи, создавая тем самым два сайта связывания антигена (см., например, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Далее, антитело или его антиген-связывающая область могут быть частью более крупной иммуноадгезивной молекулы, образованной ковалентной или нековалентной ассоциацией антитела или части антитела и одной или несколькими другими белковыми молекулами или пептидами. Примеры таких иммуноадгезивных молекул включают использование области ядра стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101), и использование остатка цистеина, маркера-пептида и C-терминальной полигистидиновой метки для получения бивалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Части антител, такие как фрагменты Fab и F(ab')₂, могут быть получены из цельных антител с помощью стандартных методик, таких как папаиновое и пепсиновое расщепление цельных антител соответственно. Кроме того, антитела, части антител и иммуноадгезивные молекулы могут быть получены с использованием стандартных технологий рекомбинантной ДНК, как описано в настоящем документе.

Используемый в настоящем документе термин «антитело человека» предназначен для обозначения антител с вариабельной и константной областями, полученных из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевых линий человека. Описываемые в данном изобретении антитела человека могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые иммуноглобулиновыми последовательностями зародышевых линий человека (например, мутации, вызванные случайным или сайт-специфичным мутагенезом in vitro или соматическими мутациями in vivo), например, в областях CDR, особенно в области CDR3. Однако используемый в настоящем документе термин "антитело человека" не подразумевает включения антител, в которых на зародышевые последовательности человека привиты CDR последовательности, полученные из зародышевых линий другого вида млекопитающих, например мыши.

Используемый в настоящем документе термин "рекомбинантное антитело человека" подразумевает включение всех типов антител человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с использованием рекомбинантных технологий, в том числе антител, экспрессируемых с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфектированного в клетку-хозяина (как описано ниже), антител, выделенных из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека (как описано ниже), антител, выделенных из животного (например, мыши), трансгенного по отношению к генам иммуноглобулина человека (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), а также антител, полученных, экспрессированных, созданных или выделенных с использованием любых других методов, использующих сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека на другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельную и константную области, полученные из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевых линий человека. В ряде осуществлений, однако, такие рекомбинантные антитела человека подвергаются мутагенезу in vitro (либо, при использовании животных, трансгенных по иммуноглобулину человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител оказываются последовательностями, которые, хотя и получены из последовательностей VH и VL областей зародышевых линий человека, а также связаны с ними, могут отсутствовать в естественно существующем in vivo наборе последовательностей зародышевых линий человека.

Используемый в настоящем документе термин "выделенное антитело" предназначен для обозначения антитела, существенно свободного от других антител, обладающих иной антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфично связывает hDll4, существенно свободно от антител, которые специфично связывают антигены, отличные от hDll4). Выделенное антитело, которое специфично связывает hDll4, тем не менее может иметь перекрестную реактивность к другим антигенам, например молекулам hDll4 из других видов. Более того, выделенное антитело может быть существенно свободно от иных клеточных материалов и/или химических реагентов.

Используемый в настоящем документе термин «поверхностный плазмонный резонанс» относится к оптическому явлению, которое позволяет проводить анализ биоспецифических взаимодействий в реальном времени за счет детектирования изменений концентраций белка в биосенсорной матрице, например с помощью системы Biscoe™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.).

Используемый в настоящем документе термин «K_D» предназначен для обозначения константы диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.

Используемый в настоящем документе термин “эпитоп” включает любую детерминанту, предпочтительно полипептидную детерминанту, способную к специфичному связыванию с иммуноглобулином или рецептором Т-клетки. В ряде осуществлений эпитопные детерминанты включают химически активные группировки на поверхности молекул, таких как аминокислот, боковых цепей сахаров, фосфорильных групп или сульфонильных групп, и в ряде осуществлений могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические зарядовые характеристики. Эпитоп представляет собой область антигена, в которой происходит связывание с антителом. В ряде осуществлений считается, что антитело специфично связывается с антигеном, если оно предпочтительно опознает свою антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения считается, что антитело специфично связывается с антигеном, если равновесная константа диссоциации не превышает 10^-8М, более предпочтительно, если равновесная константа диссоциации не превышает 10^-9М, и наиболее предпочтительно, если равновесная константа диссоциации не превышает 10^-10 М.

Белок или полипептид является "существенно чистым", "существенно однородным" или "существенно очищенным", если по крайней мере примерно от 60 до 75% образца содержит один вид полипептида. Полипептид или белок может быть мономерным или мультимерным. Существенно чистый полипептид или белок обычно составляет примерно 50, 60, 70, 80 или 90 весовых процентов образца белка, как правило примерно 95% и предпочтительно является чистым более чем на 99%. Чистота или однородность белка может быть доказана с помощью ряда хорошо известных в данной области методов, например электрофорезом образца белка в полиакриламидном геле с последующим получением одной полипептидной полосы при окрашивании геля одним из хорошо известных в данной области красителей. В ряде случаев для получения более высокого разрешения может использоваться ВЭЖХ или другие методы очистки, хорошо известные специалистам в данной области.

Используемый в настоящем документе термин "полипептидный аналог или вариант" относится к полипептиду, содержащему сегмент длиной не менее 25 аминокислотных остатков, который существенно совпадает с участком аминокислотной последовательности и обладает по крайней мере одним из следующих свойств: (1) специфично связывается с hDll4 в требуемых для связывания условиях, или (2) способен блокировать связывание Dll4 с Notch-рецептором. Как правило, полипептидные аналоги или варианты содержат консервативную замену (или вставку или удаление) аминокислот по сравнению с исходной естественной последовательностью. Аналоги, как правило, имеют длину не менее 20 аминокислотных остатков, предпочтительно не менее 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокислотных остатков или больше, и часто могут иметь ту же длину, что и полноразмерный естественный полипептид.

Предпочтительными для замещения аминокислот являются группы, которые: (1) снижают чувствительность к протеолизу, (2) снижают чувствительность к окислению, (3) изменяют аффинность связывания при образовании белковых комплексов, (4) изменяют аффинности связывания и (4) придают или изменяют другие физико-химические или функциональные свойства таких аналогов. Аналоги могут содержать различные мутации последовательности по сравнению с естественной пептидной последовательностью. Например, в исходной естественной последовательности (предпочтительно в области полипептида за пределами образующих межмолекулярные контакты доменов) могут быть сделаны одиночные или множественные замены аминокислот (предпочтительно консервативные замены аминокислот). Консервативная замена аминокислот не должна существенно изменять структурные характеристики исходной последовательности (например, заменяющая аминокислота не должна способствовать разрыву имеющейся в исходной последовательности спирали или иным образом нарушать составляющие элементы вторичной структуры, характерной для исходной последовательности). Примеры общепринятых в данной области элементов вторичной и третичной структуры полипептидов описаны в книгах «Proteins, Structures and Molecular Principles» (Creighton 1984 W. H. Freeman and Company, New York), «Introduction to Protein Structure» (Branden & Tooze, eds., 1991, Garland Publishing, NY), а также в Thornton et at. 1991 Nature 354:105.

Непептидные аналоги широко используются в фармацевтической отрасли в качестве лекарственных препаратов со свойствами, аналогичными свойствам исходного пептида-матрицы. Подобные непептидные соединения получили название "миметики пептидов" или "пептидомиметики" (см. например, Fauchere (1986) J. Adv. Drug Res. 15:29; and Evans et al. (1987) J. Med. Chem. 30:1229). Систематическая замена одной или более аминокислот согласованной последовательности на D-аминокислоту того же типа (например, на D-лизин вместо L-лизина) может также использоваться для получения более стабильных пептидов. Кроме того, известными в данной области методами (Rizo et al. (1992) Ann. Rev. Biochem. 61:387) могут быть получены пептиды с дополнительными структурными ограничениями, содержащие согласованную последовательность или существенно идентичную вариацию согласованной последовательности, например путем введения дополнительных внутренних остатков цистеина, способных к образованию внутримолекулярных дисульфидных мостиков, которые приводят к циклизации пептида.

Термин "процентная степень идентичности последовательности" в контексте последовательностей нуклеиновых кислот относится к остаткам в двух последовательностях, которые оказываются одинаковым при сопоставлении двух последовательностей для достижения максимальной согласованности. Длина участка сравнения для установления степени идентичности последовательностей может составлять не менее 9 нуклеотидов или более, обычно по крайней мере 18 нуклеотидов, более обычно по крайней мере 24 нуклеотида, как правило не менее примерно 28 нуклеотидов, более типично по крайней мере 32 нуклеотида, и предпочтительнее не менее примерно 36, 48 или более нуклеотидов. Существует несколько известных в данной области различных алгоритмов, которые могут быть использованы для измерения степени идентичности последовательностей нуклеотидов. Например, полинуклеотидные последовательности могут сравниваться с использованием программ FASTA, Gap или Bestfit, входящих в пакет Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis. Набор программ FASTA, включающий, например, программы FASTA2 и FASTA3, позволяет выполнить сопоставление и определить процентную степень идентичности последовательности областей наилучшего перекрывания между заданной и исследуемой последовательностями (Pearson (1990) Methods Enzymol. 183:63-98 and (2000) Methods Mol. Biol. 132:185-219). Если не оговорено особо, для программ и алгоритмов используются стандартные параметры по умолчанию. Например, для определения процентной степени идентичности последовательности нуклеиновых кислот можно использовать программы FASTA со своими параметрами по умолчанию (размер слова 6 и опция NOPAM для построения матрицы оценки) или программы Gap со своими значениями по умолчанию, указанными в пакете GCG Version 6.1.

