ПРИМЕНЕНИЕ ОКИСИ УГЛЕРОДА ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТА ТКАНЕВОЙ И ОРГАННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ И ПОДАВЛЕНИЯ АПОПТОЗА Российский патент 2009 года по МПК A61K33/08 C12N5/06 C12N5/08 

Заявлено в качестве исследования, получившего финансовую поддержку федеральных властей

Настоящее изобретение осуществлено в Национальном Институте Здоровья при Правительственной поддержке, Грант № HL586688. Указанное Правительство обладает определенными правами на данное изобретение.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к области повышения клеточной жизнеспособности.

Предпосылки изобретения

Газ окись углерода (СО) в высоких концентрациях обладает губительным действием. Вместе с тем, в настоящее время он известен в качестве важной сигнальной молекулы (Verma et al., Science 259:381-384, 1993). Предполагается также, что окись углерода действует в головном мозге в качестве молекулы-посредника (там же) и в качестве нейроэндокринного модулятора в гипоталамусе (Pozzoli et al., Endocrinology 735:2314-2317, 1994). Подобно окиси азота (NO), окись углерода является релаксантом гладких мышц (Utz et al., Biochem. Pharmacol. 47:195-201, 1991; Christodoulides et al., Circulation 97:2306-9, 1995) и подавляет агрегацию тромбоцитов (Mansouri et al., Tromb. Haemost. 48:286-8, 1982). Ингаляция малым количеством СО оказывает противовоспалительное действие, как показано на некоторых животных моделях.

Трансплантация клеток-островков стимулирует эффективное лечение диабета I типа (Lacy et al., Annu. Rev. Immunol. 2:183-98; Weir et al., J. Am. Optom. Assoc. 69:727-32, 2000; Berney et al., Langenbechs Arch. Surg. 385:378-8, 2000; Shapiro et al., N. Engl. J. Med. 343:230-8, 2000). Но осуществить способы клинической трансплантации островков по ряду причин трудно. Одной из таких причин является первичная нефункциональность (PNF) данного трансплантата. Другая причина заключается в том, что для успешного лечения диабета требуется большое количество донорских островков (Shapiro et al., N. Engl. J. Med. 343:230-8, 2000). Обе ситуации отражают одну и ту же патофизиологию: в основном потеря клеток в трансплантате происходит в первые недели после трансплантации. После трансплантации островки подвергаются воздействию различных стрессовых факторов, таких, например, как гипоксия перед вторичной васкуляризацией (Carlsson et al., Diabetes 47:1027-32, 1998), и подвергаются воздействию предвоспалительных цитокинов, а также свободных радикалов, высвобождаемых из макрофагов в микроокружение трансплантата (Rabinovitch et al., Diabetes 48:1223-9, 1999; Kaufman et al., J. Exp. Med. 772:291-302, 1990; Corbett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1731-5, 1993) и из макрофагов резидентных островков (Mandrup-Poulsen et al., J. Immunol. 739:4077-82, 1987; Arnush et al., J. Clin. Invest. 702:516-26, 1998). Токсические эффекты иммунодепрессивных лекарственных средств, и, кроме того, отторжение (Weir et al., Diabetes 46:1247-56, 1997) также содействуют потере клеток-островков. Существование PNF после экспериментальной трансплантации сингенных островков (Nagata et al., Transplant Proc. 22:855-6, 1990; Arita et al., Transplantation 65:1429-33, 1998) свидетельствует о том, что неспецифическое воспаление играет главную роль в данном сценарии.

Считается, что жизнеспособность трансплантируемого органа связана, главным образом, с успешной иммуносупрессией в виде блокирования иммунного ответа, который ведет к отторжению трансплантата. Однако ранее было показано, что трансплантируемые органы могут сами защищать себя от васкулярного повреждения, приводящего к отторжению в результате экспрессии "протективных генов" (см., например, Bach et al., Nature Med. 3:196-202 (1997); и Soares et al., Nature Med. 4:1073-1077, 1998). Один из таких генов, ген гемоксигеназы-1 (HO-1), катаболизирует гем на биливердин, свободное железо и СО (Tenhunen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61:748-755, 1968).

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано отчасти на том наблюдении, что СО способствует выживаемости и/или функциональности органа, ткани и индивидуальных клеточных трансплантатов.

В соответствии с этим, первой целью настоящего изобретения является создание способа введения донору трансплантата фармацевтической композиции, содержащей окись углерода, получение органа, ткани или клеток у этого донора и трансплантацию указанного органа, ткани или клеток реципиенту, причем количество окиси углерода, вводимой донору, является достаточным для повышения жизнеспособности или функции данного органа, ткани или клеток после их трансплантации реципиенту.

Указанную фармацевтическую композицию можно вводить живому донору, донору, мозг которого утратил биологическую активность, или же донору перед или после утраты мозгом биологической активности.

Необязательно орган донора можно in situ и/или ex vivo обработать фармацевтической композицией, содержащей окись углерода.

Способ может также включать или альтернативно включать в себя стадию введения реципиенту второй фармацевтической композиции, которая содержит окись углерода, до и/или во время и/или после стадии трансплантации органа или ткани реципиенту.

В данном или в любом из описанных здесь способов, орган или ткань могут представлять собой любой орган или ткань, которые можно трансплантировать, например, печень, почку, сердце, поджелудочную железу, легкое, тонкую кишку и/или кожу, а используемый донор может по видовой принадлежности отличаться от реципиента, либо донор и реципиент могут относиться к одному и тому же виду. Донор и реципиент могут относиться либо к животным, не являющимся человеком, либо являться человеком. Альтернативно, донор может относиться к животным, которые не принадлежат человеческому роду, таким как свинья, а реципиент может быть человеком.

В другом аспекте настоящее изобретение заключается в создании способа трансплантации органа, ткани или клеток, который подразумевает получение от донора органа, ткани или клеток, введение ex vivo или in situ в орган, ткань или клетки фармацевтической композиции, которая содержит окись углерода, и трансплантацию обработанных органа, ткани, или клеток реципиенту, причем количество окиси углерода является достаточным для повышения жизнеспособности или функции этих органа, ткани или клеток у реципиента. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения данную фармацевтическую композицию вводят путем перфузии органа или ткани in situ, пока этот орган или эта ткань находятся у донора.

Факультативно, данный способ может включать в себя стадию введения реципиенту второй фармацевтической композиции, содержащей окись углерода, перед и/или во время и/или после трансплантации данного органа или ткани реципиенту.

Еще один аспект настоящего изобретения связан с созданием способа трансплантации органа, ткани или клеток, который включает в себя стадии получения органа, ткани или клеток донора, трансплантацию полученного органа, ткани или клеток реципиенту, и перед и/или во время и/или же после стадии трансплантации указанного органа, ткани или клеток реципиенту, введение этому же реципиенту количества фармацевтической композиции, содержащей окись углерода, достаточного для повышения выживаемости и/или функциональности трансплантируемого органа, ткани или клеток у реципиента.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию можно вводить реципиенту в интервале от 0 до 20 дней, например, в 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, или 20-й день, после того, как указанному реципиенту трансплантировали указанный орган. В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию вводят реципиенту по меньшей мере единовременно, например, несколько раз или непрерывно, начиная с 21-го дня после стадии трансплантации органа или ткани реципиенту до тех пор, пока будет обеспечена выживаемость трансплантата. Фармацевтическую композицию можно вводить реципиенту для выяснения того, подвергается ли трансплантированный орган или ткань отторжению или же трансплантат близок к отторжению, например, хроническому отторжению или острому отторжению.

Факультативно, способ согласно изобретению может дополнительно включать в себя стадию введения донору второй фармацевтической композиции, содержащей окись углерода, перед получением органа, ткани или клеток этого донора. Вторую фармацевтическую композицию можно вводить живому донору или донору, мозг которого утратил биологическую активность.

Способ согласно изобретению может включать в себя стадию введения в орган донора in situ и/или ex vivo второй фармацевтической композиции, содержащей окись углерода.

В другом аспекте настоящее изобретение связано с созданием способа повышения жизнеспособности и/или функционирования донорского органа, ткани или клетки, который включает в себя получение органа, ткани или клетки от донора, находящегося в маргинальном состоянии, и экспонирование полученного органа, ткани или клетки с количеством, содержащей окись углерода фармацевтической композиции, достаточным для повышения жизнеспособности и/или функционирования полученного донорского органа, ткани или клетки.

В другом аспекте настоящее изобретение связано со способом поддержания животной клетки in vitro, который включает в себя обеспечение сосуда, содержащего герметизированный газ, который содержит газ окись углерода, получение выделенной клетки in vitro, где клетка представляет собой первичную клетку или стволовую клетку, высвобождение сжатого газа из указанного сосуда для образования атмосферы, которая включает в себя газ окись углерода, и поддержание указанной животной клетки in vitro в присутствии атмосферы, которая включает в себя газ окись углерода.

При необходимости клетку можно затем трансплантировать реципиенту. Клетка может быть получена у донора, который не является реципиентом, либо ее можно получить у указанного реципиента. Кроме того, композицию окиси углерода можно вводить реципиенту перед и/или во время, и/или после стадии трансплантации. Такая композиция обычно представлена в виде вдыхаемого газа.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанную животную клетку получают у донора способом, который включает в себя введение донору композиции, содержащей окись углерода, и получение клетки из ткани этого донора.

В настоящем изобретении создан также способ поддержания in vitro животной клетки, который включает в себя создание культуральной среды, содержащей эффективное количество окиси углерода, например, по меньшей мере 0,0001 г СО/100 г среды, и поддержание выделенной клетки в среде. Эта среда может содержать, например, по меньшей мере 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0,0037, 0,0040, 0,0042, или 0,0044 г СО/100 г среды.

Кроме того, в настоящем изобретении создан способ повышения выживаемости животной клетки после изъятия ее у донора, который включает в себя введение живому донору или донору после смерти его мозга, фармацевтической композиции, содержащей окись углерода, и получение выделенной у донора клетки. Фармацевтическая композиция может быть представлена, например, в виде герметизированного газа, пригодного для вдыхания донором.

Способ может дополнительно включать в себя стадию поддержания in vitro указанной клетки в присутствии второй композиции, содержащей окись углерода.

Вместе с тем, клетка in vitro может быть помещена в жидкую среду. В таком случае стадию экспонирования этой клетки со второй композицией, содержащей окись углерода, можно осуществить путем обеспечения источника герметизированного газа окиси углерода и контактирования жидкой среды с газом окисью углерода, высвобождаемого из этого источника. Сама жидкая среда может быть также получена в виде композиции окиси углерода, т.е. растворенной в ней окиси углерода.

Далее, в настоящем изобретении создан способ трансплантирования животной клетки, который включает в себя стадии введения живому донору или донору после смерти мозга, фармацевтической композиции, содержащей окись углерода, получения выделенной у донора клетки и трансплантирования этой клетки реципиенту. Животную клетку можно получить от донора, который не является реципиентом, или ее можно получить от реципиента. При необходимости, композицию окиси углерода можно вводить реципиенту перед и/или во время и/или после стадии трансплантации.

В настоящем изобретении создан также способ повышения выживаемости или функциональности животной клетки, трансплантируемой реципиенту, который включает в себя стадии трансплантации животной клетки реципиенту перед, во время и/или после стадии трансплантации, при этом реципиент должен вдыхать объем газа окиси углерода, достаточный для повышения у данного реципиента выживаемости или функциональности трансплантированной клетки. Газ окись углерода может поставляться в емкости, содержащей герметизированный газ, который содержит окись углерода. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенную клетку перед стадией трансплантации поддерживают in vitro в газовой среде, содержащей окись углерода. Например, выделенную животную клетку можно поддерживать в жидкой среде, которая включает в себя по меньшей мере 0,0001 г окиси углерода/100 г среды (например, по меньшей мере, около 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0,0037, 0,0040, 0,0042, или 0,0044 г СО/100 г среды).

Способ может необязательно включать в себя перед стадией трансплантации, стадию экспонирования выделенной клетки с композицией окиси углерода ex vivo.

Газ окись углерода можно вводить реципиенту перед и/или во время и/или после стадии трансплантации. Данную животную клетку можно получить от донора, который не является реципиентом, либо ее можно получить от реципиента. Фармацевтическую композицию, включающую в себя окись углерода, можно вводить донору перед и/или во время удаления указанной клетки из донора.

Другой аспект настоящего изобретения связан со способом, улучшающим выживаемость трансплантированной клетки у реципиента, включающим в себя введение реципиенту перед и/или во время, и/или после трансплантации указанной клетки эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей газ окись углерода.

В любом из вышеуказанных способов согласно изобретению эффект выживаемости можно усилить путем индукции у донора или у реципиента фермента гемоксигеназы-1 (HO-1), например, индуцированной гемом, тяжелыми металлами, цитокинами, гормонами, окисью азота, эндотоксинами, УФ-облучением, истощением глутатиона; или с помощью теплового шока. У донора такая индукция может происходить перед или во время удаления органа, ткани, или клеток. У реципиента такая индукция может происходить перед, во время или после трансплантации. Альтернативно, указанный фермент может быть индуцирован в органе, ткани, или в клетках ex vivo перед их трансплантацией реципиенту.

В настоящем изобретении создано также промышленное изделие, которое включает в себя емкость, содержащую герметизированный газ, который содержит по меньшей мере 0,001 ppm, например, по меньшей мере, около 1, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000 и вплоть до 1000000 ppm окиси углерода, и этикетку, на которой описано применение газа для повышения жизнеспособности выделенных животных клеток, тканей или островков перед, во время или после трансплантации пациенту указанных клеток, тканей или островков.

Кроме того, в настоящем изобретении представлена стерильная клеточная среда, которая содержит питательные вещества, пригодные для поддержания животной клетки в культуре, и по меньшей мере около 0,0001 г окиси углерода/100 г среды, например, по меньшей мере 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0,0037, 0,0040, 0,0042, или 0,0044 г СО/100 г среды. Она может содержать также животные клетки.

Создан также способ поддержания животной клетки in vitro и последующей ее трансплантации. Данный способ включает в себя стадии обеспечения емкости, содержащей герметизированный газ, содержащий газ окись углерода; получение отдельной животной клетки in vitro, причем указанную клетку помещают в среду, которая содержит растворенную окись углерода; высвобождение герметизированного газа из данной емкости с образованием газовой атмосферы, содержащей газ окись углерода; поддержание животной клетки в присутствии газовой среды и трансплантацию этой клетки реципиенту.

В любом из вышерассмотренных аспектов или вариантов осуществления настоящего изобретения рассматриваемая клетка может представлять собой любую клетку. Например, клетка может быть животной клеткой, такой как первичная, клетка, вторичная клетка или клеточная линия. В качестве другого примера, рассматриваемая клетка может быть частью островка поджелудочной железы, например, β-клетку. Рассматриваемая клетка может также быть, например, печеночной клеткой, фибробластом, клеткой костного мозга, нейронной клеткой, миоцитом, лимфоцитом, или стволовой клеткой. В каждом из ех vivo-способов согласно изобретению ткань предпочтительно не является кровью и содержит незначительное количество, если вообще содержит, цельной крови, а клетки предпочтительно не являются эритроцитами и не содержат существенное количество эритроцитов.

Если не оговорено особо, все используемые здесь технические и научные термины имеют то же значение, что и общепринятые специалистами в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя в настоящем изобретении могут быть практически использованы и опробованы способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь способам и материалам, использованные здесь способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие упомянутые здесь ссылки считаются включенными в настоящее описание во всей их полноте. В случае конфликтной ситуации настоящее описание, в том числе и определения, будут обоснованы. Представленные материалы, способы и примеры служат только для иллюстрации изобретения и не подразумевают его ограничения.

Другие характерные особенности и преимущества настоящего изобретения очевидны из нижеследующего подробного описания, а также из формулы изобретения.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг.1А представлена гистограмма, которая иллюстрирует эффект обработки клеток βТС3 увеличивающимися концентрациями TNF-α.

На Фиг.1В представлена графическая иллюстрация FACScan^TM-анализа фрагментации ДНК в βТС3-клетках после обработки TNF-α.