Ссылка на последовательность нуклеиновой кислоты подразумевает одновременно и комплементарную последовательность, если иное не оговорено явно. Так, ссылка на молекулу нуклеиновой кислоты с конкретной последовательностью нуклеотидов должна пониматься также как ссылка и на комплементарную цепь с комплементарной последовательностью. В общем, в данной области термины "процентная степень идентичности последовательности", "процентное сходство последовательностей" и "процент гомологичности последовательностей" считаются взаимозаменяемыми. В настоящем документе эти термины будут иметь то же значение в отношении последовательностей нуклеиновых кислот.

Термин «существенная аналогичность» или «по существу аналогичны» в отношении нуклеиновой кислоты или ее фрагмента означает, что при оптимальном сопоставлении с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью) с соответствующими добавлениями или делециями наблюдается идентичность нуклеотидной последовательности на уровне не менее приблизительно 90%, предпочтительно не менее приблизительно 95%, более предпочтительно не менее приблизительно 96%, 97%, 98% или 99% оснований нуклеотидов, что измеряется с помощью любого известного алгоритма идентичности последовательностей, например FASTA, BLAST или Gap, которые описывались выше.

Применяемый в отношении полипептидов термин «существенная идентичность» или «по существу идентичные» означает, что две пептидные последовательности при их оптимальном сопоставлении, например с помощью программ GAP или BESTFIT с учетом вклада пропусков, демонстрируют не менее 80% идентичности последовательностей, более предпочтительно не менее 90% или 95% идентичности последовательностей и еще более предпочтительно не менее 98% или 99% идентичности последовательностей. Предпочтительно положение неидентичных остатков отличается лишь консервативным замещением аминокислот. «Консервативное замещение аминокислот» - это такое замещение, при котором один аминокислотный остаток замещается другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (группу R) с аналогичными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). В общем случае, консервативное замещение аминокислот не будет приводить к существенным изменениям функциональных свойств белка. В случае если две или более аминокислотные последовательности отличаются друг от друга консервативным замещением, процент идентичности последовательности или степень аналогичности может корректироваться в сторону увеличения, с тем чтобы учесть консервативный характер замещения. Способы такой корректировки хорошо известны специалистам в данной области. См. например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. К примерам групп аминокислот, имеющих боковые цепи с аналогичными химическими свойствами, относятся 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические гидроксилированные боковые цепи: серин и треонин; 3) боковые цепи с амидной группой: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) боковые цепи со свойствами основания: лизин, аргинин и гистидин; и (6) серосодержащие боковые цепи - цистеин и метионин. Предпочтительными группами для консервативного замещения аминокислот являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. В альтернативном варианте консервативное замещение представляет собой любое изменение, приводящее к положительному значению в логарифмической матрице вероятностей PAM250, описанной в работе Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. «Умеренно консервативным» замещением называется любое изменение, приводящее к неотрицательному значению в логарифмической матрице вероятностей PAM250.

Подобие последовательностей полипептидов, которое также называют идентичностью последовательностей, обычно определяют с помощью программного обеспечения для анализа последовательности. Программа для анализа белков сопоставляет подобные последовательности с использованием показателей аналогичности, задаваемых для различных замещений, делеций и других модификаций, в том числе для консервативного замещения аминокислот. Например, программное обеспечение GCG содержит такие программы, как Gap и Bestfit, которые могут использоваться с параметрами по умолчанию для определения гомологии последовательности или идентичности последовательности между близкородственными полипептидами, например гомологичными полипептидами различных видов организмов или между исходным белком и его мутантом. См., например, GCG Вер. 6.1. Полипептидные последовательности могут также сопоставляться с помощью FASTA - программы, включенной в GCG Вер. 6.1, - с использованием параметров по умолчанию или рекомендуемых параметров. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает сопоставление и определяет процент идентичности последовательностей в областях с наибольшим перекрыванием между заданной и исследуемой последовательностями (см. выше Pearson (2000)). Другим предпочтительным алгоритмом сопоставления последовательности настоящего изобретения с базой данных, содержащей большое число последовательностей различных организмов, является компьютерная программа BLAST, особенно BLASTP или TBLASTN, которая использует параметры по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402.

Длина полипептидных последовательностей, сравниваемых для определения степени гомологии, как правило, составляет не менее примерно 16 аминокислотных остатков, обычно не менее примерно 20 остатков, чаще всего не менее примерно 24 остатков, в большинстве случаев не менее примерно 28 остатков и предпочтительно более 35 остатков. При поиске в базе данных, содержащих последовательности из большого количества различных организмов, предпочтительно сравнивать последовательности аминокислот.

Получение антител человека

К методам получения антител человека относятся, например, VELOCIMMUNE^® (Regeneron Pharmaceuticals), технология XENOMOUSE™ (Abgenix), «минилокусный» метод и фаговый дисплей. Технология VELOCIMMUNE^® (патент US 6596541) включает метод получение полностью человеческих антител с высокой специфичностью по отношению к выбранному антигену. Данная технология предполагает получение трансгенных мышей с геномом, содержащим вариабельные области тяжелой и легкой цепи человека, которые функционально связаны с эндогенными локусами константной области мыши, так что в ответ на антигенную стимуляцию мышь продуцирует антитело, содержащее вариабельную область человека и константную область мыши. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела, выделяют и функционально связывают с ДНК, кодирующей константные тяжелые и легкие цепи человека. Затем ДНК экспрессируют в клетке, которая в состоянии экспрессировать полностью человеческое антитело. В конкретном варианте осуществления такой клеткой является клетка СНО.

Технологией XENOMOUSE™ (Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21) получают мышь, обладающую как вариабельной, так и константной областями человека из локусов тяжелой цепи и легкой цепи каппа. В другом варианте использовался подход «минилокус», в котором экзогенный локус Ig имитировался путем включения индивидуальных генов из локуса Ig (см., например, патент US 5545807). Выделенная ДНК, кодирующая вариабельные области, может иметь или не иметь функциональную связь с ДНК, кодирующей константные тяжелые и легкие цепи человека.

Известны также другие методы производства антител человека, в том числе путем получения от донора. См., например, GCG Вер. 6787637.

Антитела могут использоваться в терапевтических целях для блокирования лиганд-рецепторного взаимодействия или ингибирования взаимодействия рецепторных компонентов вместо уничтожения клеток за счет фиксации комплемента и участия в клеточно-обусловленной цитотоксичности (CDC). Константная область антитела важна для обеспечения способности антитела фиксировать комплемент и участвовать в CDC или непосредственном уничтожении клеток за счет антителозависимой клеточно-обусловленной цитотоксичности (ADCC). Поэтому изотип антитела можно выбирать в зависимости от того, насколько желательно, чтобы антитело фиксировало комплемент.

Иммуноглобулины человека могут существовать в двух формах, что связано с гетерогенностью шарнирной области. В одной из форм молекула иммуноглобулина содержит стабильную четырехцепочечную конструкцию весом примерно 150-160 кДа, в которой димеры удерживаются связывающим тяжелые цепи дисульфидным мостиком. Во второй форме димеры не связаны межцепочечным дисульфидным мостиком, и образуется молекула с приблизительным весом 75-80 кДа, состоящая из одной легкой и тяжелой цепи. Разделение этих форм было сопряжено с трудностями, даже после аффинной очистки.

Частота проявлений второй формы в различных изотипах интактного IgG вызвана, кроме прочего, структурными различиями, связанными с изотипом шарнирной области антитела. Действительно, замена одной аминокислоты в шарнирной области человеческого IgG4 может существенно снизить долю второй формы (Angal et al. 1993, Molecular Immunology 30:105) до уровней, обычно характерных при использовании шарнирной области человеческого IgG1. В сферу охвата настоящего изобретения входят антитела, имеющие одну или несколько мутаций в шарнирной области, областях CH2 или CH3, которые могут быть желательны, например, при продуцировании антител для повышения выхода или для модулирования эффекторных функций.

Антитела по настоящему изобретению предпочтительно получаются с использованием технологии VELOCIMMUNE^®. Трансгенные мыши, у которых вариабельные области тяжелой и легкой цепей эндогенного иммуноглобулина заменяются соответствующими вариабельными областями человека, стимулируются представляющим интерес антигеном, и у мыши, экспрессирующей антитела, берутся лимфатические клетки (например, В-клетки). Лимфатические клетки могут сливаться с линией миелоидных клеток для получения иммортализованных линий клеток гибридомы, и такие линии клеток гибридомы проходят скрининг и селекцию для идентификации тех линий клеток гибридомы, которые продуцируют антитела, специфические к представляющему интерес антигену. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела, можно выделить и связывать с нужными изотипическими константными областями тяжелой и легкой цепей. Такой белок антитела может продуцироваться в клетке, например в клетке СНО. В альтернативном варианте ДНК, кодирующую антигенспецифические химерные антитела, можно выделить непосредственно из антигенспецифических лимфоцитов. В различных вариантах осуществления трансгенная мышь содержит 12 функциональных вариабельных генов тяжелой цепи человека и 11 функциональных вариабельных генов каппа легкой цепи человека; от 25 до 30 вариабельных генов тяжелой цепи человека и от 18 до 20 вариабельных генов каппа легкой цепи человека; от 43 до 48 вариабельных генов тяжелой цепи человека и от 20 до 22 вариабельных генов каппа легкой цепи человека; или примерно 80 вариабельных генов тяжелой цепи человека и примерно 40 вариабельных генов каппа легкой цепи человека.

В общем случае антитела по настоящему изобретению обладают очень высокой аффинностью, как правило с K_D от примерно 10^-9 до примерно 10^-11M, если измерять по связыванию с антигеном, иммобилизованным на твердой подложке или анализируемым в растворе. Константные области мыши заменяются желаемыми константными областями человека, с тем чтобы получить полностью человеческие антитела, описанные в настоящем изобретении, например исходный или модифицированный IgG1 или IgG4 (например, SEQ ID №: 950, 951, 952). Выбранная константная область может меняться в зависимости от конкретного осуществления, а свойства высокой аффинности антиген-связывания и необходимая специфичность определяются вариабельной областью.

Рак, инфекционные заболевания, аутоиммунные нарушения, иммунодефицитные состояния, отторжение трансплантатов, воспаления, травмы и дегенеративные нарушения можно лечить посредством модуляции иммунной системы. В случае болезней, связанных с неправильным функционированием или излишней активностью иммунной системы, таких как аутоиммунные нарушения и воспаления, положительный эффект может быть достигнут за счет подавления функций иммунных клеток или снижения их количества. Для этого можно использовать либо блокирование положительных сигналов, либо стимулирование отрицательных сигналов для популяций иммунных клеток, критически важных для протекания данного заболевания, например T-клеток, B-клеток, NK-клеток, нейтрофилов, макрофагов, антиген-представляющих клеток, мастоцитов или клеток других типов. Для подавления повышенной активности может также использоваться элиминация популяций различных иммунных клеток путем стимулирования апоптоза, направленного воздействия на специфические поверхностные рецепторы элиминирующими антителами или конъюгатами антитело-лекарство, а также блокирования или изменения дифференцировки линий иммунных клеток или конкретных типов клеток. Неэффективность или пониженная активность иммунной функции может приводить к возникновению или осложнению таких заболеваний, как рак, инфекционные болезни и другие иммунодефицитные состояния. С пониженной активностью иммунной системы можно бороться путем активирования иммунных клеток, стимулируя положительные сигналы с помощью кросс-сшивки или агонистические антитела, либо блокируя отрицательные сигналы. Повышение популяции иммунных клеток может быть достигнуто путем стимуляции развития некоторых или всех линий дифференцировки иммунных клеток, блокирования апоптоза или устранения ингибиторных сигналов. В конкретном приложении антитела по настоящему изобретению полезны для лечения, подавления или облегчения таких состояний или болезней, как, например, рак, иммунодефицитные состояния, отторжение трансплантата или воспаление.

Эпитопное картирование и связанные с ним технологии

Для скрининга антител, которые связываются с конкретным эпитопом (например, блокирующих связывание IgE с соответствующим рецептором, обладающим высокой аффинностью), можно проводить стандартный перекрестный конкурентный анализ (cross-blocking) подобно описанному в Harlow and Lane (1990) выше. К другим методам относятся мутанты сканирования аланина, пептидный блоттинг (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), и анализ расщепления пептидов. Кроме того, могут использоваться такие методы, как вырезание эпитопа, экстракция эпитопа и химическая модификация антигенов (Tomer (2000) Protein Science: 487-496).

Используемый в настоящем документе термин "эпитоп" относится к сайту антигена, на который реагируют B- и/или T-клетки. Эпитопы B-клеток могут быть образованы как непрерывной последовательностью аминокислот, так и разрозненными аминокислотами, оказавшимися в требуемом взаимном положении в результате фолдинга белка в третичную структуру. Эпитопы, образованные непрерывной последовательностью аминокислот, как правило, сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, возникшие в результате фолдинга белка в третичную структуру, разрушаются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, формируется по крайней мере 3, а обычно по крайней мере 5 или 8-10 аминокислотами в уникальной пространственной конформации.

Определение профиля с помощью модификации (MAP), также известное как определение профиля антител на основе структуры антигена (ASAP), представляет собой метод классификации большого числа моноклональных антител (mAbs) к одному и тому же антигену в соответствии со сходствами профиля связывания каждого антитела с химически или энзиматически модифицированными антигенными поверхностями (публикация патента США No. 2004/0101920). Каждая категория может отражать уникальный эпитоп, который либо четко отличается от эпитопа, представленного в любой другой категории, либо частично перекрывается с ним. Подобная технология позволяет быстро отделять генетически идентичные антитела, так что их идентификация может быть сконцентрирована на генетически отличающихся антителах. В случае применения для скрининга гибридомы MAP может способствовать идентификации редких клонов гибридомы, производящих mAbs с нужными характеристиками. MAP может использоваться для сортировки антител hDll4 по настоящему изобретению в группы антител, связывающих различные эпитопы.

К агентам, используемым для изменения структуры иммобилизованных антигенов, относятся ферменты, например протеолитические ферменты, такие как трипсин, эндопротеиназа Glu-C, эндопротеиназа Asp-N, химотрипсин и т.п. К агентам, используемым для изменения структуры иммобилизованных антигенов, также могут относиться химические вещества, такие как сукцинимидные эфиры и их производные, первичные аминосодержащие соединения, гидразины и карбогидразины, свободные аминокислоты и т.п.

Антигенный белок может иммобилизироваться на поверхностях чипа биосенсора или полистирольных гранулах. Последние могут анализироваться, например, с использованием метода мультиплексного анализа LUMINEX™ (Luminex Corp., Austin, TX). Поскольку LUMINEX™ позволяет проводить мультиплексный анализ до 100 различных типов гранул, он обеспечивает почти бесконечную антигенную поверхность с различными модификациями, что гарантирует более высокое разрешение профилирования эпитопов антител по сравнению с анализом на биосенсорах.

Терапевтическое применение и составы препаратов

Введение терапевтических препаратов в соответствии с настоящим изобретением осуществляется в подходящих носителях, наполнителях и прочих веществах, которые включаются в состав препаратов, чтобы обеспечить более эффективное распространение, доставку, переносимость и т.п. Множество соответствующих составов можно найти в формулярах, известных всем специалистам в области фармацевтической химии: Remington's Pharmaceutical Sciences (15^th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA). К таким препаратам, например, относятся порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, липидсодержащие (катионные или анионные) везикулы (например, LIPOFECTIN™), конъюгаты ДНК, безводные абсорбционные пасты, эмульсии масло-в-воде и вода-в-масле, эмульсии карбовакса (полиэтиленгликоли различного молекулярного веса), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. Любая из приведенных выше смесей может подходить для лечения и проведения терапии в соответствии с настоящим изобретением при условии, что активный ингредиент состава не инактивируется компонентами препарата и что состав является физиологически совместимым и приемлемым для способа введения. См. также в Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52:238-311 и в цитируемой там литературе дополнительную информацию, касающуюся наполнителей и носителей, хорошо известных специалистам в области фармацевтической химии.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение антител человека к рецептору человека Dll4.

Мыши могут быть иммунизированы с помощью любого метода, известного специалистам в области (см., например, Harlow and Lane выше). В одном из вариантов осуществления изобретения мышам, полученным при помощи VELOCIMMUNE®, вводится непосредственно антиген hDll4, который содержит локусы ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи человеческого Ig и вариабельные области легкой цепи каппа, в адъюванте для стимулирования иммунного ответа. Такой адъювант включает полный и неполный адъювант Фрейнда, систему адъюванта MPL+TDM (Sigma) или RIBI (мурамил-дипептид) (см. O'Hagan (2000) Vaccine Adjuvant, by Human Press, Totawa, NJ). Выработка антител в качестве иммунного ответа контролируется стандартными методами антиген-специфичного иммуноанализа. После получения нужного иммунного ответа антитело-экспрессирующие В-клетки собирали и объединяли с клетками миеломы мыши для сохранения их жизнеспособности, с образованием линий клеток гибридомы. Такие линии клеток гибридомы проходят скрининг и селекцию для идентификации тех линий клеток, которые продуцируют антитела к представляющему интерес антигену, используя анализы, описанные ниже.