На Фиг.1С представлена гистограмма, которая иллюстрирует эффект котрансфекции βТС3-клеток вектором экспрессии β-gal (pcDNA3/β-gal), и контроль (pcDNA3), а также их обработку либо ингибитором каспазы-3 Z-DEVD-FMK (C3-i), либо ингибитором каспазы-8 IETD-CHO (C8-i). Гистограммы серого цвета соответствуют необработанным β-клеткам, а гистограммы черного цвета соответствуют β-клеткам, обработанным в течение 24 часов TNF-α. Полученные результаты представляют собой средние значения для повторных лунок ± стандартное отклонение, соответствующие одному из трех репрезентативных экспериментов.

На Фиг.2А представлена гистограмма, показывающая, что экзогенной окисью углерода можно заменить HO-1 (гемоксигеназу-1) в тех случаях, когда активность HO-1 блокируется. Гистограммы серого цвета соответствуют необработанным β-клеткам, а гистограммы черного цвета соответствуют β-клеткам, обработанным TNF-α или этопозидом, либо подвергнуты сывороточной депривации. Полученные результаты представляют собой средние значения для повторных лунок ± стандартное отклонение, соответствующие одному из трех репрезентативных экспериментов.

На Фиг.2В графически представлен FACScan^TM-анализ фрагментации ДНК в клетках βТС3 после 24-часовой обработки окисью углерода после обработки TNF-α.

На Фиг.2С представлена гистограмма, показвающая, что экзогенная окись углерода защищает β-клетки от апоптоза в отсутствие HO-1. βТС3-клетки трансфицировали векторами экспрессии β-gal и экспонировали с экзогенной окисью углерода. Гистограммы серого цвета соответствуют необработанным β-клеткам, а гистограммы черного цвета соответствуют β-клеткам, обработанным TNF-α или этопозидом, либо подвергнутым, как указано, сывороточной депривации. Полученные результаты представляют собой средние значения, полученные в повторных лунках ± стандартное отклонение, соответствующие одному из трех репрезентативных экспериментов.

На Фиг.3 представлены результаты анализа фрагментации ДНК с помощью FACScan^TM, которые свидетельствуют о том, что экзогенная окись углерода защищает островки Лангерганса у мышей от апоптоза. CHX = циклогексимид.

На Фиг.4А представлена гистограмма, показывающая, что антиапоптозный эффект экзогенной окиси углерода опосредован активацией гуанилатциклазы. ODQ = гуанилилциклазный ингибитор ODQ.

На Фиг.4В представлена гистограмма, показывающая, что аналог цГМФ можно заменить окисью углерода для защиты клеток от апоптоза. 8-Br-цГМФ = аналог 8-Br-цГМФ.

На Фиг.4С представлена гистограмма, поясняющая, что цГМФ-зависимая протеинкиназа (cGK) опосредует антиапоптотический эффект окиси углерода. Клетки βТС3 котрансфицировали вектором экспрессии β-gal. На Фигурах 4А-С гистограммы серого цвета соответствуют необработанным β-клеткам, гистограммы черного цвета соответствуют β-клеткам, обработанным TNF-α. Полученные результаты представляют собой средние значения для повторных лунок ± стандартное отклонение, соответствующие одному из трех репрезентативных экспериментов. KT=KT5823, ингибитор протеинкиназы G.

На Фиг.5А представлена гистограмма, показывающая, что экспонирования в течение одного часа окиси углерода достаточно для предотвращения апоптоза.

На Фиг.5В представлена гистограмма, показывающая, что окись углерода защищает β-клетки после индукции апоптоза.

На Фиг.5С представлена гистограмма, показывающая, что преинкубация с окисью углерода предотвращает апоптоз β-клеток. На Фигурах 5А-С гистограммы серого цвета соответствуют необработанным β-клеткам, а гистограммы черного цвета соответствуют β-клеткам, обработанным TNF-α. Полученные результаты представляют собой средние значения для повторных лунок ± стандартное отклонение, соответствующие одному из трех репрезентативных экспериментов.

На Фиг.6 представлен линейный график, свидетельствующий о том, что экспонирование мышиных островков окиси углерода повышает их выживаемость и функциональность после трансплантации.

На Фиг.6В представлен линейный график, который показывает вероятность выздоровления (уровень глюкозы крови ниже 200 мг/дл) животных, получивших предварительно экспонированные окиси углерода островки или контрольные островки. *Р=0,001 против контроля.

На Фиг.7 представлена гистограмма, которая иллюстрирует экспрессию HO-1 в мышиных сердцах, трансплантированных крысам, обработанным CVF и CsA. Мышиные сердца трансплантировали крысам, обработанным во время трансплантации фактором яда кобры (CVF), и после трансплантации ежедневно обрабатываемым циклоспорином А (CsA). Экспрессию мРНК HO-1 и β-актина определяли с помощью RT-PCR. Символом -/- обозначена РНК HO-1 мышиных сердец, используемых в качестве негативного контроля. Гистограммы соответствуют относительному уровню экспрессии мРНК HO-1 по отношению к экспрессии мРНК β-актина.

На Фиг.8 представлена группа гистограмм, свидетельствующих о том, что SnPPIX ингибирует in vivo ферментативную активность HO-1. Мышиные сердца трансплантировали необработанным крысам (II) или крысам, обработанным CVF и CsA (III) плюс FePPIX (IV) или SnPPIX (V). Общую активность HO измеряли в сердечной ткани донора и реципиента через 2 дня после трансплантации и сравнивали с исходной активностью HO в сердечной ткани, соответственно, нормальной мыши и нормальной крысы (I). Полученные результаты представляют собой средние значения по трем животным на каждую обработку ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ осуществляли с использованием непарного t-критерия Вэлша.

На Фиг.9 представлена серия кривых, свидетельствующих о том, что SnPPIX и FePPIX не препятствуют образованию антител к трансплантатам (AT). Мышиные сердца трансплантировали крысам, обработанным CVF и CsA, как указано выше. Уровень антисыворотки с IgM к трансплантату оценивали с помощью клеточного ELISA. Связывание С3-компонента комплемента с мышиными эндотелиальными клетками оценивали с помощью клеточного ELISA. Гемолитическую активность комплемента (CH50) оценивали с помощью стандартного анализа гемолиза. Полученные результаты представляют собой среднее ± SD (n=3).

На Фиг.10А представлена серия гистограмм, свидетельствующих о том, что экзогенная СО не влияет на способность SnPPIX вызывать супрессию ферментативной активности HO-1. Мышиные сердца трансплантировали крысам, обработанным CVF плюс CsA плюс SnPPIX (II) или SNPPIX и CO (III). Общую активность HO измеряли в сердечной ткани доноров и реципиентов, а также в печени реципиентов через 2 дня после трансплантации. Активность HO разных образцов сравнивали с исходной активностью HO нормальных мышиных сердец (I), крысиных сердец (I) или печени (I), в соответствии с анализируемым образцом. Полученные результаты представляют собой среднее по трем животным при каждой обработке ± SD. Статистический анализ осуществляли с помощью t-критерия Вэлша.

На Фиг.10В представлена гистограмма, свидетельствующая о том, что экзогенная СО не влияет на способность SnPPIX вызвать супрессию активности HO-1. У животных, используемых для получения данных Фиг.10А, определяли содержание карбоксигемоглобина через 2 дня после трансплантации. Полученные результаты представляют собой средние значения ± SD (n=3).

На Фиг.11 представлен линейный график, свидетельствующий о том, что повышенное содержание HO-1 в эндотелиальных клетках подавляет активацию тромбоцитов. Эндотелиальные клетки мышей 2F-2B оставляли необработанными (NT) или обрабатывали CoPPIX (50 мкМ, 16 ч) для повышения активности HO-1, SnPPIX - для супрессии активности HO-1 (50 мкМ, 16 ч) или CoPPIX (50 мкМ, 12 ч) плюс SnPPIX (50 мкМ, 4 ч) - для контроля специфичности CoPPIX в повышении активности HO-1. Крысиные тромбоциты выделяли, накладывали на мышиные эндотелиальные клетки на 5 мин, и тестировали агрегацию после стимуляции под действием 2 мкМ аденозиндифосфата (AДФ).

На Фиг.12 представлена гистограмма, свидетельствующая о том, что окись углерода вызывает супрессию апоптоза эндотелиальных клеток. Гистограммы серого цвета соответствуют клеткам, обработанным одним лишь Act.D, а гистограммы черного цвета соответствуют клеткам, обработанным Act.D плюс TNF-α. Где указано, эндотелиальные клетки обрабатывали SnPPIX (50 мкМ) и экспонировали с экзогенной СО (10000 частей на миллион (ppm)).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Используемый здесь термин "окись углерода" (или "СО") относится к молекулярной окиси углерода в ее газообразном состоянии, сжатой до жидкой формы, или растворенной в водном растворе. Используемые во всем описании термины "композиция окиси углерода" и "фармацевтическая композиция, содержащая окись углерода" относятся к газообразной, жидкой, твердой или полужидкой композиции, содержащей окись углерода, которую можно ввести донору-пациенту, трупу или животному; в любой орган; или в часть органа, например, в ткани органа или в отдельную клетку(и), составляющую данный орган, например, нейроны, гепатоциты, миоциты, островки, или островковую клетку, такую как β-клетка поджелудочной железы. Практикующим специалистам очевидно, какая из форм фармацевтической композиции, например, газообразная, жидкая, или и газообразная, и жидкая формы, предпочтительна для конкретного применения.

Используемые здесь термины "эффективное количество" и "эффективное для обработки" относятся к количеству или к концентрации окиси углерода, используемой в течение периода времени (включая острое или хроническое введение, а также периодическое или непрерывное введение), которое эффективно при ее введении для получения предполагаемого эффекта или физиологического результата. Эффективные количества окиси углерода для использования в настоящем изобретении включают в себя, например, количества, которые эффективны для повышения выживаемости и/или улучшения функции органов или клеток in vivo и/или in vitro. В случае трансплантации индивидуальных клеток или совокупности клеток, например, трансплантата доноров и/или реципиентов, эффективное количество окиси углерода представляет собой количество, вводимое в трансплантат донора и/или реципиента, достаточное для повышения жизнеспособности данной клетки или совокупности клеток, например, для снижения потерь клеток, или совокупности клеток, и/или для улучшения эксплуатационных качеств трансплантируемой клетки или совокупности клеток. В случае обработки клеток вне организма, например культивируемых и/или используемых для трансплантации островковых клеток, эффективное количество окиси углерода соответствует такому количеству, в присутствии которого данные клетки инкубируются или хранятся в целях повышения сохранности клеток и/или уменьшения потери клеток, например, потери при апоптозе, и/или для усиления функции. В случае трансплантации органов или тканей, например, трансплантатов доноров и/или реципиентов, эффективное количество окиси углерода соответствует такому количеству, которого при введении в трансплантат донора и/или реципиента достаточно для повышения жизнеспособности органа, ткани или представляющих интерес клеток, например, для уменьшения потерь клеток, из которых состоит орган или ткань, и/или улучшения функциональных свойств любого органа. В случае обработки органов, тканей или клеток ex vivo для их хранения или использования для трансплантации эффективное количество окиси углерода соответствует количеству, достаточному для повышения жизнеспособности и/или функциональности органа или тканей. Используемый здесь термин "ингибирование" включает в себя отсрочку запуска, уменьшение, предотвращение или ослабление биологического процесса, например, апоптоза. В случае газов эффективное количество окиси углерода заключено в основном в диапазоне от приблизительно 0,0000001 масс.% до 0,3 масс.%, например, примерно от 0,0001 масс.% до 0,25 масс.%, предпочтительно по меньшей мере около 0,001%, например, по меньшей мере 0,005%, 0,010%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,08%, 0,10%, 0,15%, 0,20%, 0,22%, или 0,24% масс. окиси углерода. Предпочтительные диапазоны окиси углерода составляют примерно от 0,001% до 0,24%, примерно от 0,005% до 0,22%, примерно от 0,01% до 0,20% и примерно от 0,01% до 0,1% по массе. Другие предпочтительные диапазоны составляют примерно от 0,005% до 0,24%, примерно от 0,01% до 0,22%, примерно от 0,15% до 0,20% и примерно от 0,025% до 0,1% по массе. В случае жидких растворов СО эффективные количества обычно составляют примерно от 0,0001 до 0,0044 г СО/100 г жидкости, например, по меньшей мере 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0,0037, 0,0040, или 0,0042 г СО/100 г водного раствора. Предпочтительные диапазоны составляют, например, примерно от 0,0010 до 0,0030 г СО/100 г жидкости, примерно от 0,0015 до 0,0026 г СО/100 г жидкости или примерно от 0,0018 до 0,0024 г СО/100 г жидкости. Практикующие специалисты должны принимать во внимание, что, в зависимости от применения, могут использоваться и количества, выходящие за пределы этих диапазонов.

Используемый в данном описании термин "пациент" относится к животному, являющемуся, или не являющемуся человеком, которое обрабатывают в соответствии со способами согласно изобретению. Настоящее изобретение подразумевает применение этого термина также и в ветеринарии. Данный термин включает в себя, не ограничиваясь перечисленным, птиц, рептилий, амфибий и млекопитающих, например, человека, других приматов, свиней, грызунов, таких как мыши и крысы, кроликов, морских свинок, хомяков, коров, лошадей, кошек, собак, овец и коз. Используемый здесь термин "донор" или "донорный пациент" относится к животному (человеку или не человеку) от которого получают орган, ткань или индивидуальные клетки с целью хранения и/или трансплантации пациенту-реципиенту. Используемый здесь термин "реципиент" или "реципиентный пациент" относится к животному (человеку или не человеку), в организм которого могут быть перенесены орган, ткань, совокупность клеток или отдельные клетки.

Термин "диабет" является общим термином, которым обозначает связанные с диабетом нарушения, распознаваемые в данной области, например, сахарный диабет. Сахарный диабет характеризуется неспособностью регулировать уровень глюкозы крови. Два наиболее преобладающих типа диабета известны как диабет типа I и диабет типа II. В случае типа I, или инсулинозависимого диабета (IDDM), поджелудочная железа вырабатывает мало инсулина или вообще его не вырабатывает из-за разрушения продуцирующих инсулин бета-клеток. В случае диабета типа II, или инсулиннезависимого диабета (NIDDM), поджелудочная железа вырабатывает некоторое количество инсулина, но этот инсулин неэффективен. Данный термин включает в себя также бессчетное количество вторичных нарушений, обусловленных диабетом, как острым, так и хроническим, например, связанных с диабетом осложнений, например, гипогликемии и гипергликемии, ретинопатии, ангиопатии, невропатии и нефропатии.

Используемый здесь термин "клетка(и)" или "животная(ые) клетка(и)" относится к любому типу животных клеток, включая клетки, пригодные для трансплантации. Эти клетки, как правило, представляют собой клетки, получаемые от животного-донора, но могут представлять собой и производные от них (вторичные) клетки или даже клетки установленной клеточной линии. Они необязательно трансфицированы ex vivo экспрессирующим вектором, который в некотором отношении изменяет их функцию. Указанные клетки включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, островковые клетки, например, клетки, которые составляют часть панкреатического островка, а также клетки печени, фибробласты, клетки костного мозга, миоциты, а также стволовые клетки, и клетки (например, нейроны) центральной нервной системы, включая спинной мозг. Используемый в настоящем описании термин "островковая(ые) клетка(и)" в качестве общего термина подразумевает группы клеток в поджелудочной железе, известных как островки Лангерганса. Островки Лангерганса содержат несколько типов клеток, которые включают в себя, например, β-клетки (которые вырабатывают инсулин), α-клетки (которые производят глюкагоны), γ-клетки (которые вырабатывают соматостатин), F-клетки (которые производят панкреатический полипептид), кишечные аргентаффиноциты (которые продуцируют серотонин), РР-клетки и D1-клетки. Термин "стволовая клетка" является общепринятым термином, который относится к клеткам, обладающим способностью к неограниченному делению в культуре и дающим начало специализированным клеткам. В этот термин включены, например, тотипотентные, плюрипотентные, мультипотентные и унипотентные стволовые клетки, например, нейронные, печеночные, мышечные и гемопоэтические стволовые клетки.

Под "выделенной клеткой" подразумевают клетку, которая удалена из определенной ткани или органа, в которых она (или ее предшественница) встречается в природе. Любую клетку можно лишь частично очистить от ее природного окружения, считая "выделенной". Например, интактный островок Лангерганса считают слагаемым из "выделенных" клеток после того, как островок удаляют из поджелудочной железы и он физически отделяется от других островков. Клетки любого интактного органа, такого как почка или сердце, или неполного органа, такого как фрагмент кровеносного сосуда, не считают "выделенными клетками", поскольку они по-прежнему являются частью данного органа.

Термин "орган(ы)" используется в настоящем описании как общий термин для описания любого анатомического участка или члена, обладающего у животного специфичной функцией. Дополнительно включенными в данное значение этого термина являются существенные части органов, например, когезионные ткани, полученные из любого органа. Такие органы включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, почки, печень, сердце, кишечник, например, толстый или тонкий кишечник, поджелудочную железу и легкие. Дополнительно включенными в данное определение являются кости и кровеносные сосуды, например, трансплантаты аорты.

В настоящем описании термин "трансплантация" используется в качестве общего термина для обозначения процедуры имплантации пациенту органа, ткани, совокупности клеток или индивидуальных клеток. Термин "трансплантация" определяют в данной области как перенос живых тканей или клеток от донора реципиенту, с целью сохранения у реципиента функциональной целостности трансплантируемой ткани или клеток (см., например, The Merck Manual, Berkow, Fletcher, and Beers, Eds., Merck Research Laboratories, Rahway, N.J., 1992). В настоящем описании термин "клеточная трансплантация" используется в качестве общего термина для обозначения процедуры перемещения пациенту по меньшей мере одной клетки, например, островковой(ых) клетки(ок). К примеру, такую трансплантацию можно осуществить путем удаления β-клеток (или интактных островков) из донорской поджелудочной железы и подсадки их реципиенту, поджелудочная железа которого не может продуцировать достаточное количество инсулина. Этот термин включает в себя все категории трансплантатов, известных в данной области, за исключением переливания крови. Трансплантаты разбивают на категории, в зависимости от локализации и генетической взаимосвязи между донором и реципиентом. Этот термин включает в себя, например, аутотрансплантацию (удаление и перенос клеток или ткани с одного определенного места у пациента на то же или другое место у того же пациента), аллострансплантацию (трансплантация между представителями одних и тех же видов) и ксенотрансплантацию (трансплантацию между представителями разных видов).

Термины "отторжение органа", "отторжение трансплантата" или "отторжение" являются общепринятыми в данной области и используются везде в настоящем описании в качестве общего термина, характеризующего процесс отторжения у реципиента органа, тканей, или клеток. В настоящее определение включены, например, три основных типа отторжения, которые обычно идентифицируются в клинической практике: чрезвычайно острое отторжение, острое отторжение и хроническое отторжение (см., например, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press, 1994).

Термины "маргинальный донор(ы)" и "маргинальный орган" используются здесь в качестве общих терминов при описании проблематичного донора или органа, что делает их использование для осуществления операции по трансплантации недостаточно оптимальным. Например, понятие маргинальный донор может включать в себя донора, возраст которого превышает 50 лет или который поражен хроническим заболеванием, что может повлиять на функцию трансплантата, например, диабет, HTA и потребление алкоголя. Маргинальный орган представляет собой, например, (1) орган от такого донора или (2) орган, который подвергался длительному воздействию тепла или ишемии в результате неоднократного охлаждения, или (3) орган с анатомическими аномалиями (например, небольшими и многочисленными сосудами, например, в почке), что затрудняет анастомоз сосудов, или с явными атеросклеротическими бляшками в сосудах трансплантата.

Получение газообразных композиций

Композиция окиси углерода может представлять собой газообразную композицию окиси углерода. Компримированный или герметизированный газ, пригодный для способов настоящего изобретения, можно получить от любого коммерческого поставщика и в емкости любого типа, подходящего для хранения компримированного газа. Например, компримированные или герметизированные газы можно получить от любого поставщика компримированных газов для медицинского использования, таких как кислород. Герметизированный газ, в том числе окись углерода, используемый в способах согласно изобретению, можно получить при условии, что все такие газы требуемой конечной композиции (например, СО и О₂, и факультативно N₂, He, и/или СО₂) смешиваются вместе в одной и той же емкости. При необходимости способы согласно изобретению можно осуществлять с использованием нескольких емкостей, содержащих индивидуальные газы. Например, можно использовать единственную емкость, которая содержит окись углерода вместе с другими газами или без них и содержимое которой необязательно смешивают с комнатным воздухом или с содержимым других емкостей, например, емкостей, содержащих кислород, азот, двуокись углерода, компримированный воздух или любой другой подходящий газ или их смеси.

Газообразные композиции, вводимые пациенту в соответствии с настоящим изобретением, как правило, содержат 0-79 масс.% азота, примерно от 21 до 100 масс.% кислорода и примерно от 0,0000001 до 0,3 масс.% (что соответствует примерно от 0,001 ppm (т.е., 1 ppb) до 3000 ppm) окиси углерода. Предпочтительно, содержание азота в газообразной композиции составляет около 79 масс.%, содержание кислорода составляет около 21 масс.%, а содержание окиси углерода составляет примерно от 0,0001 до 0,25 масс.%. Содержание окиси углерода предпочтительно составляет по меньшей мере около 0,001 масс.%, например, по меньшей мере около 0,005, 0,01, 0,02, 0,025, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,10, 0,15, 0,20, 0,22 или 0,24 масс.%. Предпочтительные диапазоны окиси углерода включают в себя примерно от 0,001 до 0,24, примерно от 0,005 до 0,22, примерно от 0,010 до 0,20, и примерно от 0,015 до 0,1 масс.%. Следует заметить, что газообразные композиции окиси углерода, содержащие окись углерода в концентрациях, превышающих 0,3% (например, 1% или выше), в зависимости от применения, могут использоваться в течение коротких периодов времени (например, на протяжении одного или нескольких вдохов). Они особенно пригодны во время применения ex vivo, когда не возникает риска отравления окисью углерода. В тех случаях, когда этот газ используется для образования газовой среды для культивирования клеток in vitro, она может содержать также окись углерода, способствуя поддержанию рН данной среды. Эта окись углерода может присутствовать, например, в количестве 1-10, как правило, 5 масс.%.

Газообразную композицию окиси углерода можно использовать для создания атмосферы, которая содержит газ окись углерода. Можно создать атмосферу, которая включает в себя соответствующие уровни окиси углерода, например, с помощью емкости, содержащей герметизированный газ, включающий в себя газ окиси углерода, и высвобождения этого герметизированного газа из емкости в камеру или в пространство с образованием атмосферы, которая включает в себя газ окись углерода внутри данной камеры или пространства. Альтернативно, газы могут высвобождаться в аппарат для достижения максимальной концентрации в респираторе или в дыхательной трубке, с тем, чтобы создать атмосферу, содержащую газ окись углерода, в респираторе или в дыхательной трубке и обеспечить пациенту, который является единственным человеком в помещении, существенный уровень окиси углерода.

Уровень окиси углерода в атмосфере или в системе вентиляции можно измерить или контролировать с использованием любого способа, известного в данной области. Такие способы включают в себя электрохимическое детектирование, газовую хроматографию, радиоизотопное считывание, инфракрасную абсорбцию, колориметрию и электрохимические способы, основанные на использовании селективных мембран (см., например, Sunderman et al., Clin. Chem. 28:2026-2032, 1982; Ingi et al., Neuron 16:835-842, 1996). С помощью, например, газовой хроматографии и радиоизотопного считывания можно детектировать содержание окиси углерода в количестве дробных долей на миллион. Кроме того, известно, что уровни окиси углерода в суб-ppm-диапазоне можно измерять в биологической ткани с помощью газового сенсора для средней части инфракрасного спектра (см., например, Morimoto et al., Am. J. Physiol. Heart. Circ Physiol. 280:H482-H488, 2001). Сенсоры для окиси углерода и устройства для газовой детекции широко доступны из многих коммерческих источников.

Получение жидких композиций

Композиция окиси углерода может быть также представлена в виде жидкой композиции окиси углерода. Жидкость можно включить в композицию окиси углерода с помощью любого способа, известного в данной области, заставляющего газы растворяться в жидкостях. Например, жидкость можно поместить в так называемый "СО₂-инкубатор" и подвергать воздействию непрерывного потока окиси углерода до тех пор, пока в жидкости будет достигнута необходимая концентрация окиси углерода. В качестве другого примера, окись углерода можно барботировать прямо в жидкость до достижения в жидкости желаемой концентрации окиси углерода. Объем окиси углерода, который можно растворить в водном растворе, повышается с понижением температуры. В качестве еще одного примера, соответствующую жидкость можно пропускать через трубки, которые позволяют газу диффундировать, когда эти трубки проходят через газовую среду, содержащую окись углерода (например, применяя устройство, такое как оксигенатор с искусственной мембраной). Окись углерода диффундирует в жидкость для создания жидкой композиции окиси углерода.

Жидкостью может быть любая жидкость, известная специалистам в данной области, которая пригодна для введения пациентам (см., например, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press, 1994) или для сохранения органов, тканей или клеток ex vivo. Вообще жидкость должна представлять собой водный раствор. Примеры растворов включают в себя фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), раствор Celsior^TM, раствор Perfadex^TM, Collins-раствор, цитратный раствор и раствор Висконсинского Университета (UW) (Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press, 1994). Жидкие композиции могут включать в себя окись углерода в концентрациях в диапазоне примерно от 0,0001 до 0,0044 г СО/100 г жидкости, по меньшей мере 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0,0037, 0,0040, или 0,0042 г СО/100 г среды. Предпочтительные диапазоны включают в себя, например, примерно от 0,0010 до 0,0030 г СО/100 г жидкости, примерно от 0,0015 до 0,0026 г СО/100 г жидкости, или примерно от 0,0018 до 0,0024 г СО/100 г жидкости. Точка насыщения воды при 0°С составляет около 0,0044 г СО/100 г среды.

Любую подходящую жидкость можно подвергнуть насыщению окисью углерода до определенной концентрации с помощью диффузионного аппарата. Альтернативно, можно использовать заранее приготовленные растворы, качество которых контролируют по содержанию определенного уровня окиси углерода. Точный контроль дозы можно осуществить путем измерения с помощью газопроницаемой мембраны, непроницаемой для жидкости, соединенной с анализатором окиси углерода. Растворы можно подвергнуть насыщению до требуемых эффективных концентраций и поддерживать на этих уровнях. Включение в жидкие и газообразные композиции инертного газа гелия может улучшить доставку окиси углерода к определенным тканям любого органа.

Обработка пациентов композициями окиси углерода

В настоящем изобретении рассматривается использование композиций окиси углерода для обработки доноров, реципиентов, органов, тканей, групп клеток, и/или отдельных клеток на любой стадии получения, хранения и процесса трансплантации. Орган, ткань, совокупность клеток, или отдельные клетки можно получить от донора, обработанного композицией окиси углерода ex vivo, в соответствии с настоящим изобретением, и трансплантировать их реципиенту. Альтернативно или в дополнение, орган, ткань, совокупность клеток, или отдельные клетки можно обработать in situ, пока они еще находятся у донора. Факультативно, композицию окиси углерода можно ввести реципиенту до, во время и/или после операции: например, после того как в органе восстановят кровоснабжение кровью реципиента. Композицию окиси углерода можно также ввести донору до или во время операции по получению органа, ткани, совокупности клеток, или индивидуальных клеток.

Органы, ткани, группы клеток, и/или выделенные клетки можно получить от донора и трансплантировать с помощью любого способа, известного специалистам в данной области (см., например, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). Квалифицированным практикам очевидно, что способы получения и трансплантации могут варьировать, в зависимости от многих обстоятельств, таких как тип органа, ткани или клеток и характеристика донора.

Кроме того, в настоящем изобретении подразумевается, что описанные здесь способы могут использоваться в отношении органов, ткани, групп клеток или выделенных клеток ex vivo, например, искусственных органов, таких как искусственная печень, почка или поджелудочная железа (см. например, Sambanis et al., Cytotechnology 15:351-363, 1994). Органы, ткани, или клетки (или группы клеток) можно обрабатывать окисью углерода либо до помещения их в указанный аппарат, или во время их пребывания в данном аппарате, или в обоих случаях. Альтернативно или в дополнение, животному-донору можно вводить окись углерода перед удалением органа, ткани, совокупности клеток или индивидуальных клеток для использования в данном аппарате.

Альтернативно или в дополнение, клетку можно культивировать, как указано ниже, и трансплантировать реципиенту.

Пациента можно подвергнуть обработке композицией окиси углерода с помощью любого, известного в данной области способа, введения пациентам газов и/или жидкостей. В настоящем изобретении рассматривается системное введение пациентам жидких или газообразных композиций окиси углерода (например, с помощью ингаляции и/или приема внутрь), и местного введения композиций в органы или ткани пациентов in situ (например, путем приема внутрь, инсуффляции и/или внедрения в брюшную полость).

Системная доставка окиси углерода

Газообразные композиции окиси углерода можно доставлять пациенту системно, например, пациенту, подвергающемуся трансплантации или нуждающемуся в ней. Газообразные композиции окиси углерода вводят, как правило, путем ингаляции через ротовой или носовой пути в легкие, где вводимая окись углерода легко поглощается током крови данного пациента. Концентрация активного соединения (СО), используемого в терапевтической газообразной композиции, зависит от скорости поглощения, распределения, инактивации и выведения (главным образом, через дыхание) окиси углерода, а также от других факторов, известных специалистам в данной области. Кроме того, следует иметь в виду, что для любого отдельного пациента конкретную схему введения можно со временем доводить в соответствии с индивидуальной необходимостью и по усмотрению вводящего или контролирующего специалиста, и что изложенный здесь диапазон концентраций является лишь примерным, и не предполагается ограничения им объема или действия заявленного изобретения. В настоящем изобретении предполагается острое, подострое или постоянное введение окиси углерода, в зависимости, например, от тяжести или продолжительности расстройства функции у пациента. Окись углерода может доставляться пациенту в течение времени (в том числе и неопределенного), достаточного для лечения состояния и осуществления фармакологического или биологического эффекта.

Ниже приводятся примеры некоторых способов и приборов, которые можно использовать для введения пациентам газообразных композиций окиси углерода.

Дыхательные аппараты

Окись углерода (концентрация может варьировать) можно закупить смешанной с воздухом или другим содержащим кислород газом в стандартном резервуаре для компримированного газа (например, 21% О₂, 79% N₂). Он инертен, а концентрации, которые нужны для осуществления способов согласно изобретению, гораздо ниже области воспламенения (10% в воздухе). В стационарных условиях газ должен предположительно доставляться прикроватно, где он должен смешиваться с кислородом или с комнатным воздухом в смесителе до требуемой концентрации. Пациент должен вдыхать газовую смесь с помощью дыхательного аппарата, который должен регулировать скорость газового потока, исходя из комфорта и потребности пациента. Это определяется с помощью легочных графиков (т.е., частоты дыхания, дыхательного объема и т.д.). В системе доставки можно создать устройства, ограждающие пациента от нежелательного получения превышающего требуемый уровень количества окиси углерода. Контролировать уровень окиси углерода у пациента можно путем анализа (1) карбоксигемоглобина (COHb), который можно измерить в венозной крови, и (2) выдыхаемой окиси углерода из отверстия с левой стороны дыхательного аппарата. Воздействие окиси углерода можно регулировать, учитывая состояние здоровья пациента и на основе показаний счетчика. При необходимости окись углерода можно "вымыть" из пациента путем переключения на 100%-ную ингаляцию О₂. Окись углерода не усваивается; поэтому все, что вдыхается, должно одновременно и выдыхаться, за исключением незначительной доли процента, которая превращается в СО₂. Окись углерода может также смешиваться с любым количеством О₂ для обеспечения терапевтической доставки окиси углерода без последующих гипоксических состояний.

Маска и палатка

Газовую смесь, содержащую окись углерода, получают, как указано выше, что позволяет ингалировать пациента с использованием маски или палатки. Вдыхаемая концентрация может меняться и может "вымываться" путем простого переключения на 100%-ное вдыхание О₂. Операцию контроля уровня окиси углерода предполагается производить на маске или вблизи нее, либо в палатке с помощью безопасного механизма, который мог бы предотвратить вдыхание чрезмерно высокой концентрации окиси углерода.

Портативный ингалятор

Компримированной окисью углерода можно снабдить переносное устройство для вдыхания и вдыхать контролируемую дозу, например, чтобы иметь возможность для периодической обработки пациента, который не находится в стационарных условиях. Контейнеры можно заполнить разными концентрациями окиси углерода. Устройство может быть представлено в виде простого, небольшого резервуара (например, менее 5 кг) с соответственно разбавленным СО и двухпозиционным клапаном и трубкой, из которой пациент втягивает струю СО в соответствии со стандартной схемой или по необходимости.