Альтернативным методом является выделение клеток гибридомы для представляющего интерес антигена способом проточной цитометрии. После объединения с клетками миеломы собранные вместе клетки гибридомы выращивали в течение 10 дней в гипоксантин-аминоптеринтимидиновой среде. Затем клетки собирали и окрашивали меченым биотином Dll4 при концентрации 2 мг/мл в течение 1 часа, с последующим добавлением фикоэритрин-стрептавидина. Флуоресцентно-меченые клетки сортировали методом проточной цитометрии (одна клетка на лунку в 96-луночном планшете со средой для выращивания клеток гибридомы), культивировали 8-10 дней, затем проводили скрининг в кондиционированной среде на наличие функционально желательных моноклональных антител, как описано ниже.

Антитела против hDll4 получали прямым выделением спленоцитов. Антиген-специфичные антитела можно также выделять напрямую из антиген-иммунизированных B-клеток без объединения с клетками миеломы, как описано в патенте США 2007/0280945 A1. Из выделенных рекомбинантов получали стабильные CHO клеточные линии с экспрессией рекомбинантных антител.

Пример 2. Определение антиген-связывающей аффинности антигена.

Константы диссоциации (величины K_D) комплексов антигена с рядом описанных выше антител определяли поверхностной кинетикой методом плазмонного резонанса на поверхности биосенсора в реальном времени (BIACORE™ 2000). Антитело удерживали на поверхности поликлонального антимышиного антитела козы IgG, образованной посредством прямого химического связывания с чипом BIACORE™ для формирования поверхности связанного антитела. На поверхность захваченных антител наносили мономерные hDll4 или димерные hDll4-hFc в различных концентрациях, и связывание и диссоциация комплекса антигена - антитела контролировали в реальном времени. Расчет K_D, констант скорости диссоциации и полупериода диссоциации комплекса антиген/антитело осуществляли при помощи кинетического анализа (таблица 1). Аналогичный метод использовали и для определения характеристик полученных из одиночных моноклональных антител B-клеток, модифицированных введением константного домена IgG человека. Антитела вводили в контакт с содержащим анти-hFc поликлональные тела козы реагентом (Jackson Immuno Research Lab), иммобилизованным на поверхности чипа BIACORE™, и обрабатывали димерным белком Dll4-mFc или мономерным белком Dll4 (таблица 2).

Аффинность связывания комплекса антиген-антитело также может быть определена путем конкурентного анализа в растворе на основе ELISA. Вкратце: антитела (в виде очищенных белков или в кондиционированной среде) предварительно смешивали на 96-ячеечном титрационном микропланшете с последовательным разбавлением антигенного белка (мономерного или димерного) в пределах от 0 до 10 мкг/мл, при постоянной концентрации антитела. После 2 часов инкубирования антигена с антителом растворы переносили на титрационный микропланшет с предварительно нанесенным антигеном для определения свободного антитела (MAXISORB™, VWR, West Chester, PA). На планшет наносили раствор 1 мкг/мл белка hDll4-hFc в фосфатно-солевом буфере, планшет выдерживали в течение ночи при температуре 4°C, неспецифичные сайты связывания блокировали обработкой БСА в течение двух часов. После переноса и инкубации в течение часа планшет промывали, и связанные с поверхностью планшета антитела определяли с помощью реагента, содержащего конъюгат пероксидазы хрена и поликлонального антимышиного IgG антитела козы (Jackson Immuno Laboratory), и проявляли с помощью колориметрических субстратов (OPTEIA™; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Ферментативную реакцию останавливали 1М раствором фосфорной кислоты, измеряли оптическое поглощение на 450 нм, полученные данные анализировали в модели сигмоидальной зависимости отклика от дозы, определенные таким образом концентрации IC₅₀ приведены ниже (таблица 1).

ТАБЛИЦА 1 Антитело K_D Dll4 (нМ) K_D Dll4-Fc (нМ) IC₅₀ Dll4-Fc (нМ) 13B6 2,79 0,188 0,06 15E10 0,55 0,023 0,58 22G12 1,29 0,076 0,03 24C8 0,52 0,047 0,01 VAV 2H4-19 1,51 0,611 0,10 VAV 4H10-9 13,70 0,662 0,30 VAV 7B9-9 0,88 0,021 0,27 VAW 10E4-9 89,00 0,468 0,06 VAW 10G11-2 31,30 1,430 1,66 VAW 1C6-1 45,80 0,092 0,25 VAW 1G2-4 83,80 0,035 0,40 VAW 1H2-2 67,00 0,148 0,30 VAW 2H3-2 0,30 0,150 0,26 VAW 3A7-2 1,64 0,162 0,02 VAW 3A9-5 н.д. 2,510 16,00 VAW 3F12-8 8,12 0,648 0,07 VAW 6B8-12 0,89 0,060 0,43 VAW 6C6-2 91,70 0,092 0,50 VAW 6G12-10 3,74 0,527 0,19 VAW 7C10-11 17,10 0,853 0,28 VAW 8A10-14 1,41 0,648 0,08 VAW 8G1-12 6,09 8,300 8,60 VAW 9B11-2 62,20 0,048 0,00 VAW 9F12-6 16,00 1,350 0,02 VAW 9G10-1 56,10 0,555 0,10

ТАБЛИЦА 2 Антитело K_D Dll4 (нМ) K_D Dll4-Fc (нМ) 314266-06F12-B7 2,17 0,075 318518-01A04-D5 0,237 0,244 318518-01A10-D8 0,399 0,018 318518-01B09-C3 0,833 0,180 318518-01B11-D4 0,382 0,088 318518-01E07-H2 0,165 0,238 318518-01G04-F3 0,501 0,107 318518-01G05-B5 1,06 0,196 318518-02A07-B3 0,208 0,148 318518-02B06-E2 2,15 0,193 318518-02B08-F7 н.д. н.д. 318518-02C04-D1 0,478 0,331 318518-02F05-D10 1,28 0,035 318518-02G03-F2 1,31 0,042 318518-02G04-B11 0,813 0,048 318518-02G08-F11 н.д. н.д. 318518-03A03-B2 0,136 0,124 318518-03C10-F2 1,18 0,131 318518-03D04-B5 0,904 0,136 318518-03D07-G11 3,74 0,163 318518-03F04-A6 0,501 0,088 318518-03F06-A3 0,556 0,037 318518-03H03-F3 8,89 0,084 318518-14A06-E7 4,54 0,282 318518-14A07-C4 0,235 0,035 318518-14D08-G1 0,541 0,046 318518-14H08-A2 6,67 0,128 318518-1H08-E9 0,225 0,050

Пример 3. Ингибирование взаимодействия Dll4 с Notch-рецептором

Способность антител блокировать связывание Dll4 с Notch-рецептором оценивали методом иммуноферментного анализа на твердом носителе (ELISA). Раствор 1 мг/мл рекомбинантного белка Notch-hFc в фосфатно-солевом буфере наносили на 96-луночный планшет и выдерживали в течение ночи при температуре 4°C, неспецифичные сайты связывания блокировали обработкой БСА. Приготовленный таким образом планшет использовали для измерения свободного биотин-Dll4-hFc в растворах образцов для титрования антител. Для приготовления образцов для титрования антител одинаковое количество биотин-Dll4-hFc при концентрации 25 пМ смешивали с разными количествами антитела, либо в виде исходной неочищенной среды для кондиционирования гибридомы, либо в виде очищенного белка антитела, в диапазоне концентраций от 0 до ~50 нМ в последовательных разбавлениях, затем проводили двухчасовое инкубирование при комнатной температуре для достижения равновесия связывания антиген-антитело. После достижения равновесия растворы переносили на покрытые Notch-hFc планшеты для измерения свободного биотин-Dll4-hFc. После часовой инкубации для связывания планшет промывали, связанный биотин-Dll4-hFc определяли с помощью конъюгата перксидазы хрена и стрептавидина (Poly HRP streptavidin, Pierce Endogen) и проявляли с помощью содержащего тетраметилбензидин субстрата (BD Pharmigen). Полученные данные анализировали в программном пакете GraphPad Prism, и концентрации IC₅₀ определяли как количества антитела, требуемые для 50% снижения биотин-Dll4-hFc, связанного с нанесенным на планшет Notch-Fc (таблица 3) (*кондиционированная среда).