Интравенозное искусственное легкое

Искусственное легкое (зондовое устройство для газообмена в крови), предназначенное для доставки О₂ и удаления СО₂, можно использовать для доставки окиси углерода. Имплантируемый катетер остается в одной из больших вен и должен обладать способностью доставлять окись углерода в данной концентрации для системной доставки, либо в локальный участок. Доставка может представлять собой местную доставку окиси углерода в высокой концентрации в течение короткого периода времени в конкретный участок (эта высокая концентрация должна быстро разбавляться в кровотоке), или представлять собой сравнительно более длительное системное воздействие сниженной концентрации окиси углерода (см., например, Hattler et al., Artif. Organs 18(11):806-812, 1994; и Golob. et al, ASAIO J. 47(5):432-437, 2001).

Барокамера для создания нормального давления (Normоbaric chamber)

В некоторых случаях было бы желательно воздействовать окисью углерода на весь организм пациента. Пациент должен находиться внутри герметизированной камеры, которая должна быть заполнена окисью углерода (уровень которой не должен подвергать опасности данного пациента или уровень которой составляет приемлемую степень риска, безопасную для подвергающегося воздействию постороннего наблюдателя). По завершении экспонирования камеру следует очистить с помощью воздуха (например, 21% О₂, 79% N₂), а образцы проанализировать в анализаторе окиси углерода, чтобы гарантировать отсутствие остатков окиси углерода, перед тем как позволить пациенту покинуть данную систему экспонирования.

Водные растворы

В настоящем изобретении также считают, что для системной доставки пациенту, например, для пероральной доставки и/или путем инъекции в его тело, например, внутривенной, внутриартериальной, внутрибрюшинной и/или подкожной, можно создать водные растворы, содержащие окись углерода.

Буферы для сохранения и культуральную среду можно насытить до заданной концентрации окисью углерода с помощью диффузионного аппарата для газов или заранее приготовленными сток-растворами, которые подвергают контролю качества на содержание заданного уровня окиси углерода. Точный контроль дозирования осуществляют путем измерений с помощью мембраны, проницаемой для газа и непроницаемой для жидкости, соединенной с анализатором окиси углерода. Буферы и растворы можно насытить до требуемых эффективных концентраций и сохранять их на этом уровне. Что касается процедур, которые требуются для перфузии органа, ткани, или препарата клеток, предварительно приготовленные насыщенные растворы могут находиться под рукой для поддержания уровня окиси углерода. Если уровень окиси углерода снижен, вместо растворов, в которых концентрация окиси углерода снижена, можно добавить свежие растворы. После получения органа, ткани или клеток их можно сохранять в указанном растворе для транспортировки в герметичном контейнере. Присутствие инертного газа гелия делает поглощение окиси углерода более эффективным.

Местная обработка органов, тканей и выделенных клеток окисью углерода in situ и ex vivo

В настоящем изобретении представлены способы трансплантации органа(ов), тканей, групп клеток и/или выделенных клеток. Эти способы могут включать в себя стадию экспонирования органа(ов), тканей, группы клеток и/или выделенных клеток в присутствии композиции окиси углерода перед их трансплантацией. Такое экспонирование может происходить in situ и/или ex vivo. Орган(ы), ткани и/или выделенные клетки можно экспонировать в атмосфере, содержащей газ окись углерода, в жидкой композиции окиси углерода, например, в жидком перфузате, в растворе для хранения или в промывочном растворе с содержащейся в нем растворенной окисью углерода, или и в том, и в другом.

Экспонирование органа или ткани в присутствии жидких композиций окиси углерода можно осуществлять ex vivo и/или in situ с помощью любого способа, известного в данной области. Например, экспонирование можно осуществлять ex vivo в любой камере или в пространстве, обладающем достаточным объемом для погружения органа или ткани, полностью или частично, в композицию окиси углерода. В качестве другого примера, можно экспонировать данный орган в композиции окиси углерода путем помещения этого органа в любой подходящий контейнер, что позволяет композиции окиси углерода "омывать" помещенный орган так, чтобы этот орган подвергался непрерывному орошению композицией окиси углерода.

Альтернативно, трансплантируемый орган можно перфузировать композицией окиси углерода. Термин "перфузия" является общепризнанным термином и относится к протеканию жидкости, например, композиции окиси углерода, через кровеносные сосуды органа или ткани. Способы перфузии органов ex vivo и in situ хорошо известны в данной области. Орган можно перфузировать композицией окиси углерода ex vivo, например, с помощью аппарата для непрерывной гипотермической перфузии (см., Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press, 1994). Факультативно, при перфузиях in situ и ex vivo орган, перед перфузией с помощью композиции окиси углерода, можно перфузировать промывочным раствором, например, UW-раствором без окиси углерода, для удаления крови из донорского органа. Такую операцию следует осуществлять во избежание конкуренции за окись углерода гемоглобином донора. В качестве другого варианта, промывочный раствор может представлять собой композицию окиси углерода. Соответствующую жидкость можно пропускать через трубку, которая делает возможной диффузию газа; данная трубка проходит через атмосферу, содержащую окись углерода (например, через камеру, такую как оксигенатор с искусственной мембраной), для создания жидкой композиции окиси углерода, которая затем может переходить в орган (например, перфузировать орган путем присоединения трубки к этому органу).

Трансплантируемый орган или ткань можно поместить, например, погрузить, в среду или раствор, который не содержит окись углерода, а также поместить в камеру, в которой находится среда или раствор, содержащий газовую среду с окисью углерода. Альтернативно или в дополнение, окись углерода можно "барботировать" в данную среду или раствор. Выдерживание in situ можно осуществлять с помощью любого способа, известного в данной области, например, промывая или перфузируя орган с помощью жидкой композиции окиси углерода (смотрите Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press, 1994).

Настоящее изобретение предполагает, что для данной операции трансплантации можно использовать любой или все вышеуказанные способы экспонирования органа или ткани в жидкой композиции окиси углерода, например, промывку, погружение, или перфузию.

Настоящее изобретение предполагает также, что можно создать твердую или полужидкую композицию окиси углерода. Например, жидкость, которая представляет собой композицию окиси углерода, как указано выше, можно создать в виде твердой или полужидкой композиции, в которую орган или ткань можно внедрить или покрыть ею. Альтернативно, полужидкую композицию окиси углерода можно вливать в трансплантируемый орган. Твердые или полужидкие композиции можно создавать, например, путем добавления к используемой жидкости загущающего агента, такого как желатинирующий агент (например, коллаген или альгинат).

Культура клеток

В настоящем изобретении представлен способ поддержания или культивирования животной клетки in vivo. Способ может включать в себя стадии обеспечения емкости, содержащей герметизированный газ, в том числе газ окись азота, получение животной клетки in vitro и выпуск герметизированного газа из указанной емкости с образованием газовой среды, которая содержит газ окись углерода. Затем животную клетку культивируют или просто содержат в присутствии газовой среды, содержащей газ окись углерода.

Способ можно осуществить в любой камере или в пространстве, пригодных для создания газовой среды, которая включает в себя соответствующий уровень газа окись углерода. Такие камеры или площади содержат, например, инкубаторы, баллоны для смешивания, или любую емкость, пригодную для культивирования или содержания клеток, бутыли, содержимое которых перемешивается при их вращении, колбы для культивирования клеток, чашки Петри и пробирки. Например, можно использовать СО₂-инкубатор, в который газ окись углерода поставляется непрерывной струей из емкости, которая содержит этот газ. В качестве другого примера, можно использовать бутыль, содержимое которой перемешивается при ее вращении и в которую включена окись углерода, для создания внутри перемешивающей бутыли соответствующей газовой среды.

Практикующим специалистам очевидно, что условия культивирования, например, температуру, можно выбрать и/или изменить в зависимости от типа культивируемой клетки (см., например, Cells: A Laboratory Manual, Spector and Leinwand, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1997). Например, клеточную линию βТС3 мышиной инсулиномы (DSMZ, Braunschweig, Германия) можно инкубировать в увлажненном воздухе, содержащем 5% СО₂/95% воздуха при 37°С.

Животную клетку можно поместить, например, суспендировать или промыть в жидкой среде. Эта среда может представлять собой любую среду, известную специалистам в данной области, пригодную для культивирования, сохранения, или промывания представляющих интерес клеток (см., например, Cells: A Laboratory Manual, Spector and Leinwand, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1997). Такого типа среды включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, различные буферы, минимальную незаменимую среду Игла (MEM), минимальную незаменимую среду Игла в модификации Дюльбекко/Вогта (DMEM), или среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Такая среда может также включать в себя соответствующие добавки, например, эмбриональную бычью сыворотку (FBS), индивидуальные аминокислоты, антибиотики и/или витамины. Например, эта среда может быть средой RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, New York) c добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина G, 100 Ед/мл стрептомицина и 10% околоплодной сыворотки теленка (FCS) (Life Technologies). В тех вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых культивируемые клетки находятся в жидкой среде, эти клетки можно выдерживать с композицией окиси углерода путем контактирования этой жидкой среды с герметизированным газом, содержащим окись углерода, например, с газом окись углерода, выпускаемым из источника герметизированного газа, в соответствии со способами настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения жидкая среда сама представляет собой композицию окиси углерода, созданную, как указано выше. Данную среду можно инфузировать окисью углерода до или после добавления клеток к среде.

Кроме того, в настоящем изобретении предусматривается, что можно создать твердую или полужидкую среду, в которой твердая или полужидкая среда представляет собой композицию окиси углерода. Например, жидкую среду, которая представляет собой композицию окиси углерода, как указано выше, можно создать в виде твердой или полужидкой среды, в которую клетки могут быть погружены или включены. Такое действие можно осуществить, например, путем добавления в среду желатинирующего агента, такого как коллаген, альгинат или агар.

Использование гемокисгеназы-1, соединения, ассоциированные с гемоксигеназой-1, а также другие соединения, и обработка

В настоящем изобретении предусматривается также индукция или экспрессия гемоксигеназы-1 (HO-1) совместно с введением окиси углерода. HO-1 можно получить для пациента в результате индукции или экспрессии у пациента HO-1, или путем введения экзогенной HO-1 непосредственно данному пациенту. Используемый здесь термин "индуцировать" означает вызвать повышенное образование белка, например, HO-1, в выделенных клетках или в клетках ткани, органа или животного с использованием собственного клеточного эндогенного (например, нерекомбинантного) гена, который кодирует данный белок.

HO-1 можно индуцировать у пациента, например, донора и/или реципиента, с помощью любого способа, известного в данной области. Например, наработку HO-1 можно индуцировать с помощью гемина, с помощью железосодержащего протопорфирина или с помощью кобальтсодержащего протопорфирина. Сильными индукторами экспрессии HO-1 являются также разнообразные негемовые агенты, в том числе тяжелые металлы, цитокины, гормоны, окись азота, COCl₂, эндотоксин и тепловой шок (Otterbein et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1029-L1037, 2000; Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997; и Tenhunen et al., J. Lab. Clin. Med. 75:410-421, 1970). HO-1 сильно индуцируется также разнообразными агентами и состояниями, которые порождают окислительный стресс, в том числе перекись водорода, истощающие глутатион агенты, УФ-облучение и гипероксия (Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997; и Keyse et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:99-103, 1989). "Фармацевтическая композиция, содержащая индуктор HO-1", подразумевает фармацевтическую композицию, содержащую любой агент, способный индуцировать у пациента HO-1, например, любой из вышеописанных агентов, например, гемин, железосодержащий протопорфирин, и/или кобальтсодержащий протопорфирин.

Экспрессию HO-1 можно повысить путем генного переноса. Используемый здесь термин "экспрессировать(руемый)" означает вызвать в выделенных клетках или в клетках ткани, органа или животного, путем экзогенно введенного гена (например, рекомбинантного гена), повышенное образование белка, например, HO-1 или ферритина. Предпочтительно, чтобы в качестве реципиента трансплантата HO-1 или ферритина выступал представитель того же вида (например, человек, мышь, крыса и т.п.), с тем, чтобы минимизировать любую иммунную реакцию. Экспрессией можно управлять с помощью конститутивного промотора (например, цитомегаловирусных промоторов) или с помощью тканеспецифического промотора (например, промотора сыворотки молока в случае клеток молочной железы или альбуминового промотора в случае клеток печени). Соответствующий генотерапевтический вектор (например, ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус (AAV), поксвирус (например, вирус коровьей оспы), вирус иммунодефицита человека (HIV), карликовый вирус ("минут-вирус") мышей, вирус гепатита В, вирус гриппа, вирус-1 простого герпеса и лентивирус), кодирующий HO-1 или ферритин, следует вводить пациенту перорально, путем ингаляции, или путем инъекции в соответствующий сайт трансплантации для лечения отторжения трансплантата. Особенно предпочтительным является местное введение непосредственно в трансплантируемые орган, ткань или клетки донора, или в сайт трансплантации у реципиента. Аналогичным образом плазмидные векторы, кодирующие HO-1 или апоферритин, например, в виде оголенной ДНК можно вводить в составе липосом или микрочастиц.

Кроме того, экзогенный белок HO-1 можно вводить непосредственно пациенту с помощью любого способа, известного в данной области. Экзогенный HO-1 можно прямо вводить, в дополнение, или в виде альтернативы, для индукции у пациента экспрессии HO-1, как указано выше. Белок HO-1 может быть введен пациенту, например, в составе липосом, и/или в виде слитого белка, например, в виде TAT-слитого белка (см., например, Becker-Hapak et al., Methods 24:247-256, 2001).

Альтернативно или в дополнение, пациенту можно вводить любой из продуктов метаболизма HO-1, например, билирубин, биливердин, железо, и/или ферритин, вместе с окисью углерода или вместо нее, для предупреждения или лечения нарушения. Кроме того, настоящим изобретением предусматривается, что пациенту можно вводить отличные от ферритина молекулы, связывающие железо, например, дефероксамин (DFO), декстран-железо, и/или апоферритин. Любое из вышеуказанных соединений можно вводить пациенту местно и/или системно.

В настоящем изобретении предполагается также введение пациенту окиси азота (NO) в орган(ы), ткань(и) и/или в выделенные клетки вместе с введением окиси углерода, HO-1 и/или соединений, ассоциированных с HO-1. Данный метод включает в себя снабжение NO донора, реципиента, или органа, ткани или клетки ex vivo, наряду с введением HO-1 и/или любого из продуктов деградации гема либо всех продуктов деградации гема, например, СО, биливердина, билирубина, железа и ферритина.

Используемый здесь термин "окись азота" или ("NO") характеризует молекулярную форму окиси азота в ее газообразном состоянии или растворенном в водном растворе. Газообразные композиции, содержащие NO, вводят, как правило, путем ингаляции через рот или носовые ходы в легкие, где NO может действовать непосредственно или легко поглощаться кровотоком пациента. Компримированный или герметизированный газ, например, NO (и/или СО, как указано более подробно выше), пригодный для способов согласно изобретению, можно получить из любого коммерческого источника и в емкости любого типа, подходящей для хранения компримированного газа. Если понадобится, способы согласно изобретению можно осуществлять с использованием объединенных сосудов, содержащих индивидуальные газы. Альтернативно, СО и NO можно объединить в одном сосуде, разбавленными, при необходимости, инертным газом.

NO для ингаляции коммерчески доступен (например, INOmax^TM, INO Therapeutics, Inc., Clinton, NJ). Этот газ можно приобрести, как правило, в виде смеси 200-800 ppm NO в чистом N₂-газе. Поставляемый газ NO может представлять собой практически 100% NO или разбавленный N₂ или любым иным инертным газом (например, гелием) до любой требуемой концентрации. Жизненно важным является то обстоятельство, что определенную NO получают и хранят в виде смеси, свободной от любой примеси О₂ или высших окислов азота, потому что такие высшие окислы азота (которые можно получить в реакции О₂ с NO) являются потенциально вредными для легочных тканей. При необходимости, степень очистки NO, перед введением ее пациенту, можно показать в хемилюминесцентном анализе с использованием известных способов. Хемилюминесцентные анализаторы NO-NO_x коммерчески доступны (например, Model 14A, Thermo Environmental Instruments, Franklin, MA). Смесь NO-N₂ можно смешать с газом, содержащим О₂ (например, 100%-й О₂ или воздух), непосредственно перед ингаляцией, с использованием, например, расходомера, калибровка которого была подтверждена раньше с помощью спирометра. Конечную концентрацию NO во вдыхаемой смеси можно проверить с помощью химического или хемилюминесцентного метода, хорошо известного специалистам в данной области (например, Fontijin et al., Anal. Chem. 42:575, 1970). Альтернативно, концентрации NO и NO₂ можно контролировать с помощью электрохимического анализатора. Любые примеси, такие как NO₂, можно очистить в результате их выдерживания с растворами NaOH, баралима или натронной извести. В качестве дополнительного контроля можно также определить FiO₂ конечной газовой смеси.

Фармацевтические композиции, содержащие NO, можно вводить любым из известных в данной области способов введения газов пациентам. Безопасные и эффективные способы введения NO путем ингаляции описываются, например, в патенте США №5570683; в патенте США №5904938; и у Frostell et al., Circulation 83:2038-2047, 1991. Некоторые примеры способов введения газов (таких как СО) пациентам подробно рассмотрены выше и могут использоваться для введения NO. Примеры способов и приборов, которые можно использовать для введения пациентам газообразных фармацевтических композиций, в том числе NO, включают в себя аппарат искусственной вентиляции легких, лицевые маски и палатки, портативные ингаляторы, внутривенные имитаторы дыхания (см., например, Hattker et al., Artif. Organs 18(11):806-812, 1994; и Golob et al., ASAIO J., 47(5):432-437, 2001), и барокамеры для создания нормального давления. Однако свойства NO могут допускать/требовать внесения некоторых модификаций в эти способы. В стационарных условиях или при неотложных полевых ситуациях введение газа NO можно осуществить, например, путем присоединения емкости с компримированным NO-газом в N₂ со второй емкостью с кислородом или смесью кислород/N₂ (такой как воздух), чтобы ингалятор создавал смешанный газ из двух источников. Концентрацию ингалируемого пациенту NO можно поддерживать на оптимальном уровне, контролируя поток газа из каждого источника. NO можно также смешивать с комнатным воздухом, с использованием медленно смешивающего смесителя (например, Bird Blender, Palm Springs, CA). NO можно создать из N₂ и О₂ (т.е., воздуха), используя электрический генератор NO. Подходящий генератор NO описан в патенте США № 5396882. Кроме того, NO можно создавать периодически в ингаляторном устройстве с помощью источника NO, такого как компримированная NO или электрический генератор NO. Использование ингалятора особенно выгодно, если второе соединение (например, фосфодиэстеразный ингибитор, который подробно описан ниже), вводится перорально или путем ингаляции, совместно с NO.

Предпочтительно, если в фармацевтической композиции, содержащей газ NO, концентрация NO в воздухе, в чистом кислороде или в другом подходящем газе или газовой смеси в момент ингаляции составляет примерно от 0,1 ppm до 300 ppm, например, 0,5-290 ppm, 1,0-280 ppm, 5-250 ppm, 10-200 ppm, или 10-100 ppm. Подходящая стартовая доза для NO, вводимая путем ингаляции, может составлять 20 ppm (см., например, рекламный вкладыш в упаковку товара INOmax^TM), и эту дозу можно изменять, например, от 0,1 ppm до 100 ppm, в зависимости от возраста и состояния пациента, конкретного заболевания или расстройства, которое лечат, и иных факторов, которые лечащий врач может посчитать уместными. В настоящем изобретении предусматривается экстренное, субэкстренное и регулярное введение NO. NO можно доставлять пациенту в течение времени (в том числе и неопределенного), достаточного для лечения состояния и достижения намеченного фармакологического или биологического эффекта. Концентрацию можно временно повысить в течение короткого периода времени, например, 5 мин при 200 ppm NO. Это можно сделать, когда необходимо добиться непосредственного эффекта. Предпочтительные периоды, в течение которых пациент подвергается воздействию NO, включают в себя по меньшей мере один час, например, по меньшей мере шесть часов; по меньшей мере один день; по меньшей мере одну неделю, две недели, четыре недели, шесть недель, восемь недель, десять недель или двенадцать недель; по меньшей мере один год; по меньшей мере два года и по меньшей мере пять лет. Пациента можно подвергать воздействию газовой атмосферы непрерывно или периодически в течение таких периодов. Введение фармацевтических композиций, содержащих NO (и/или СО), можно осуществить путем спонтанного или механического вентилирования.

Когда вводят вдыхаемый NO, желательно контролировать эффекты, вызываемые NO-ингаляцией. Такой мониторинг у конкретного индивидуума можно использовать для проверки нужных эффектов и для идентификации нежелательных побочных эффектов, которые могут возникать. Такой мониторинг полезен также для регулировки дозового уровня, длительности и частоты введения вдыхаемого NO у данного индивидуума.

Газообразную NO можно растворить в водном растворе и использовать в этой форме. Например, такой раствор следует использовать для омывания органа, ткани или клеток ex vivo или использовать для перфузии органа или ткани in situ. Раствор может содержать другие активные агенты, такие как СО, HO-1, гем, биливердин, и/или билирубин.

Было бы желательно пролонгировать благоприятное действие вдыхаемой NO на данного пациента. Чтобы определить, каким образом пролонгировать благоприятное действие вдыхаемой NO, полезно иметь в виду, что одно из in vivo-действий NO заключается в активации растворимой гуанилатциклазы, которая стимулирует образование цГМФ. По меньшей мере, несколько благоприятных эффектов NO может проистекать вследствие ее стимуляции биосинтеза цГМФ. В соответствии с этим, ингибитор фосфодиэстеразы можно вводить вместе с ингалируемой NO для подавления распада цГМФ эндогенной фосфодиэстеразой.

Фосфодиэстеразный ингибитор можно вводить пациенту с помощью любого подходящего способа, в том числе перорального, через слизистую оболочку, внутривенного, внутримышечного, подкожного или внутрибрюшинного. Альтернативно, пациент может вдыхать данный ингибитор. Для ингаляции фосфодиэстеразный ингибитор создается в виде сухого порошка или в виде аэрозоля, или в виде распыляемого раствора, имеющего размер частиц или капель менее 10 мкм для оптимального осаждения в альвеолах, и может факультативно вводиться в газ, содержащий NO.

Подходящий фосфодиэстеразный ингибитор представляет собой Zaprinast^тм (M&B 22948; 2-o-пропоксифенил-8-азапурин-6-он; Rhone-Poulenc Rorer, Dahenham Essex, UK). Zaprinast^тм избирательно ингибирует гидролиз цГМФ с минимальным эффектом разрушения аденозинцикломонофосфата в клетках гладких мышц сосудов (Trapani et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 258:269, 1991; Harris et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 249:394, 1989; Lugnier et al., Biochem. Pharmacol. 35:1743, 1986; Souness et al., Br. J. Pharmacol. 98:725, 1989). При использовании Zaprinast^тм, в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительными путями введения являются внутривенный или пероральный. Подходящий дозовый диапазон может определить рядовой специалист в данной области. Основной раствор Zaprinast^тм можно приготовить в 0,05 н NaOH. Сток-раствор можно разбавить до требуемой концентрации Zaprinast молочнокислым раствором Рингера непосредственно перед использованием.

На практике настоящее изобретение можно осуществить и с другими фосфодиэстеразными ингибиторами. В данной области известны разнообразные фосфодиэстеразные ингибиторы, в том числе Viagra® (силденафила цитрат) дипиридамоль и теофиллин. Соответствующий путь введения и соответствующий дозовый диапазон может определить рядовой специалист в данной области.

Введение NO вместе с фосфодиэстеразными ингибиторами можно осуществить следующим образом. NO вводят при 20 ppm в воздухе в течение 45 мин в начале 45-минутного периода путем внутривенного вливания в течение 4-х мин вводят Zaprinast^тм из расчета 1,0 мг на кг массы тела, с последующим непрерывным вливанием 0,004 мг/кг/мин в течение последующего 45-минутного периода. Альтернативно, в начале 45-минутного периода в течение 4 мин вводят дипиридамоль из расчета 0,15 мг на кг массы тела с последующим непрерывным вливанием 0,004 мг/кг/мин в течение последующего 45-минутного периода. Zaprinast^тм или дипиридамоль вводят в физиологическом растворе.

В случае трансплантации в настоящем изобретении дополнительно предусматривается, что наряду с описанными здесь способами могут использоваться и другие способы повышения жизнеспособности функциональности трансплантата. Такие методы включают в себя, не ограничиваясь этим, иммунодепрессивную терапию и донорспецифичное переливание крови (DST). Например, DST можно назначить реципиенту до, во время и/или после введения СО, HO-1, других гемассоциированных продуктов и/или NO. Такое введение, например, назначение DST, наряду с описанным здесь лечением, можно осуществить до, во время и/или после трансплантации.

Пример 1. Окись углерода защищает бета-клетки поджелудочной железы от апоптоза и улучшает островковую функциональность/выживаемость после трансплантации

Клеточные культуры

Инсулиномную клеточную линию βТС3 мышей (DSMZ, Braunschweig, Германия) культивируют в модифицированной Дюльбекко среде Игла (DMEM) (Life technologies, Grand Island, NY, США) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина G, 100 Ед/мл стрептомицина и 10% околоплодной сыворотки теленка (FCS) (Life Technologies) и инкубируют в увлажненной атмосфере 5% СО₂/95% воздуха при 37°С. Такая мышиная β-клеточная линия получена от трансгенных мышей, несущих гибридный инсулин-промоторный опухолевый антиген вируса SV 40, который, как известно, поддерживает признаки дифференцированных β-клеток на протяжении приблизительно 50 пассажей в культуре. Эти клетки продуцируют зрелый инсулин из проинсулина I и II способом, сопоставимым с β-клеточным способом in vivo, и индуцируются 30-кратно с помощью глюкозы (Efrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9037-41, 1988). По сравнению с другими часто используемыми трансформированными β-клеточными линиями, такими как RIN-m5F и HIT, уровни секретируемого инсулина клетками линии βТС3 близки уровню секреции инсулина нормальными β-клетками. Следовательно, данные клетки пригодны для изучения β-клеточной регуляции и генной экспрессии (D'Ambra et al., Endocrinology 726:2815-22, 1990).

Островки Лангерганса поджелудочной железы мышей C57BL/6 были получены путем выделения островков с помощью оборудования в Joslin Diabetes Center.

Витальное окрашивание кристаллвиолетом

βТС3 выращивают до концентрации 2 х 10⁵ клеток (Nunc, Marsh Products, Rochester, NY, США). Клетки однократно промывают с помощью 500 мкл PBS и окрашивают с помощью 200 мкл 0,05%-го кристаллвиолета в 20%-м этаноле в течение 10 мин при КТ. Смывают кристаллвиолет. Для элюирования красителя из клеток в каждую лунку приливают по 100 мкл 50%-й уксусной кислоты. 50 мкл переносят в 96-луночный планшет для микротитрования и считывают с помощью считывающего устройства для микротитровальных планшет (биокинетическое считывающее устройство EL 340, Bio-Tek Instruments) величину поглощения при 562 нм.

Экспрессирующие плазмиды

β-галактозидазный экспрессирующий вектор (Clontech Laboratories, Palo Alto, California) клонируют в pcDNA3-вектор (Sato et al., J. Immunol. 166:4185-4194, 2001). (Invitrogen, Carlsbad, California). 1,0 т.п.н. XhoI-HindIII-фрагмент, кодирующий полноразмерную кДНК HO-1 крысы, вырезают из prHO-1-вектора (Shibahara et al., J. Biochem. 113:214-218, 1993) и субклонируют в pcDNA3-вектор.

Транзиторные трансфекции

βТС3 выращивают в 16 мм-овых лунках до концентрации 3 х 10⁵ клеток и трансфицируют через 15-20 часов с помощью реагентов липофектамин плюс^ТМ (Life Technologies), в соответствии с инструкциями производителя. Тотальную ДНК сохраняют константной с использованием пустого pcDNA3-вектора. Процент жизнеспособных клеток оценивают путем деления процентной доли жизнеспособных клеток в каждом ДНК-препарате к числу контрольных трансфицированных клеток без апоптозного стимула (100%-я выживаемость) (Soares et al., Nature Med. 4:1073-1077, 1998; Sato et al., J. Immunol. 166:4185-4194).

Проточная цитометрия

Культуры βТС3 инкубируют с рекомбинантным TNF-α (500 или 1000 Ед/мл) (R&D Systems) в течение 24 часов, и островковые культуры стимулируют TNF-α (5000 Ед/мл) (R&D Systems) и циклогексамида (CHX) (50 мкг/мл) в течение 48 часов. βТС3 или островки собирают, диспергируют, фиксируют в 70%-ном этаноле и суспендируют в буфере для окраски ДНК (PBS, рН 7,4, содержащий 0,1% Тритона Х-100, 0,1 мМ ЭДТА, 50 мкг/мл пропидийиодида, 50 мг/мл РНКазы А). Содержание ДНК анализируют на анализаторе FACScan^TM, снабженном программным обеспечением Cell Quest^тм (Becton Dickinson, Palo Alto, CA). Клетки с нормальным содержанием ДНК (2n) оценивают в качестве жизнеспособных, а клетки с гипоплоидным содержанием ДНК (<2n, обозначенным А°) оценивают как апоптозные. Для исключения дебриса и неклеточных апоптозных фрагментов, все частички с профилем области FL-2 ниже такового у ядер эритроцитов цыпленка, были исключены из анализа.

Обработка клеток и реагенты

Мышиный рекомбинантный TNF-α (R&D Systems) растворяют в PBS с 1% бычьим сывороточным альбумином, и этот раствор вливают в культуральную среду (17,5 нг/мл = 500 Ед) через 24 часа после трансфекции. Ингибитор каспазы-3 Z-DEVD-FMK и ингибитор каспазы-8 IETD-CHO (Calbiochem, San Diego, California) растворяют в диметилсульфоксиде (DMSO, Sigma) и добавляют в культуральную среду (соответственно, 10 мкМ и 1 мкМ) через два часа после обработки TNF-α. Оловосодержащий протопорфирин (SnPPIX) (Pophyrin Products, Logan, Utah) растворяют (10 мМ) в 100 мМ NaOH и добавляют в культуральную среду (50 мкМ) через 6 часов после трансфекции. Гуанилилциклазный ингибитор 1Н[1,2,4]оксадиазоло[4,3-α]хиноксалин-1 (ODQ; Calbiochem) растворяют в DMSO и добавляют в культуральную среду (100 мкМ) через 6 часов после трансфекции. 8-Бромгуанозин-3'-5'-цикломонофосфат (8-Br-цГМФ) (Sigma), аналог цГМФ, растворяют в воде и добавляют в культуральную среду (10 мкМ) за 30 минут до индукции апоптоза. Ингибитор протеинкиназы G KT5823 (Calbiochem) растворяют в DMSO и добавляют в культуральную среду (1,6 мкМ) через 6 часов после трансфекции.

Экспонирование с СО

Клетки и островки экспонируют с 1% окиси углерода в компримированном воздухе, уравновешенном с 5% СО₂, как описано в других источниках (см., например, Otterbein et al., Nature med. 6:422-428, 2000). Островки инкубируют в среде RPMI, предварительно насыщенной окисью углерода (4°С в течение ночи, 1% СО, 5% СО₂) в течение двух часов при 37°С, наряду с обработкой 1% СО, 5% СО₂.

Мыши и индукция диабета

Самцов C57BL/6 закупают в Charles River Laboratories (Wilmington. Massachusetts) и содержат в соответствии с указаниями NIH. Данные эксперименты одобрены Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). У мышей-реципиентов (в возрасте 8 недель) воспроизводят диабет с помощью однократной внутрибрюшинной инъекции (220 мг/кг) Streptozotocin^тм (Sigma), растворенного в цитратном буфере. Мышей-пациентов подвергают трансплантации в том случае, если в образце цельной крови были получены 2 последовательных измерения уровня глюкозы крови, устойчиво не превышающие значение 350 мг/дл.

Выделение островков

Островки Лангерганса поджелудочной железы (мыши C57BL/6), представленные Islet Core Laboratory of the JDRF Center for Islet Transplantation at Harvard Medical School, выделяют так, как описано ранее (Gotoh et al., Transplantation 40:437-438, 1985).

Трансплантация сингенных маргинальных островков

250 островков диаметром 150-250 мкм получают вручную с использованием микротомного микроскопа. Островки трансплантируют в почечную капсулу, как описано ранее (Kaufman et al., J. Exp. Med. 172:291-302, 1990). Одно и то же число контрольных и обработанных животных подвергают трансплантации каждым из островковых препаратов.