ТАБЛИЦА 3 Антитело IC₅₀ (нМ) VAV 2H4-19 0,01 VAW 3A7-2 0,017 VAW 9G10-1 0,019 VAW 10E4-9 0,032 VAW 8A10-11 0,04 VAW 9F12-6 0,059 VAW 3F12-8 0,066 VAW 1C6-1 0,086 VAW 1G2-4 0,11 VAW 6C6-2 0,119 VAV 7B9-4 0,123 VAW 1H2-2 0,154 VAW 2H3-2 0,168 VAW 6B8-12 0,255 VAW 6G12-10 0,257 VAW 7C10-11 0,273 VAV 4H10-9 0,599 VAW 10G11-2 0,931 VAW 3A9-5 3,8 VAW 8G1-12 10,7 VAW 9B11-2 0,069 15E10* 0,04 22G12 0,10 13B6 0,11 24C8 0,031 314266-06F12-B7 0,07 318518-01A04-D5 0,11 318518-01A10-D8 0,05 318518-01B09-C3 0,03 318518-01B11-D4 0,03 318518-01E07-H2 1,17 318518-01G04-F3 0,02 318518-01G05-B5 1,08 318518-02A07-B3 0,03 318518-02B06-E2 0,09 318518-02B08-F7 н.д. 318518-02C04-D1 0,60 318518-02F05-D10 0,16 318518-02G03-F2 0,07 318518-02G04-B11 1,09 318518-02G08-F11 н.д. 318518-03A03-B2 0,57 318518-03C10-F2 0,12 318518-03D04-B5 0,04 318518-03D07-G11 0,45 318518-03F04-A6 0,01 318518-03F06-A3 0,02 318518-03H03-F3 0,17 318518-14A06-E7 0,04 318518-14A07-C4 0,02 318518-14D08-G1 0,14 318518-14H08-A2 0,25 318518-1H08-E9 0,03

Способность выбранных очищенных антител против hDll4 блокировать связывание Dll4 с Notch-рецептором также оценивали описанным выше методом иммуноферментного анализа (ELISA), модифицированного заменой 25 пМ биотин-Dll4-hFc на 30 пМ биотин-Dll4-hFc и сокращением продолжительности инкубации антиген-антитело от двух до одного часа. Для удобства пользования антитело 318518-01A10-D8 переименовали в «REGN281» (HCVR/LCVR SEQ ID №№: 429/437 и hIgG1 SEQ ID №: 950). Протестированные производные антитела включали REGN421 (HCVR/LCVR SEQ ID №: 901/903, hIgG1 SEQ ID №: 950) и REGN422 (HCVR/LCVR SEQ ID №: 901/903 с модифицированным hIgG4 SEQ ID №: 952). Результаты приведены в таблице 4.

ТАБЛИЦА 4 Антитело IC₅₀ (нМ) REGN281 0,042 REGN421 0,045 REGN422 0,039

Способность антитела нейтрализовать опосредуемую Dll4 клеточную функцию также проверяли in vitro на экспрессирующих Dll4 эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). Ингибирование опосредуемой Notch-системой экспрессии генов hHes1 и EphB2 в клетках HUVEC производными антителами контролировали следующим образом: клетки HUVEC с малым числом пересевов культивировали в среде MCDB-131 (Vec Technologies). За день до анализа клетки HUVEC высевали с плотностью 2×10⁵ клеток на лунку на 24-луночных планшетах с общим объемом среды 1 мл. Проверяемое антитело или иной ингибитор вводили непосредственно в отдельные лунки планшета, используя по три лунки на образец, затем следовало культивирование в течение 5 часов при 37°C. По окончании периода культивирования среду удаляли и суммарную РНК выделяли с использованием лизирующего реагента QIAZOL™ и набора RNEASY™ для извлечения РНК из тканей с высоким содержанием липидов (Qiagen). Количественное определение мРНК проводили с использованием ПЦР и флуорогенного 5' нуклеазного анализа (TAQMAN® assay, Appied Biosystems). Для каждого образца синтезировали кДНК из 1-2 мг суммарной РНК. кДНК, полученная из эквивалентного количества исходной РНК (как правило 25 нг), помещали на оптические реакционные планшеты ABI PRISM™ (также с тройным повтором). Для каждого образца РНК также готовили контрольный образец без добавления обратной транскриптазы “no RT” для вычитания возможного вклада геномной ДНК в сигнал. В каждую реакцию вводили 2x Mastermix (TAQMAN® 2x PCR Mastermix; ABI) до конечной концентрации 1x. Кроме того, в каждую реакцию также вводили зонд TAQMAN® и праймеры для контролируемого гена. Каждый праймер использовали при конечной концентрации 900 нМ, зонд вводили до конечной концентрации 200 нМ. В качестве стандарта использовали геномную ДНК человека. Анализ проводили в стандартных условиях методики TAQMAN® на анализаторе ABI 7900HT. Измеренные уровни экспрессии Hes1 и EphrinB2 нормировали на эндогенный контрольный ген (циклофилин) (таблица 5). Использованные зонды и праймеры: зонд на Hes1 человека (SEQ ID №: 387); олигонуклеотиды: hHes1-869F (SEQ ID №: 388); hHes1-940R (SEQ ID №: 389), зонд на ephrinB2 человека: hEphB2-773T (SEQ ID №: 390); олигонуклеотиды: hEphB2-752F (SEQ ID №: 391); hEphB2-812R (SEQ ID №: 392); циклофилин человека: зонд: hCyclophilin-343T (SEQ ID №: 393); олигонуклеотиды: hCyclophilin-323F (SEQ ID №: 394); hCyclophilin-389R (SEQ ID №: 395).

ТАБЛИЦА 5 Антитело IC₅₀ экспрессии EphrinB2 (нМ) IC₅₀ экспрессии Hes1 (нМ) 22G12 0,379 0,381 15E10 2,56 4,49 VAW 3A7-2 0,409 0,533 314266-06F12-B7 0,239 0,405 318518-01A10-D8 0,305 0,329 318518-01G04-F3 0,088 0,172 318518-01H08-E9 0,413 0,548 318518-02A07-B3 0,398 0,128 318518-03F04-A6 0,158 0,115 318518-03F06-A3 0,304 0,692 318518-014A07-C4 0,175 0,312 318518-014D08-G1 0,510 0,568 hDll4-hFc 0,843 0,974

Тест на размножение клеток HUVEC.

Способность антител блокировать опосредуемое Dll4 ингибирование роста эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) проверяли в in vitro тесте на размножение клеток. Полученные клетки HUVEC с малым числом пересевов культивировали в среде MCDB-131 (Vec Technologies). За день до анализа на 12-луночные культуральные планшеты наносили раствор hDll4-hFc в фосфатно-солевом буфере (0,2 мкг/мл; 0,5 мл ФСБ/лунку). Планшеты выдерживали ночь при температуре 4°C и однократно промывали фосфатно-солевым буфером. На планшеты высевали клетки HUVEC с плотностью 4×10³ клеток на лунку с общим объемом среды 1,0 мл.

Для получения кривой ингибирования сразу же после высевания клеток в лунки вводили антитела против hDll4 в суммарном объеме 0,5 мл с варьируемой концентрацией. Клетки инкубировали в течение 96 часов при 37°C. Для определения численности клеток использовали реагент CCK-8 (Dojindo). Все тесты были проведены по три раза. (Таблица 6, «н.б.» - «не блокирует»)

ТАБЛИЦА 6 Антитело IC₅₀ (нМ) 15E10 0,284 VAW9B11-2 1,868 VAW8D8-12 н.б. 13B6 5,01 VAW2H4-19 н.б. VAW3A7-2 0,198 VAW8A10-14 0,214 22G12 0,888 318518-06F12-B7 2,067 318518-01A10-D8 0,096 318518-01G04-F3 0,106 318518-01H08-E9 0,188 318518-02A07-B3 0,200 318518-03F04-A6 0,184 318518-03F06-A3 0,188 318518-014A07-C4 0,159 318518-014D08-G1 0,165

Тест на Notch-индуцируемую активность люциферазы.

Для определения способности выбранных очищенных антител нейтрализовать опосредуемую Dll4 клеточную функцию был разработан in vitro тест на основе рекомбинантной клеточной линии HEK293 (ATCC), постоянно экспрессирующей Notch-1 человека и содержащей Notch-реактивный промотер, стимулирующий активность люциферазы. Степень ингибирования Notch-индуцируемой активности люциферазы определяли следующим образом: за день до анализа в каждую лунку непрозрачного 96-луночного культурального планшета пипетировали по 100 мкл 1 нМ или 1,5 нМ раствора hDll4-hFc в фосфатно-солевом буфере, планшет выдерживали ночь при температуре 4°C. Клетки высевали на планшет в среде в количестве 2×10⁴ клеток/лунку. Клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°C с очищенным белком антитела в последовательных разбавлениях в клеточной среде, начиная с 2 нМ. Активность люциферазы определяли путем добавления субстрата STEADY-GLO^® (Promega) до полного заполнения лунки (таблица 7).