Результаты анализа функционирования трансплантата

Функцию трансплантата определяют как точку, в которой в первый из трех последовательных дней уровень глюкозы крови не натощак устойчиво составляет <200 мг/дл. Первичную конечную точку эксперимента определяют как время достижения нормогликемии.

Статистический анализ

Данные по глюкозе крови суммируют в виде среднего ± стандартное отклонение для мышей, получающих необработанные или обработанные островки. Время восстановления функции островка вычисляют с использованием таблиц продолжительности жизни по Kaplan-Meier, и различия между группами определяют с использованием логарифмического рангового критерия для трех островковых препаратов, обработанных в данном анализе в виде раздельных рядов, и среднего времени восстановления, с 95%-ным доверительным интервалом.

TNF-α индуцирует апоптоз в βТС3-клетках

Исследовано влияние TNF-α на βТС3-клетки. Для получения данных, проиллюстрированных на Фиг.1А-С, используют следующие операции. Фиг.1А: βТС3-клетки обрабатывают увеличивающимися концентрациями TNF-α. Жизнеспособные клетки окрашивают через 24 часа после активации кристаллвиолетом. Экстинкцию измеряют при 562 нм и нормируют к необработанным клеткам. Фиг.1В: клетки βТС3 обрабатывают TNF-α, окрашивают пропидийиодидом через 24 часа и анализируют на ДНК-фрагментацию (FACScan^TM). Фиг.1С: клетки βТС3 котрансфицируют векторам, экспрессирующим β-gal (pcDNA3/β-gal) плюс контроль (pcDNA3). Где указано, клетки обрабатывают ингибитором каспазы-3 Z-DEVD-FMK (C3-i) или ингибитором каспазы -8 IETD-CHO (C8-i). Гистограммы серого цвета соответствуют необработанным β-клеткам, а гистограммы черного цвета соответствуют β-клеткам, обработанным с помощью TNF-α в течение 24 часов. Результаты представлены в виде среднего для продублированных лунок, соответствующих одному из трех репрезентативных экспериментов ± стандартное отклонение.

TNF-α индуцирует высокий дозозависимый уровень клеточной смерти в инсулиномной клеточной линии βТС3 (Stephens et al., Endocrinology 140:3219-3227, 1999) (Фиг.1А). ДНК-фрагментация, демонстрируемая по окраске (Фиг.1В) пропидийиодидом (PI), дает основание полагать, что TNF-α индуцирует смерть β-клеток в результате апоптоза. TNF-α-опосредованный апоптоз напрямую зависит от активации каспазы-8 и частично зависит от каспазы-3, что иллюстрируется данными блокирования каспазы-8 специфическим ингибитором каспазы-8 (IETD-CHO), предотвращающим апоптоз (96%-е ингибирование), тогда как блокирование каспазы-3 специфическим ингибитором каспазы-3 (Z-DEVD-FMK) предотвращает апоптоз лишь частично (53%-е ингибирование) (Фиг.1С).

Окись углерода защищает βТс3-клетки

Исследуют, может ли окись углерода защитить от апоптоза β-клетки (Фиг.2А-С). Для получения данных, проиллюстрированных на Фиг.2А-С, используют следующие операции. Фиг.2А: Экзогенная СО может заменить HO-1 в том случае, если активность HO-1 блокируется. Клетки βТС3 котрансфицируют вектором, экспрессирующим β-gal плюс контроль, или HO-1-экспрессирующим вектором (Brouard et al., J. Exp. Med. 192:1015-1026, 2000). В том случае, если указано, энзиматическую активность HO-1 ингибируют оловосодержащим протопорфирином (SnPP). Если указано, β-клетки экспонируют с экзогенной окисью углерода (1%), как описано ранее (Otterbein et al., Nature Med. 6:422-428, 2000). Гистограммы серого цвета соответствуют необработанным β-клеткам, а гистограммы черного цвета соответствуют β-клеткам, обработанным TNF-α. Полученные результаты представляют собой среднее для сдублированных лунок, соответствующих одному из трех репрезентативных экспериментов, ± стандартное отклонение. Фиг.2В: в анализе ДНК-фрагментации экзогенная окись углерода защищает β-клетки от апоптоза. Клетки βТС3 обрабатывают TNF-α. Тотчас после стимуляции клетки βТС3 экспонируют с экзогенной окисью углерода в течение 24 часов. Контрольные βТС3-клетки обрабатывают таким же образом, но не экспонируют с окисью углерода. Через 24 часа клетки окрашивают пропидийиодидом и анализируют на ДНК-фрагментацию в FACScan^TM. Фиг.2С: экзогенная окись углерода в отсутствие HO-1 защищает β-клетки от апоптоза. Клетки βТС3 трансфицируют вектором, экспрессирующим β-gal, и экспонируют с экзогенной окисью углерода (Stephens et al., Endocrinology 740:3219-27, 1999). Гистограммы серого цвета соответствуют необработанным β-клеткам, и гистограммы черного цвета соответствуют β-клеткам, обработанным, как указано, TNF-α или этопозида, или подвергают сывороточной депривации. Полученные результаты представляют собой среднее для повторных лунок, соответствующих одному из трех репрезентативных экспериментов, ± стандартное отклонение.

Чтобы оценить, действительно ли экспрессия HO-1 будет защищать β-клетки от апоптоза, опосредованного TNF-α, клетки βТС3 транзиторно трансфицируют экспрессирующим HO-1 вектором и тестируют их способность выживать при экспонировании с TNF-α. Сверхэкспрессия HO-1 защищает βТС3 от опосредованного TNF-α апоптоза (Pileggi et al., Diabetes 50:1983-1991, 2001) (87% выживания против 33% в контроле) (Фиг.2А). Если активность HO-1 блокировать оловосодержащим протопорфирином IX (SnPPIX) (Kappas et al., Hepatology 4:336-341, 1994), антиапоптозный эффект супрессируется (Фиг.2А), что наводит на мысль, что образование с помощью HO-1 по меньшей мере одного из конечных продуктов катаболизма гема, т.е. железа, билирубина и/или СО, необходимо для ее антиапоптозной функции.

В предположении, что антиапоптозный эффект HO-1 может быть опосредован окисью углерода, проверяли, будет ли экспонирование экзогенной окиси углерода замещать HO-1 в защите β-клеток от апоптоза. Когда действие HO-1 супрессируется под действием SnPPIX, экспонирование окиси углерода вызывает супрессию опосредованного TNF-α апоптоза до уровня сходного с уровнем HO-1 (Фиг.2А). Экспонирование с одной только экзогенной окисью углерода оказывается защитным (11,7% апоптозных клеток против 20,3; в контроле без экспонирования с СО), что показано с помощью анализа ДНК-фрагментации (Фиг.2В). Аналогично, β-клеточный апоптоз, индуцированный этопозидом или в результате истощения сыворотки, тормозится при экспонировании с окисью углерода (Фиг.2С).

Индукция у доноров и реципиентов HO-1 приводит к пролонгированному выживанию трансплантата островков

Выясняют, будет ли индукция HO-1 у доноров и реципиентов защищать островковые клетки трансплантата. Для получения данных, представленных ниже в Таблице 1, осуществляют следующие действия. В экспериментах используют мышиную модель. Доноров островковых клеток подвергают воздействию кобальтсодержащего протопорфирина (CoPP) (20 мг/кг) один раз в день перед выделением островковых клеток. Реципиентов трансплантатов островковых клеток подвергают воздействию CoPP (20 мг/кг) один раз в день в дни 1, 3, 5, 7, либо воздействию CoPP (10 мг/кг) один раз в день в дни 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 и 17. Назначение CoPP индуцирует экспрессию гемоксигеназы-1 (HO-1).

Таблица 1 Индукция HO-1 у доноров и реципиентов приводит к пролонгированному выживанию островкового трансплантата Обработка Численность островков День отторжения Средняя±SD Отторжение/Всего CoPP 20 мг/кг х 5 350-400 17, 33, 33, 48, >58x2, >67 x 1 44,85±17,81 4/7 CoPP 10 мг/кг х 10 350-400 30, 30, >51 x 2 40,5±12,12 2/4 Контроль 350-400 8,8,15,15,16,22,26 15,71±6,65 7/7

Перечисление в графе "день отторжения" соответствует дням, до которых выживают островки. Например, ">51х2", означает, что островки у 2-х реципиентов все еще остаются жизнеспособными после 51 дня. Срок отторжения в среднем представлен в четвертой колонке. Эти данные свидетельствуют о том, что индукция HO-1 приводит к более длительной выживаемости островков после трансплантации.

Экзогенная окись углерода защищает мышиные островковые клетки от апоптоза

Выясняют также, защищает ли от апоптоза экзогенная окись углерода мышиные островковые клетки (Фиг.3). Для получения данных, представленных на Фиг.3, используют следующие методы. Апоптоз индуцируют в свежевыделенных мышиных островках (C57BL/6) путем стимуляции под действием TNF-α и циклогексимида (CHX). Сразу после стимуляции островки экспонируют в течение 24 часов с экзогенной окисью углерода. Контрольные островки обрабатывают таким же образом, но без экспонирования с окисью углерода. Через 48 часов клетки анализируют в FACScan^TM на ДНК-фрагментацию. Этот эксперимент осуществляли дважды с неотличимыми результатами.

Как установлено с помощью анализа ДНК-фрагментации (Фиг.3), экспонирование с окисью углерода в течение 24 часов защищает выделенные мышиные (C57BL/6) островки Лангерганса от апоптоза, опосредованного TNF-α плюс циклогексимид (CHX) (11,7% апоптозных клеток против 20,3% в контроле, которые не экспонируют с СО).

Антиапоптозный эффект экзогенной окиси углерода опосредуется гуанилатциклазной активацией и сигналами цГМФ-зависимых протеинкиназ (cGK)

Выясняют, проявляет ли антиапоптозный эффект окись углерода путем активации растворимой гуанилатциклазы (sGC) и образования цГМФ (Фиг.4А-С). Для получения данных, представленных на Фиг.4А-С, осуществляют следующие действия. Фиг.4А: Антиапоптозный эффект экзогенной окиси углерода опосредован активацией гуанилатциклазы. Клетки βТС3 трансфицируют векторами, экспрессирующими β-gal, и экспонируют с экзогенной окисью углерода (1%). Там, где указано, клетки βТС3 обрабатывают гуанилилциклазновым ингибитором ODQ. Фиг.4В: аналог цГМФ заменяют окисью углерода для защиты от апоптоза. Клетки βТС3 трансфицируют с помощью векторов, экспрессирующих β-gal. Там, где указано, клетки βТС3 экспонируют с экзогенной окисью углерода. Там, где указано, клетки βТС3 обрабатывают цГМФ -аналогом 8-Br- цГМФ, но не экспонируют с окисью углерода. Фиг.4С: цГМФ-зависимые протеинкиназы (cGK) опосредуют антиапоптозный эффект окиси углерода. Клетки βТС3 котрансфицируют вектором, экспрессирующим β-gal. Там, где указано, клетки βТС3 экспонируют с экзогенной окисью углерода. Там, где указано, клетки обрабатывают KT5823 (KT), ингибитором протеинкиназы G. Гистограммы серого цвета соответствуют необработанным β-клеткам, а гистограммы черного цвета соответствуют β-клеткам, обработанным TNF-α. Полученные результаты представляют собой среднее для повторных лунок, соответствующих одному из трех репрезентативных экспериментов, ± стандартное отклонение.

Выясняют, проявляет ли антиапоптозный эффект окись углерода в результате активации растворимой гуанилатциклазы и образования цГМФ (как описано для фибробластов) (Petrache et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 278:L312-319, 2000). Ингибирование активности sGC оксадиазолохинооксалином (ODQ) супрессирует антиапоптозный эффект СО, что позволяет предположить, что растворимая гуанилатциклаза является основным посредником для окиси углерода в этой экспериментальной системе (Фиг.4А). cGK-активатор/цГМФ-аналог, 8-Br-цГМФ, супрессирует апоптоз βТС3-клеток до уровня, аналогичного тому, который наблюдается для окиси углерода (Фиг.4В). Кроме того, цГМФ-зависимые протеинкиназы благодаря специфическому ингибитору KT5823 супрессируют антиапоптозный эффект экзогенной окиси углерода (Фиг.4С), в предположении, что антиапоптозный эффект экзогенной окиси углерода опосредован активацией одной или нескольких цГМФ-зависимых протеинкиназ.

Экзогенная окись углерода создает защиту против апотоза в разных схемах опыта

Исследуют способность окиси углерода защищать β-клетки после индукции апоптоза (Фиг.5А-С). Для получения данных, представленных на Фиг.5А-С, осуществляют следующие действия. Фиг.5А: одного часа экспонирования с окисью углерода оказывается достаточным для предотвращения апоптоза. Клетки βТС3 трансфицируют векторами, экспрессирующими β-gal. Апоптоз β-клеток индуцируют TNF-α. Сразу после TNF-α-активации клетки экспонируют в течение разного времени (0-24 часа) с 1% окисью углерода. Контрольные βТС3 обрабатывают таким же образом, но без экспонирования с окисью углерода. Выживаемость клеток определяют через 24 часа после применения TNF-α. Фиг.5В: окись углерода защищает β-клетки после индукции апоптоза. βТС3 трансфицируют векторами, экспрессирующими β-gal. Апоптоз индуцируют TNF-α. После разного времени индукции (0,5-12 часов, как указано) βТС3 экспонируют с 1% окисью углерода (Otterbein et al., Nat. Med. 6:422-428, 2000). Контрольные βТС3 обрабатывают таким же образом, но без экспонирования с окисью углерода. Выживаемость клеток определяют через 24 часа после применения TNF-α. Фиг.5С: преинкубация с окисью углерода предотвращает апоптоз β-клеток. βТС3 трансфицируют векторами, экспрессирующими β-gal, и апоптоз индуцируют под действием TNF-α. βТС3 предварительно экспонируют с 1% окисью углерода в течение одного часа. Контрольные βТС3 обрабатывают таким же образом, но без экспонирования с окисью углерода. Через 1-6 часов после окончания предварительной экспозиции, индуцируют апоптоз под действием TNF-α. Гистограммы серого цвета соответствуют необработанным β-клеткам, а гистограммы черного цвета соответствуют β-клеткам, обработанным TNF-α. Полученные результаты представляют собой среднее для повторных лунок, соответствующие одному из трех репрезентативных экспериментов, ± стандартное отклонение.

βТС3 экспонируют с окисью углерода в течение разных периодов времени (1-24 часа) сразу после добавления TNF-α и проверки на апоптоз через 24 часа. Одного часа экспозиции с окисью углерода оказывается достаточным для предотвращения апоптоза β-клеток (Фиг.5А).

Чтобы выяснить, действительно ли экспозиция с окисью азота может блокировать последующий апоптоз, β-клетки экспонировали в течение одного часа с СО через 0,5-12 часов после индукции апоптоза под действием TNF-α. Даже через два часа после TNF-α-стимуляции экспонирование с окисью углерода все еще способно вызывать супрессию апоптоза β-клеток (Фиг.5В).

Для того чтобы выяснить, действительно ли преинкубация с окисью углерода будет защищать β-клетки от апоптоза, βТС3 экспонировали с окисью углерода в течение 0,5-3 часов до индукции апоптоза. Одного часа преинкубации в присутствии окиси углерода оказывается достаточно для предотвращения апоптоза β-клеток (данные не представлены). Для того чтобы оценить, сколь долго длится этот эффект, если время между преинкубацией и апоптозным стимулом удлинено, β-клетки предварительно экспонировали в течение одного часа с СО за один-шесть часов до индукции апоптоза под действием TNF-α (Фиг.5С). Один час преинкубации с окисью углерода предупреждает апоптоз β-клеток, стимулированных TNF-α даже через два-три часа после окончания одночасовой обработки окисью углерода. Эти данные свидетельствуют, что относительно кратковременная обработка окисью углерода может вызывать антиапоптозный эффект и что этот антиапоптозный эффект сохраняется в течение длительного периода.

Экспозиция мышиных островков с окисью углерода повышает их выживаемость/функциональность после трансплантации

Для того чтобы определить, может ли окись углерода повысить функциональность островкового трансплантата in vivo, маргинальное (критическое) количество островков из 250 собранных вручную островков трансплантируют в сингенную систему, модель без первичной функции (Berney et al., Transplantation 71:125-32, 2001; Kaufman et al., Diabetes 43:778-83, 1994). Трансплантация маргинального (например, субоптимального) количества островков ("маргинальное количество") сингенному реципиенту с диабетом задерживает возврат к нормогликемии без отторжения или повторения аутоиммунного заболевания. При выяснении маргинального количества островков в сингенной системе C57/BL6 наблюдали, что трансплантация собранных вручную 500 островков в почечную капсулу реципиента приводит к быстрому возврату к нормогликемии (1,5±0,5 дней (n=4)), тогда как трансплантация 250 островков приводит к существенной ее задержке (14,2±2,94 дня (n=9)). Таким образом, было установлено, что 250 островков составляют маргинальное количество. Следовательно, использование маргинального количества не влечет за собой отторжения или повторения аутоиммунного заболевания (Berney et al., Transplantation 71:125-132, 2000).

Исследуют, приводит ли преинкубация окиси углерода с островковыми трансплантатами перед их трансплантацией к улучшению их функциональной характеристики in vivo (Фиг.6А-В). Для получения данных, представленных на Фиг.6А-В, осуществляют следующие действия. Фиг.6А: двести пятьдесят свежевыделенных собранных вручную островков мышей C57BL/6 инкубируют в среде, предварительно насыщенной 1% окисью углерода, в течение двух часов при 37°С. Контрольные островки обрабатывают таким же способом, но без экспонирования с окисью углерода. Инкубированные островки трансплантируют в почечную капсулу сингенных реципиентов с диабетом, как описано прежде. После трансплантации ежедневно определяют уровень глюкозы в крови. Всего было подвергнуто трансплантации 16 животных (8 с предварительно экспонированными островками; 8 контрольных). Одно животное, подвергнутое трансплантации предварительно экспонированными островками, погибло на 3-й день по причинам, не связанным с экспонированием, и было включено в статистический анализ в качестве цензурированного животного. За первичную точку отсчета в этих экспериментах принимали первый день нормогликемии. Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение. На Фиг.6В показана вероятность выздоровления (уровень глюкозы в крови ниже 200 мг/дл) животных, получивших островки, предварительно экспонированные с окисью углерода, или контрольные островки. *Р=0,001 в сравнении с контролем.

На основе того, что, как выяснилось, эффекты обработки окисью углерода растянуты во времени (Фиг.5А и В), и что относительно кратковременная предварительная обработка окисью углерода (применяемая до апоптотического стимула) является антиапоптозной (Фиг.5С), оценивали, может ли улучшить предварительное экспонирование островков с окисью углерода выживаемость островков и/или их функциональность после трансплантации. Маргинальное количество островков трансплантируют в почечную капсулу сингенных реципиентов с диабетом. Время, необходимое для достижения нормогликемии, оказалось значимо сниженным (Р=0,0011) после того, как островки преинкубировали в течение двух часов в среде, предварительно насыщенной окисью углерода (7 дней, 95%-ный доверительный интервал: 6-8 дней), по сравнению с контрольными островками, не экспонированными предварительно с окисью углерода (14 дней, 95%-ный доверительный интервал 12-18 дней) (Фиг.6). В итоге в этих экспериментах используют три отличающихся препарата островков. Статистически значимое различие по времени достижения нормогликемии для островков этих препаратов отсутствует (Р>0,25).

Экспонирование с окисью углерода

В экспериментах с клеточной культурой в целях забуферивания используют 5% СО₂. Перед закачиванием в камеру для экспонирования СО в концентрации 1% (10000 ppm) в компримированном воздухе смешивают в нержавеющем цилиндре с компримированным воздухом, содержащим или не содержащим СО₂. Поток газовой среды в камеру для животных, сделанную из органического стекла в 3,70 футов², поддерживают на уровне 12 л/мин, а в камеру в 1,2 футов² для культивирования клеток - 2 л/мин. Камеру для культивирования клеток увлажняют и поддерживают температуру в ней на уровне 37°С. Для непрерывного измерения уровня СО в камерах используют СО-анализатор (Interscan, Chatsworth, CA). Через заборное отверстие в верхней части камер с помощью СО-анализатора образцы газа отбирают со скоростью 1 л/мин и анализируют их путем электрохимической детекции с чувствительностью 10-600 ppm. Уровень концентрации измеряют ежечасно. После того как в данной камере газовую среду уравновешивают (приблизительно в течение 5 мин), флуктуаций в концентрации СО не наблюдается.

Животных выдерживают в камере из органического стекла объемом в 3,70 кубических футов, содержащей >98% О₂ или смесь 98% О₂+СО при скорости потока 12 л/мин. Во время выдерживания животным подают еду и воду. СО в концентрации 1% (10000 ppm) в компримированном воздухе смешивают с >98% О₂ в нержавеющем цилиндре для смешивания перед поступлением газовой смеси в камеру для экспонирования. Изменяя скорость потока СО в цилиндре для смешивания, контролируют поставляемую концентрацию в камеру для экспонирования. Поскольку скорость потока прежде всего определяют с помощью потока О₂, изменяется только поток СО для получения разной концентрации окиси углерода в камере. Концентрацию О₂ в камере определяют с помощью газ-спектрометра.

Методика выделения клеток

Нижеследующий пример иллюстрирует методику, используемую для выделения островковых клеток у крыс или мышей. Содержимое одного флакона с Rat Liberase^тм (от Boehringer Mannheim/Roche кат. № 1815032) растворяют в 4 мл стерильного раствора HBSS, охлаждают на льду в течение 30 мин, делят на аликвоты по 0,5 мл и хранят при -20°С. К каждой 0,5 мл-овой аликвоте приливают 33 мл среды, например, M199, HBSS или RPMI 1640 без сыворотки теленка.

Крыс анестезируют избыточной дозой нембутала. Для мышей готовят 3 мл-овые шприцы, наполненные 2 мл раствора Liberase и снабженные 27 g-иглой, изогнутой под углом 90°. Для проведения операции используют 2 пары ножниц; одну большую пару используют для вскрытия брюха и одну пару небольшого размера - для разрезания желчных протоков. Для вырезания поджелудочной железы используют две пары пинцетов. Для высвобождения желчного протока используют один хемостат.

Вскрывают брюхо и обнажают, насколько возможно, поджелудочную железу, производя v-образный разрез от самого низа брюха. Проток поджелудочной железы освобождают от зажима (с гемостатом у крыс и небольшим зажимом "бульдог" у мышей) в его дуоденальном внедрении, захватывая без повреждения окружающую панкреатическую ткань. Желчный проток отделяют с проксимального конца. Перед введением канюли удаляют жир, удостоверяясь в отсутствии прокола портальной вены. Маленькими ножницами вырезают данный проток на одну треть от перехода, и в этот проток вставляют канюлю. Канюля удерживается в протоке с помощью слабого зажима. Быстро инъецируют раствор Liberase^тм. Поджелудочная железа оказывается растянутой и полностью расширенной после инъекции 6 мл жидкости. У мышей иглу вставляют в проток ближе к печени, насколько возможно, и инъецируют раствор Liberase^тм. Затем крысу или мышь умерщвляют, вырезая диафрагму и сердце или аорту.

После проникновения Liberase^тм в поджелудочную железу ее удаляют, начиная удаление кишок, затем желудка и затем селезенки. Когда поджелудочная железа остается прикрепленной только к желчному протоку, ее вырезают из крысы. Вырезанную поджелудочную железу помещают в 50 мл-овую коническую пробирку, и пробирку помещают в водяную баню при 37°С на 30 мин.

После инкубации в каждую пробирку приливают 20 мл среды + NCS. Остальную процедуру выделения заканчивают на льду. Пробирки энергично встряхивают в руках в течение 5-10 секунд для разрушения ткани. Полученные островки несколько раз промывают в клинической центрифуге при 800 об/мин (приблизительно 180хg) в течение 120 сек или 1200 об/мин (приблизительно 200хg) в течение 90 сек для удаления Liberase^тм. Полученный супернатант сливают декантированием и добавляют 25-35 мл среды и осторожно встряхивают (макс. около 1/2). Стадию центрифугирования повторяют с последующей 2-3-кратной промывкой. Ткань ресуспендируют в 20 мл среды, и полученную суспензию фильтруют через армированную сетку с диаметром отверстий 400 мкм (Thomas scientific mesh 35 кат. № 8321-М22) для удаления оставшейся неразрушенной ткани, жира и лимфы. В пробирку добавляют еще 5-10 мл среды для промывки оставшихся островков - и фильтруют через указанное сито.

Полученные клетки осаждают центрифугированием при 1200 об/мин в течение 90 сек. Супернатант удаляют, оставляя по возможности минимальное количество среды.

Для создания градиента полученный осадок ресуспендируют в 10-15 мл Histopaque 1077^тм (Sigma кат.№ H 1077) и встряхивают до получения гомогенной суспензии (так же как и для промывки). Наслаивают 10 мл среды без NCS, тщательно сохраняя резкий раздел между Histopaque^тм и имеющейся средой. Данную среду медленно добавляют с помощью пипетки по боковой стенке пробирки. Созданный градиент центрифугируют в течение 20 минут при 2400 об/мин (900 g) при 10°С с очень медленным ускорением и не тормозя.

После центрифугирования с помощью одноразовой серологической пипетки на 10 см³ (Falcon) из интерфазы собирают слой островков и помещают их в конические пробирки на 50 см³. Островки промывают несколько раз для удаления Histopaque^тм путем добавления 25-35 мл среды + NCS. Начальное центрифугирование осуществляют при 1200 об/мин в течение 2 мин, а последующие центрифугирования осуществляют в течение 90 сек. После 3-х промывок островки ресуспендируют с помощью пипетирования вверх и вниз. Каждые 7-10 мл островков вручную закладывают в 60 мм-овые стерильные культуральные чашки.

Ручной отбор островковых клеток осуществляют под микроскопом с использованием 100 мкл стерильного наконечника для пипеток. Каждый островок отбирают отдельно и осторожно, чтобы избежать захвата клеток любой другой ткани. Отбирают гладкие островки диаметром между 50 и 225 мкм, а также круглой или овальной формы.

Пример II. Окись углерода вызывает супрессию отторжения мышиных кардиальных трансплантатов у крыс

Животные

Для трансплантации инбредным взрослым самцам крыс линии Lewis используют в качестве донорских органов сердца мышей линии BALB/c (Harlan Sprague-Dawley, Indianopalis, IN). Животных содержат в соответствии с указаниями American Association for Laboratory Animal Care, а научно-исследовательские протоколы апробированы Institutional Animal Care and Use Committees of the Beth Israel Deaconess Medical Center.

Хирургическая модель

Во время всех процедур животных анестезируют сочетанной ингаляцией метоксифлурана (Pitman-Moore, Mundelain, IL) и пентобарбитала (Abbott, North Chicago, IL) в дозе 30-50 мг/кг в/б. Гетеротопическую пересадку сердца осуществляют, как описано прежде (Berk et al., Physiol. Rev. 8:999-1030, 2001; Petkova et al., J. Biol. Chem. 276:7932-7936, 2001). Жизнеспособность трансплантата оценивают путем ежедневной пальпации. Отторжение диагностируют по прекращению сокращения желудочков и подтверждают гистологической проверкой.

Используемые реагенты

Фактор яда кобры (CVF; который блокирует активацию комплемента) (Quidel, San Diego, CA) вводят в/б в день - 1 (60 Ед/кг) и в день 0 (20 Ед/кг) по отношению ко дню трансплантации (день 0). Циклоспорин А (CsA; Novartis, Basel, Switzeland), который блокирует активацию Т-клеток, вводят в/м (15 мг/кг) начиная со дня 0, а затем ежедневно до конца каждого эксперимента. Оловосодержащий протопорфирин (SnPPIX), кобальтсодержащий протопорфирин (CoPPIX) и железосодержащий протопорфирин (FePPIX; Porphyrin Products, Logan, UT) разбавляют в 100 мМ NaOH для получения 50 мМ маточного раствора и держат при -70°С перед использованием. По возможности освещение ограничивают. И SnPPIX, и FePPIX в PBS вводят в/б (30 мкМ/кг). FePPIX и SnPPIX вводят донору в дни -2 и -1 (30 мкМ/кг), а реципиенту - во время трансплантации (день 0) и затем ежедневно (30 мкМ/кг).

СО-экспонирование

Вкратце, СО в концентрации 1% (10000 частей на миллион; ppm) в компримированном воздухе смешивают в цилиндре из нержавеющей стали для смешивания со сбалансированным воздухом (21% кислород), перед его поступлением в камеру для экспонирования. Концентрации СО контролируют путем изменения скорости потока СО в цилиндре для смешивания перед доставкой в камеру. Поскольку скорость потока исходно определяют по скорости О₂, изменяют только скорость потока СО, которую поставляют в конечной концентрации в камеру для экспонирования. Для непрерывного измерения уровня СО в камере используют СО-анализатор (Interscan Corporation, Chatsworth, CA). Донорские трансплантаты помещают в камеру для экспонирования с СО за 2 дня до трансплантации. Трансплантаты реципиентов помещают в камеру для экспонирования сразу после трансплантации и выдерживают в камере для экспонирования в течение 14 (n=3) или 16 (n=3) дней. Концентрацию СО поддерживают в течение всего времени между 250 и 400 ppm. Животных извлекают из камеры ежедневно для оценки жизнеспособности трансплантата и для введения CsA, SnPPIX или FePPIX, как описано выше.

Ферментативная активность HO

Ферментативную активность HO измеряют по образованию билирубина в микросомах сердца и печени. Животных умерщвляют, а их сердца и печень промывают ледяным PBS и замораживают при -70°С до использования. Органы подвергают измельчению в четырех объемах сахарозного (250 мМ) Трис-HCl (10 мМ/л) буфера (рН 7,4) на льду и центрифугируют (28000 об/мин 3Х, 20 мин, 4°С). Полученный супернатант центрифугируют (105000 об/мин 3Х, 60 мин, 4°С), а осадок микросом ресуспендируют в MgCl₂ (2 мМ)-калий-фосфатном (100 мМ) буфере (рН 7,4) и подвергают ультразвуковой обработке на льду. Полученные образцы (1 мг белка) вносят в реакционную смесь (400 мкл), содержащую цитозоль крысиной печени (2 мг белка), гемин (50 мкМ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (0,25 Ед) и NADPH (0,8 мМ) на 60 мин при 37°С в темноте. Образуемый билирубин экстрагируют хлороформом, а OП измеряют при 464-530 нм (коэффициент экстинкции, 40 мМ/см по билирубину). Ферментативную активность выражают в виде пикомолей билирубина, образованного на миллиграмм белка за 60 мин (пкмоль/мг/ч). Концентрацию белка определяют с помощью анализа белка по бицинхониновой кислоте (Pierce, Georgetown). Фон составляет ~5 пкмоль/мг/ч. Все реагенты, используемые в данном анализе, произведены компанией Sigma (St. Louis, MO), если не указано иначе. Уровень карбоксигемоглобина измеряют через 2 дня после трансплантации с помощью газового анализатора крови Corning 865 (Clinical Chemistry, Massachusetts General Hospital, Boston, MA).

Гистоморфометрический анализ

Трансплантаты собирают через 3 дня после операции трансплантации, заключают в парафин, фиксируют в формалине и последовательно режут (5 мкм), полностью, от верхушки до основания. Десять срезов помещают на предметное стекло, всего около 20-25 предметных стекол. Каждое пятое предметное стекло окрашивают гематоксилином и эозином (H&E) для гистоморфометрического анализа. На каждом предметном стекле просматривают два изображения под микроскопом Nicon Eclipse E600^тм (Nikon, Melville, NY), соединенным с цветной фотокамерой Hitachi 3-CCD (модель HV-C20; Hitachi, Tokyo, Япония) и мощным компьютером Macintosh^тм 7300/200 (Apple Computer, Cupertino, CA), снабженным цифровым программным обеспечением IPLab Spectrum (Signal Analytics Corporation, Vienna, VA). Для двух-трех животных на группу просматривают около 50 изображений каждого трансплантируемого сердца. Изображения анализируют, вручную передвигая участки, просматривая на каждом срезе инфарктные и неинфарктные области в правом и левом желудочке. С помощью цифрового программного обеспечения изображения подсчитывают области, корреспондирующие с инфарктной и неинфарктной тканью, в виде числа пикселей, корреспондирующих с этими областями. Затем подсчитывают процентные доли инфарктной и неинфарктной областей по всей области просмотра. Объединенные данные для каждой группы, выраженные в виде области в пикселях или в виде процентной доли инфаркта, анализируют с использованием ANOVA. Полученные таким образом результаты аналогичны результатам с использованием или пикселей, или процентной доли для инфаркта, но представлены результаты с использованием только процентной доли инфаркта (см. Таблицу II). Результаты выражены в виде среднего = SD.