ТАБЛИЦА 7 Антитело IC₅₀ (пМ) 1 нМ hDll4-hFc 1,5 нМ hDll4-hFc REGN281 50,5 78,7 REGN421 54,4 87,3 REGN422 88,2 131,1

Пример 4. Ингибирование расщепления Notch-1

Способность выбранных антител против hDll4 ингибировать расщепление Notch-1 проверяли анализом полного количества отщепленного белка Notch-1 методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE)/вестерн-блоттингом. Клетки HUVEC с малым числом пересевов культивировали, как описано выше. За день до анализа на 6-луночные планшеты наносили раствор hDll4-hFc в фосфатно-солевом буфере (0,2 мкг/мл; 1,0 мл ФСБ/лунку). Планшеты выдерживали ночь при температуре 4°C и однократно промывали фосфатно-солевым буфером. На планшеты высевали клетки HUVEC с плотностью 7,5×10⁵ клеток на лунку с общим объемом среды 2,0 мл. Сразу же после высевания клеток в лунки вводили антитела против hDll4 до конечной концентрации 10 нМ. Клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°C, затем готовили экстракты из цельных клеток, которые анализировали методом SDS-PAGE. Уровни расщепленного Notch-1 определяли с помощью анти-расщепленного Notch-1 (Val1744) антитела (Cell Signaling) и стандартных методик вестерн-блоттинга. Антитела против hDll4 проявили способность полностью блокировать расщепление Notch-1, индуцируемое нанесенным на планшет hDll4-hFc (данные не приводятся).

Пример 5. Тесты ADCC и CDC

Антителозависимую клеточно-опосредуемую цитотоксичность (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity/ADCC), индуцируемую двумя тестируемыми антителами (REGN421, REGN422), проверяли на наборе восьми линий клеток-мишеней с разными уровнями экспрессии hDll4. Использовали следующие 8 линий клеток-мишеней: (1) клетки HUVEC; (2) клетки HUVEC, стимулированные 10 нМ ФРЭС в течение 24 часов; (3) клетки Colo205; (4) рекомбинантные клетки C6 глиомы крысы, экспрессирующие eGFP; (5) рекомбинантные клетки C6 глиомы крысы, экспрессирующие hDll4; (6) рекомбинантные клетки HT1080, экспрессирующие eGFP; (7) рекомбинантные клетки HT1080, экспрессирующие hDll4; и (8) клетки HT29. Dll4 или eGFP человека встраивали в геном клетки C6 или HT1080 путем ретровирусной трансфекции. Для этого клетки каждой линии клеток-мишеней (10000 клеток/лунку в 50 мкл) сначала смешивали с равным объемом последовательно разбавленных антител REGN421 или REGN422 с получением конечной концентрации антител в диапазоне от 0,169 пМ до 10 нм и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре на 96-луночных планшетах (в качестве контроля использовали лунки без антитела). Отдельно готовили мононуклеарные клетки периферической крови человеке (PBMC, клетки-эффекторы), следуя стандартной процедуре градиентного центрифугирующего обогащения Ficoll-Hypaque. К каждой смеси антитела и клеток-мишеней добавляли примерно по 300000 клеток PBMC, создавая в результате конечное соотношение клеток-эффекторов к клеткам-мишеням примерно 30:1. Приготовленные таким образом 96-луночные планшеты затем инкубировали в течение 4 часов при 37°C, в атмосфере 5% CO₂, с последующим центрифугированием при 250g. Супернатанты собирали и тестировали на активность лактатдегидрогеназы (LDH), используя тестирующую систему для нерадиоактивного контроля цитотоксичности CYTOTOX 96^® (Promega). Результаты приведены в таблице 8. Индуцированный REGN421 зависящий от дозы лизис клеток наблюдался только в клетках C6, экспрессирующих hDll4 (колонка 5), которые демонстрировали самую высокую экспрессию hDll4 из всех исследованных линий клеток (по результатам анализа методом иммуноосаждения с последующим вестерн блотом и проточной цитометрии). Максимальная цитотоксичность клеток в линии C6-hDll4 колебалась от 20% до 60%. В остальных семи линиях клеток-мишеней индуцированный REGN421 лизис клеток не наблюдался. Антитело REGN422 не индуцировало лизиса клеток ни в одной из исследованных линий клеток-мишеней.

ТАБЛИЦА 8 Ab Максимальная цитотоксичность, % 1 2 3 4 5 6 7 8 REGN421 0 0 0 0 20-60 0 0 0 REGN422 0 0 0 0 0 0 0 0

Индуцированная REGN421 комплементарно-зависимая цитотоксичность (Complement-dependent cytotoxicity/CDC) проверялась на том же наборе клеточных линий, описанном выше. Для этого клетки каждой линии клеток-мишеней (50000 клеток/лунку в 50 мкл) сначала смешивали с равным объемом последовательно разбавленных антител REGN421 с получением конечной концентрации антител в диапазоне от 0,169 пМ до 10 нм и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре на 96-луночных планшетах. Затем в каждую лунку добавляли нормальную сыворотку крови человека с комплементарными компонентами (Quidel Corp., San Diego, CA) до получения конечной концентрации сыворотки 5%. Приготовленные таким образом 96-луночные планшеты затем инкубировали в течение 2 часов при 37°C, в атмосфере 5% CO₂, с последующим добавлением реагента CELLTITER-BLUE^® (Promega) (в качестве контроля использовали лунки без антитела и лунки с антителом, но без сыворотки). Планшеты инкубировали в течение ночи, после чего определяли степень выживания клеток (уровни цитотоксичности CDC). В качестве положительного контроля использовали клетки Daudi, обработанные ритуксимабом. Антитело REGN421 не показало цитотоксичности CDC по отношению ни к одной из исследованных клеточных линий (данные не приводятся).

Пример 6. Эпитопное картирование и специфичность

Для определения специфичности связывания с эпитопом приготовили группу из семи химерных белков Dll4, в которых специфичные домены белка Dll4 человека были следующим образом встроены в белок Dll4 мыши: №1 содержал N-терминальный и DSL домены человека (S27-Q218); №2 содержал N-терминальный, DSL и ЭФР-1 домены человека (S27-N252); №3 содержал N-терминальный, DSL, ЭФР-1 и ЭФР-2 домены человека (S27-Q283); №4 содержал N-терминальный, DSL, ЭФР-1, ЭФР-2, ЭФР-3, ЭФР-4 и ЭФР-5 домены человека; №5 содержал N-терминальный домен человека (S27-R172); №6 содержал DSL домен человека (V173-Q218); и №7 содержал ЭФР-2 домен человека (E252-D282). Химерные белки объединяли с фрагментом IgG2a-Fc мыши и экспрессировали в клетках CHO-K1. Вестерн-блоттинг собранной кондиционированной среды подтвердил экспрессию белка.

Специфичность связывания проверяемых антител с hDll4, mDll4 и химерными белками №1, №2, №3 и №4 проверяли следующим образом: очищенные антитела 22G12, VAW3A7-2 и 15E10 связывали через аминогруппу в количестве 5000-6000 RU на чипе CM5. Кондиционированную среду клеток CHO K1, содержащих химерные белки Dll4, hDll4-mFc и mDll4-mFc, последовательно наносили на чип с последующей регенерацией поверхности над покрытой антителом поверхностью. В качестве контроля на неспецифическое связывание кондиционированной среды использовали свободную аминно-связанную поверхность проточной ячейки. Результаты приводятся в таблице 9. Антитело 22G12 связывалось с эпитопом между S27-Q218 hDll4; антитело VAW3A7-2 связывалось с эпитопом между Q283-E400 hDll4; и антитело 15E10 связывалось с эпитопом между E252-D282 hDll4.

ТАБЛИЦА 9 Антитело hDll4-mFc mDll4-mFc Химерные белки 1 2 3 4 22G12 + - + + + + VAW3A7-2 + - - - - + 15E10 + - - - + +

Определяли специфичность связывания очищенного испытуемого mAb к hDll4, mDll4 и описанных выше химерных белков (REGN279=314266-6F12-B7; REGN287=318518-1G04-F3; REGN289=318518-1H08-E9; REGN290=318518-2A07-B3; REGN306=318518-3F06-A3). Для этого каждый белок Dll4 связывали (70-130 RU) на поверхности антимышиного IgG антитела козы с последующим введением испытуемого mAb в концентрации 100 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали антитело, связывающее mDll4-mFc (положительный контроль=6C10). Результаты (таблица 10) показали, что антитело REGN279 связывалось с эпитопом между S27-Q218 hDll4; антитело REGN287 связывалось между Q283-E400 hDll4; антитела REGN289, REGN290 и REGN306 связывались между S27-E400 hDll4.

ТАБЛИЦА 10 Антитело hDll4-mFc mDll4-mFc Химерные белки Dll4 человека-мыши 1 2 3 4 5 6 7 REGN279 + - + + + + + - - REGN287 + - - - - + - - - REGN289 + - + + + + - + - REGN290 + - + + + + - + - REGN306 + - + + + + - + - Контроль + + + + + + + + +

Описанным выше образом также проводили определения специфичности эпитопного связывания для следующих очищенных испытуемых антител: REGN281=318518-1A10-D8; REGN305=318518-3F04-A6; REGN309=318518-14A07-C4; REGN310=318518-14D08-G1; REGN421 и REGN422. Для этого каждый белок Dll4 связывали (240-470 RU) на поверхности антимышиного IgG антитела козы с последующим введением испытуемого mAb в концентрации 100 мкг/мл (таблица 11).

ТАБЛИЦА 11 Антитело hDll4-mFc mDll4-mFc Химерные белки Dll4 человека-мыши       1 2 3 4 5 6 7 REGN281 + - + + + + + + - REGN305 + - - - - + - - - REGN309 + - + + + - + + - REGN310 + - - - + + - + + REGN421 + - + + + + + + - REGN422 + - + + + + + + -

Вестерн-блоттинг. Специфичность связывания выбранных антител с химерными белками Dll4, белками Dll4 человека и мыши определяли вестерн-блоттингом. Для этого выполняли электрофорез hDll4-mFc (200 нг на дорожку), mDll4-mFc (200 нг на дорожку) и химерных белков №1-№7 (примерно 150 нг на дорожку) на двойных гелях (SDS-PAGE) с использованием невосстанавливающего буфера. Каждый гель затем переносили на мембрану (PVDF). Блоты сначала обрабатывали антителом REGN421 в концентрации 0,2 мкг/мл и затем конъюгатом пероксидазы хрена и антитела анти-hIgG (Pierce). Контрольные блоты обрабатывали конъюгатом перксидазы хрена и антитела анти-mFc (Pierce). Результаты: антитело REGN421 опознало hDll4-mFc и химерные белки, содержащие N-терминальный домен человека (№5), DSL домен человека (№6), или оба этих домена (№1, №2, №3 и №4). Антитело REGN421 не опознало химерный протеин, содержащий домен ЭФР-2 человека (№7).

Анализ протеазного расщепления. Связывание между антителом REGN281 и hDll4 также оценивали методом анализа защиты от протеазного расщепления с использованием жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС) на хроматомасс-спектрометре HPLC1100 (Agilent) и масс-спектрометре LCQ Classical Ion Trap Mass Spectrometer (Thermo). Для этого смесь hDll4 и REGN281 в мольном соотношении 1:5, либо только hDll4, инкубировали в течение ночи с протеазой при 25°C (для GluC протеазы) или 37°C (для трипсина). Затем каждую из полученных протеолитических смесей анализировали методом ЖХ/МС. Характерные пептидные пики, присутствующие для протеолитических смесей, выработанных в отсутствие антитела REGN281, которые уменьшались либо исчезали для протеолитических смесей, выработанных в присутствии REGN281, указывали потенциальные места связывания REGN281 с hDll4, которые защищались от протеазного расщепления при связывании REGN281 с hDll4. Эти характерные пики анализировали масс-спектроскопически. Полученные массы, ожидаемые массы и N-терминальные последовательности пептидов приведены в таблице 12.

ТАБЛИЦА 12 Пик Полученная масса Ожидаемая масса Пептид hDll4 (SEQ ID №: 2) Протеаза Домен G1 521 521,5 Phe37-Glu40 GluC N-терминал G2 1362,8 1363,4 Ala121-Glu132 GluC N-терминал T1 758 760,8 Pro49-Arg55 Трипсин N-терминал T2 587,1 587,2 Tyr169-Arg172 Трипсин N-терминал T3 1607,4 1607,6 Val173-Arg186 Трипсин DSL T4 1399 1400,7 Gly42-Arg55 Трипсин N-терминал T5 569,2 569,3 Thr56-Arg59 Трипсин N-терминал T7 2615 2613,4 Ile143-Arg166 Трипсин N-терминал T8 1807,2 1806,9 Ser27-Arg41 Трипсин N-терминал

Пример 7. Аффинность связывания очищенных антител Dll4 человека и обезьяны.

Аффинность связывания некоторых очищенных антител с мономерами Dll4, Dll4 M. facscicularis (mfDll4, SEQ IN №: 956) и Dll4 M. mulatta (mmDll4, SEQ ID №: 957) определяли при помощи BIACORE™ 2000 и 3000. Для фиксации антител REGN281, REGN421 и REGN422 использовали поликлональные анти-hFc антитела козы, иммобилизованные на поверхности чипа BIACORE™. В качестве вводимого на покрытую антителами поверхность анализируемого материала использовали различные концентрации каждого белка, hDll4 (от 12,5 нМ до 100 нМ), mfDll4 (от 3,13 нМ до 100 нМ) и mmDll4 (от 12,5 нМ до 100 нМ). Связывание антиген-антитело и диссоциация связанных комплексов наблюдали в реальном времени (таблица 13).

ТАБЛИЦА 13   ka (M-1s-1) kd (s-1) K_D (нМ)   hDll4 mfDll4 mmDll4 hDll4 mfDll4 mmDll4 hDll4 mfDll4 mmDll4 REGN281 1,56×10⁵ 6,64×10⁴ 9,27×10⁴ 2,30×10^-5 2,04×10^-5 3,05×10^-5 0,148 0,307 0,329 REGN421 1,63×10⁵ 7,28×10⁴ 9,70×10⁴ 2,17×10^-5 2,02×10^-5 3,23×10^-5 0,133 0,278 0,333 REGN422 1,64×10⁵ 8,01×10⁴ 9,27×10⁴ 2,36×10^-5 2,88×10^-5 3,41×10^-5 0,144 0,360 0,375

Аффинность связывания антител против hDll4 по отношению к димерам hDll4 и mmDll4 также определяли при помощи BIACORE™ 2000 и метода, описанного выше, с тем отличием, что hDll4 заменяли на hDll4-mFc (с 3,13 нМ до 100 нМ) или mmDll4 с mmDll4-mFc (с 0,78 нМ до 25 нМ) в качестве анализируемого материала (таблица 14).

ТАБЛИЦА 14   ka (M-1s-1) kd (s-1) K_D (нМ)   hDll4-mFc mmDll4-mFc hDll4-mFc mmDll4-mFc hDll4-mFc mmDll4-mFc REGN281 3,02×10⁵ 3,16×10⁵ 4,96×10^-6 4,64×10^-6 0,0163 0,0147 REGN421 3,43×10⁵ 3,35×10⁵ 4,70×10^-6 3,80×10^-6 0,0137 0,013 REGN422 3,46×10⁵ 4,23×10⁵ 4,60×10^-6 4,15×10^-6 0,0133 0,0098

Пример 8. Перекрестная реактивность антител с hDll1, hDll3, mDll4 и mfDll4.

Также определяли перекрестную реактивность антител к белку дельта-подобного лиганда 1 человека (SEQ ID №: 953) и белку дельта-подобного лиганда 3 человека (SEQ ID №: 954). Антитела REGN281, REGN421 и REGN422 приводили в контакт с содержащим поликлональные антитела анти-каппа человека (hK) козы реагентом (Southern Biotech), иммобилизованным на поверхности чипа BIACORE™, в качестве анализируемого материала, вводимого на покрытую антителом поверхность, использовали белок hDll4-hFc или hDll1-hFc в концентрации 100 мкг/мл. Все три антитела против hDll4 связывались только с hDll4-hFc и не связывались с hDll1-hFc.

Другой формат BIACORE™ использовали для оценки перекрестной реактивности между антителом против hDll4 и лигандами hDll1-hFc и hDll3-hFc. Для этого каждый из лигандов hDll4-hFc, hDll1-hFc и hDll3-hFc ковалентно связывали через аминогруппу с поверхностью чипа CM-5 в диапазоне RU примерно от 8000 до 10000. Затем антитело REGN421 в концентрации 300 мкг/мл вводили на поверхность каждого чипа. Антитело REGN421 связывалось только с hDll4-hFc; связывания с hDll1-hFc и hDll3-hFc не наблюдалось. Те же результаты получили и при замене REGN421 на REGN422.

Для определения связывания между выбранными очищенными антителами против hDll4 и hDll4-hFc, hDll3-hFc, hDll1-hFc, mfDll4-mmh или mDll4-mFc использовали тест на связывание на основе системы OCTET^TM. Для этого стрептавидиновые FA биосенсоры с высокой связывающей способностью (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) сначала инкубировали с биотин-анти-hK при концентрации 5 мкг/мл в течение 10 минут при 30°C для достижения насыщения. Затем связанные с биотин-анти-hK биосенсоры инкубировались с антителами REGN281, REGN421 или REGN422 при концентрации 20 мкг/мл в течение 10 минут при 30°C для достижения насыщения. Связанные с антителом биосенсоры затем инкубировали либо с hDll4-hFc, либо с hDll3-hFc, hDll1-hFc или mDll4-mFc при 200 нМ, или mfDll4-mmh при 100 нМ в течение 10 минут при 30°C. После каждой инкубации измеряли изменение вязкости биологического слоя. Обнаружили, что Dll4-hFc человека и mfDll4-mmh связывались с биосенсором, связанным с антителом против hDll4, тогда как hDll3-hFc, hDll1-hFc и mDll4-mFc не связывались с биосенсором, связанным с антителом против hDll4.

Пример 9. Влияние антитела против hDll4 на рост опухоли

Эффект антитела REGN421 на рост опухоли проверяли на опухолях, имплантированных мышам с тяжелой комбинированной иммунонедостаточностью (Severe Combined Immunodeficiency/SCID), которые экспрессировали гуманизированный белок Dll4 (SCIDxhDll4). Для этого готовили гуманизированные по Dll4 мыши путем замены всего внеклеточного домена гена Dll4 мыши на соответствующий внеклеточный участок гена Dll4 человека (7kb) в зародышевых стволовых клетках (ЗСК). Подготовленные таким образом гомозиготные по hDll4 мыши доводили до требуемого состояния (SCID). Затем каждой мыши подкожно вводили 2,5×10⁶ опухолевых клеток человека HT1080. После фиксации опухолей в мышах (~100-150 мм³ на 18 день после имплантации) мышей обследовали и вводили hFc, hDLL4-Fc или REGN421. 7 мышей разделили на три группы. Мыши первой группы (n=3) получали подкожно hFc (25 мг/кг); мыши второй группы (n=1) получали hDll4-Fc (25 мг/кг); и мыши третьей группы (n=3) получали REGN421 (10 мг/кг). Препарат вводили каждые 48 часов, начиная с 18 дня. Результаты измерения опухоли in vivo получали за три дня до первого введения препарата (15 день), в день каждого введения (18, 20 и 22 дни) и на 25 день. Размер опухоли рассчитывали по формуле l×w²/2. Результаты приведены в таблице 15. На 25 день мышей умерщвляли, каждую опухоль извлекали, измеряли ex vivo и рассчитывали (длина × ширина × глубина) (таблица 16).

Кроме того, группе SCID мышей, экспрессирующих эндогенный mDll4 (n=2), также имплантировали опухолевые клетки и проводили курс hDll4-Fc (25 мг/кг) по тому же графику.

ТАБЛИЦА 15 Мышь Процесс Размер опухоли (мм³) День 15 День 18 День 20 День 22 День 25 SCID hDll4-hFc 162,0 232,8 320,0 336,0 253,1 SCID hDll4-hFc 22,5 117,0 117,0 108,0 68,8 SCIDxhDll4 hDll4-hFc 288,0 320,0 352,0 446,0 320,0 SCIDxhDll4 hFc 162,0 288,0 320,0 500,0 550,0 SCIDxhDll4 hFc 162,0 220,5 352,0 662,0 661,5 SCIDxhDll4 hFc 93,8 135,0 179,6 352,0 726,0 SCIDxhDll4 REGN421 144,0 245,0 320,0 162,0 144,0 SCIDxhDll4 REGN421 87,5 162,0 153,0 225,0 135,0 SCIDxhDll4 REGN421 144,0 196,0 272,0 162,0 152,5

ТАБЛИЦА 16 Мышь Процесс Размер опухоли (мм³) SCID hDll4-hFc 308,0 SCID hDll4-hFc 105,0 SCIDxhDll4 hDll4-hFc 480,0 SCIDxhDll4 hFc 924,0 SCIDxhDll4 hFc 1020,0 SCIDxhDll4 hFc 792,0 SCIDxhDll4 REGN421 168,0 SCIDxhDll4 REGN421 84,0 SCIDxhDll4 REGN421 189,0

Изобретение относится к биохимии. Описано выделенное антитело человека или фрагмент антитела, которые специфическим образом связывают дельта-подобный лиганд-4 человека (hDII4), указанное антитело человека или фрагмент антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую три определяющие комплементарность области (CDR) тяжелой цепи, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую три CDR легкой цепи, где указанные три CDR тяжелой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:429 или SEQ ID NO:901, а указанные три CDR легкой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:437 или SEQ ID NO:903, и где указанное антитело или его фрагмент связывается с эпитопом в пределах N-концевого-DSL домена hDII4. Описана выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая описанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Представлены вектор экспрессии, содержащий описанную молекулу нуклеиновой кислоты, и система «хозяин-вектор» для получения описанного антитела. Представлен способ получения описанного антитела против DII4 человека или его антиген-связывающего фрагмента. Описана композиция для облегчения течения или ингибирования заболевания или расстройства человека, опосредованного DII4, содержащая описанное антитело или его фрагмент. 7 н. и 15 з.п. ф-лы, 16 табл., 9 пр.

1. Антитело человека или фрагмент антитела, которые специфическим образом связывают дельта-подобный лиганд-4 человека (hDII4), указанное антитело человека или фрагмент антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую три определяющих комплементарность области (CDR) тяжелой цепи, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую три CDR легкой цепи, где указанные три CDR тяжелой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:429 или SEQ ID NO:901, а указанные три CDR легкой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:437 или SEQ ID NO:903, и где указанное антитело или фрагмент антитела связывается с эпитопом в пределах N-концевого-DSL домена hDII4.

2. Антитело человека или фрагмент антитела по п.1, которые связывают hDII4 с константой аффинности (К_D), измеренной с помощью поверхностного плазменного резонанса, менее чем примерно 500 пМ или менее примерно 300 пМ.

3. Антитело человека или фрагмент антитела по п.2, где К_D для димерного hDII4 меньше 50 пМ.

4. Антитело человека или фрагмент антитела по п.1, где антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ ID NO:431, 433 и 435 соответственно.

5. Антитело человека или фрагмент антитела по п.1, где антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ ID NO:439, 441 и 443 соответственно.

6. Антитело человека или фрагмент антитела по п.1, где антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ ID NO:431, 433 и 435 соответственно; и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ ID NO:439, 441 и 443 соответственно.

7. Антитело человека или фрагмент антитела по п.6, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранную из SEQ ID NO:429 и SEQ ID NO:901.

8. Антитело человека или фрагмент антитела по п.6, содержащие вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбранную из SEQ ID NO:437 и SEQ ID NO:903.

9. Антитело человека или фрагмент антитела по п.6, где HCVR/LCVR выбраны из SEQ ID NO:429/437 и 901/903.

10. Антитело человека или фрагмент антитела по п.9, дополнительно содержащие константную область, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:950, 951 и 952.

11. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов.

12. Вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность по п.11.

13. Система «хозяин-вектор» для получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела, который специфически связывает DII4 человека, содержащая вектор по п.12, в подходящей клетке-хозяине.

14. Система «хозяин-вектор» по п.13, где клетка-хозяин является прокариотической или эукариотической клеткой, выбранной из Е.coli или клетки СНО.

15. Способ получения антитела против DII4 человека или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий выращивание клеток системы «хозяин-вектор» по п.13 в условиях, допускающих получение антитела или его фрагмента, и выделение антитела или фрагмента, полученных таким образом.

16. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по любому из пп.1-10 для получения лекарственного средства, используемого для облегчения течения или ингибирования заболевания или расстройства человека, опосредованного DII4.

17. Применение по п.16, где связанное с DII4 заболевание или расстройство представляет собой патологический ангиогенез, рак, недостаточность иммунной системы, реакцию отторжения трансплантата или воспалительный процесс.

18. Антитело или фрагмент антитела по пп.1-10, используемые для облегчения течения или ингибирования заболевания или расстройства человека, опосредованного DII4.

19. Антитело или фрагмент антитела по п.18, используемые для облегчения течения или ингибирования заболевания, выбранного из патологического ангиогенеза, рака, иммунной недостаточности, реакции отторжения трансплантата или воспалительного процесса.

20. Композиция для облегчения течения или ингибирования заболевания или расстройства человека, опосредованного DII4, содержащая эффективное количество антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-10 и приемлемый носитель.

21. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-10, используемые в способе лечения заболевания или расстройства, опосредованного DII4, благодаря облегчению течения или ингибированию активности DII4, который включает введение человеку указанного антитела или фрагмента антитела.

22. Антитело или фрагмент антитела по п.21, где заболевание или расстройство, опосредованное DII4, представляет собой патологический ангиогенез, рак, иммунную недостаточность, реакцию отторжения трансплантата или воспалительный процесс.