Иммуногистология

Трансплантаты собирают через 3 дня после трансплантации, моментально замораживают в жидком азоте и хранят при -80°С. Криостатные срезы фиксируют и окрашивают, как описано прежде (Soares et al., Nature Med. 4:1073, 1998). Популяции крысиных лейкоцитов обычно анализируют с использованием Ag (LCA, CD45; OX-1), αβ TCR (TCR αβ-цепи; R73), В-клеток (CD45RB; OX-33), NK-клеток (NKR-P1; 3.2.3), а также МФ (CD68; ED-1), монАТ (Serotec, Harlan Bioproducts for Science, Indianopalis, IN) против крысиных лейкоцитов. Детекцию фибрин/фибриногена осуществляют с использованием кроличьих поликлональных AТ против фибрин/фибриногена человека (Dako, Carpinteria, CA). Активацию внутритрансплантатного комплемента детектируют с использованием противокрысиного C1q (The Binding Site, Birmingham, U.K.), C3 (ED11; Serotec) или монАТ C5b-9 (Dako). Крысиный IgM детектируют с помощью мышиного монАТ MARM-4 против IgM крысы (любезно подаренный Dr. H. Bazin, University of Louvain, Brussels, Бельгия). В каждый эксперимент включают подобранные по изотипу монАТ или очищенные Ig, так же как и контроль для остаточной эндогенной пероксидазной активности. Детекцию апоптоза осуществляют с использованием набора для детекции апоптоза ApopTag^тм in situ (Oncor, Gaithersburg, MD), в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ гемолиза, опосредованного комплементом (СН50)

Показатель СН50 определяют как степень разбавления крысиной сыворотки, необходимая для получения 50% максимального лизиса AT-чувствительных эритроцитов барана. Вкратце, AT-чувствительные эритроциты барана (1 х 10⁸ клеток/мл; Sigma) инкубируют (30 мин, 37°С) в присутствии крысиной сыворотки в желатине на вероналовом буфере (GVB⁺⁺; Sigma). Клетки центрифугируют, и высвобождаемый гемоглобин измеряют (λ= 550 нм). Фон измеряют в отсутствие эритроцитов барана или в отсутствие сыворотки и вычитывают из показаний для всех образцов.

Клеточный ELISA

Содержание в крысиной сыворотке антимышиных AT измеряют с помощью непрямого клеточного ELISA. В качестве антигенной мишени используют мышиную эндотелиальную клеточную линию 2F-2B (CRL-2168; American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA). Вкратце, клетки 2F-2B культивируют в DMEM (Life Technologies, Rockville, MD), 10% FCS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Life Technologies). Фиксированные в глутаральдегиде клетки 2F-2B инкубируют (1 ч, 37°С в присутствии крысиной сыворотки, последовательно разбавленной в PBS-0,05 Твин 20 (Sigma), и крысиные антимышиные AT детектируют с использованием мышиных антикрысиных IgM (MARM-4), IgG1 (MARG1-2), IgG2a (Marg2a-1), IgG2b (MARGb-8) или IgG2c (Marg2c-5) (любезно подаренных проф. H.Bazin, University of Louvain, Brussels, Бельгия). Мышиные антикрысиные AT детектируют с использованием меченного HRP козьего антимышиного Fab', истощенного перекрестно реагирующим антикрысиным Ig (0,1 мкг/мл, 1 ч, комнатная температура; Pierce, Rockford, IL). HRP обнаруживают с использованием орто-фенилдиамина (Sigma) и Н₂О₂ (0,03%) в цитратном буфере (рН 4,9). Поглощение измеряют при λ=490 нм. Относительное количество циркулирующих в сыворотке AT против трансплантата выражают в виде ОП (λ=490), взятой для одного последовательного разведения в линейном диапазоне данного анализа (1:32-1:1024).

Связывание крысиного С3 с мышиными эндотелиальными клетками измеряют с помощью модифицированного метода клеточного ELISA для мышиных эндотелиальных клеток 2F-2B в качестве антигенов-мишеней (Miyatake et al., J. Immunol. 160:4114, 1998). Вкратце, нефиксированные эндотелиальные клетки 2F-2B инкубируют в присутствии крысиной сыворотки, последовательно разбавленной в GVB⁺⁺-буфере (1 ч, 37°С). Клетки фиксируют в PBS, 0,05% глутаральдегиде, и осадок крысиного С3 детектируют с использованием мышиных монАТ к крысиному С3 (Serotec).

Анализ агрегации тромбоцитов

Мышиные эндотелиальные клетки 2F-2B культивируют в покрывающем шестилуночные планшеты 0,2% желатине (Sigma), в 88% DMEM (Life Technologies), 10% FCS (FCS), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Life technologies). Слитые эндотелиальные клетки либо оставляют необработанными, либо обрабатывают CoPPIX (50 мкМ; 18 ч), агентом, индуцирующим HO, SnPPIX (50 мкМ, 18 ч), ингибитором HO, или и тем и другим - CoPPIX (50 мкМ, 15 ч) и SnPPIX (50 мкМ, 3 ч). Богатую тромбоцитами плазму получают центрифугированием (290 - g, 12 мин, 19°С) нормальной крысиной плазмы в 3,8%-м натрийцитрате. Крысиные тромбоциты (3-10⁸ клеток/мл) суспендируют в HT-буфере (8,9 мМ NaHCO₃, 0,8 мМ KH₂PO₄, 5,6 мМ декстрозы, 2,8 мМ-ном растворе KCl, 0,8 мМ MgCl₂, 129 мМ NaCl, 10 мМ HEPES). Тромбоциты наслаивают на мышиные эндотелиальные клетки, и анализ агрегации тромбоцитов осуществляют, как описано ранее (Kaczmarek et al., J. Biol. Chem. 271:33116, 1996), с использованием агрегометра (Chrono-Log, Harestown, PA) и ADP (0,5-4 мкМ) в качестве агониста.

Клеточные экстракты и Вестерн-блот-анализ

Эндотелиальные клетки промывают в PBS (рН 7,2), собирают соскобом и лизируют в буфере Лэммли. Электрофорез осуществляют в денатурирующих условиях в 10%-ном полиакриламидном геле. Белки переносят на поливинилдифлуоридиновую мембрану (Immobilon P; Millipore, Bedford, MA) методом электроблотинга и детектируют с помощью кроличьих поликлональных AT против HO-1 или HO-2 человека (SressGen, Victoria, Канада) или β-тубулина (Boehringer Mannheim, Mannheim, Германия). Белки визуализируют, используя конъюгированные HRP ослиные антикроличьи IgG или козьи антимышиные IgG (Pierce) и ECL-анализ (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL), в соответствии с инструкциями производителя.

Транзиторная трансфекция и апоптозный анализ

Мышиную линию эндотелиальных клеток 2F-2B (ATCC) транзиторно трансфицируют, как описано в другой публикации (Soares et al., Nature Med/4:1073, 1998; Brouard et al., J. Exp. Med. 192:1015, 2000). Все эксперименты осуществляют через 24-48 часов после трансфекции. Клетки, трансфицированные β-галактозидазой, детектируют, как описано в другой публикации (Soares et al., Nature Med. 4:1073, 1998; Brouard et al., J. Exp. Med. 192:1015, 2000). Процент жизнеспособных клеток устанавливают путем оценки числа клеток, экспрессирующих β-галактозидазу, которые сохраняют нормальную морфологию, как описано в другой публикации (Soares et al., Nature Med. 4:1073, 1998; Brouard et al., J. Exp. Med. 192:1015, 2000). Определяют число подсчитываемых случайных полей, которое составляет, минимум, 200 жизнеспособных трансфицированных клеток на контрольную лунку. Процент жизнеспособных клеток нормируют для каждого ДНК-препарата по числу трансфицированных клеток, подсчитанных в отсутствие агента, индуцирующего апоптоз (100% выживаемость). Все эксперименты осуществляют по меньшей мере трижды с повтором. Актиномицин D (Act. D; Sigma) растворяют в PBS и добавляют в культуральную среду (10 мкг/мл) через 24 часа после трансфекции. SnPPIX (Porphyrin Products) растворяют (10 мкМ) в 100 мМ NaOH и до использования хранят при -20°С. SnPPIX добавляют в культуральную среду (50 мкМ) через 6 ч после трансфекции. Человеческий рекомбинантный TNF-α (R&D Systems, Minneapolis, MN) растворяют в PBS, 1% BSA, и добавляют в культуральную среду (10-100 нг/мл) через 24 ч после трансфекции.

Экспонирование культивируемых эндотелиальных клеток с СО

Клетки экспонируют с компримированным воздухом или при изменяющихся концентрациях СО (250 и 10000 ppm), как описано в другой публикации (Otterbein et al., Nature Med. 6:422, 2000; и Brouard et al., J. Exp. Med. 192:1015, 2000).

Модель трансплантата аорты

Трансплантацию аорты осуществляют так, как описано в другой публикации (Plissonnier et al., Transplantation 60:414-424, 1995). Вкратце, аорту и нижнюю полую вену отрезают так, чтобы она кровоточила после гепаринизации. После левой дополнительной торакотомии лигируют три или четыре пары межреберных артерий с использованием 7-0 нейлонового шва (Keisei Medical Industrial Co., LTD, Tokyo, Япония), извлекают 2 см-овый кусок нисходящей аорты. Трансплантат с помощью стандартной микрохирургической операции с использованием 9-0 нейлоновых швов (Ethilon^TM, Ethicon, Inc., Somerville, New Jersey) помещают между почечными артериями и раздвоением аорты. Нативную брюшную аорту, находящуюся слева по обоим краям, лигируют.

СО в концентрации 1% (10000 частей на миллион; ppm) в компримированном воздухе смешивают со сбалансированным воздухом (21% кислорода), как описано прежде (Otterbein et al., Am. J. Physiol. 276(4 Pt 1):L688-L694, 1999). Для данной модели трансплантации донорский трансплантат помещают в СО-камеру за два дня перед трансплантацией. Реципиентов помещают в камеру сразу после трансплантации и держат здесь 56 дней. Концентрацию СО все время поддерживают на уровне 250 ppm.

Взрослых самцов (250-350 г) крыс Brown Norway (RT1 используют в качестве доноров аортального трансплантата, а взрослых самцов (250-350 г) крыс Lewis (RT1) используют в качестве реципиентов (Charles River Lab. Wilmington, MA). Самцов C57BL/6, нуль-мышей p21^-/- и p53^-/- закупают в Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Нуль-мыши MKK3^(-/-) были выведены, как описано прежде (Lu et al., EMBO J. 18:1845-1857, 1999). Мышам давали возможность в течение одной недели привыкнуть к пище для грызунов и воде ad libitum.

RT-PCR

RT-PCR осуществляют после выделения трансплантируемых сердец с использованием набора для экстрагирования РНК в соответствии с инструкциями производителя (Qiagen, Chatsworth, CA). Праймеры, используемые для мышиного β-актина, представляют собой: смысловой (5'-3'). CCTGACCGAGCGTGGCTACAGC (SEQ ID NO:1); антисмысловой (3'-5'), AGCCTCCAGGGCATCGGAC (SEQ ID NO:2); а для мышиной HO-1: смысловой (5'-3'), TCCCAGACACCGCTCCTCCAG (SEQ ID NO:3); антисмысловой (3'-5') GGATTTGGGGCTGCTGGTTTC (SEQ ID NO:4).

Ферментативная активность является ключевой для супрессии острого отторжения сосудов

Мышиные сердца, трансплантируемые необработанным крысам, подвержены острому отторжению сосудов через 2-3 дня после трансплантации, согласно наблюдению, согласующемуся с предшествующими сообщениями (Soares et al., Nature Med. 4:1073 1998; и Koyamada et al., Transplantation 65:1210, 1998). При обработке фактором яда кобры (CVF) плюс циклоспорин А (CsA) мышиные кардиальные трансплантаты жизнеспособны длительное время (см. Таблицу II, ниже) - наблюдение, также согласующееся с предшествующими сообщениями. При обработке CVF плюс CsA жизнеспособность трансплантата ассоциируется с повышенной регуляцией экспрессии HO-1 в трансплантируемых эндотелиальных и гладких мышечных клетках, а также в кардиальных миоцитах (Фиг.7). Экспрессию мРНК HO-1 детектируют с помощью RT-PCR через 12-14 ч после трансплантации, а белок HO-1 через 24-72 ч после трансплантации (Фиг.7). Продолжительной выживаемости трансплантата не удается достичь, если SnPPIX, ингибитор HO, вводят донору, а затем и реципиенту, несмотря на обработку CVF плюс CsA. В этих условиях все трансплантаты отторгаются на 3-й - 7-й день (Таблица II). Контрольная обработка FePPIX, протопорфирином, который не ингибирует активность HO, не приводит к отторжению трансплантата (Таблица II).

Таблица II Ингибирование активности HO-1 под действием SnPPIX ускоряет отторжение трансплантата Обработка Время жизни CVF+CsA >50 (n=8) CVF+CsA+FePPIX >50 (n=4) CVF+CsA+SnPPIX 3, 4, 5 (n=2); 6 (n=4); 7 (n=2)

Для получения данных Таблицы II мышиные сердца трансплантируют крысам, обработанным CVF плюс CsA. Трансплантаты реципиентов обрабатывают FePPIX или SnPPIX. Обработка SnPPIX индуцирует отторжение трансплантата через 3-7 дней после трансплантации (р<0,0001 по сравнению с крысами, обработанными только CVF плюс CsA, либо CVF плюс CsA плюс FePPIX). Статистический анализ осуществляют с использованием точного критерия Фишера.

Чтобы показать, что SnPPIX, но не FePPIX, блокируют функцию HO-1 in vivo, в трансплантируемых и реципиентных сердцах через 2 дня после трансплантации количественно определяют общую ферментативную активность HO (Фиг.8). Необработанные мышиные сердца, по сравнению с необработанными сердцами, производят 35,5±4 пикомолей билирубина на миллиграмм общего белка в час (пкмоль/мг/ч; Фиг.8). Активность HO существенно возрастает в мышиных сердцах, трансплантируемых необработанным крысам (98±7,21 пкмоль/мг/ч; р=0,001), крысам, обработанным CVF плюс CsA (98,3±7,23 пкмоль/мг/ч), или крысам, обработанным CVF плюс CsA плюс FePPIX (77,3±5,51 пкмоль/мг/ч; р=0,0009) (Фиг.8). В соответствии с представленными данными, в необработанных мышиных сердцах, трансплантируемых крысам, обработанным с помощью CVF плюс CsA плюс SnPPIX (32,37±7,23 пкмоль/мг/ч), активность HO ингибируется до базисного уровня. Это соответствует высоко значимому ингибированию по сравнению с мышиными сердцами, трансплантируемыми необработанным крысам (р=0,0009), крысам, обработанным CVF плюс CsA (р=0,0009), или крысам, обработанным CVF плюс CsA плюс FePPIX (р=00,18; Фиг.8). HO-активность в печени реципиентов также повышается после трансплантации, наподобие того, как это происходит при трансплантации сердца (данные не представлены). Однако это не относится к собственному сердцу реципиента, в котором HO-активность не повышается после трансплантации (Фиг.8). В трансплантатах, трансплантируемых крысам, обработанным SnPPIX, наблюдается прогрессирующий инфаркт миокарда, который становится явным уже через 2 дня после трансплантации (данные не представлены). Это не наблюдается в трансплантатах у контрольных крыс, обработанных FePPIX (данные не представлены).

Ранее было показано, что у крыс, которые подвергаются пересадке мышиного сердца, обработанного CVF плюс CsA, образуются антимышиные AT, которые представлены исключительно изотипом IgM (Koyamada et al., Transplantation 65:1210, 1998). Дополнительная обработка SnPPIX или FePPIX не влияет на данный AT-ответ (Фиг.9). Образование AT к трансплантату коррелирует с активацией комплемента, что показано по отложению С3 в мышиных эндотелиальных клетках (Фиг.9). Обработка SnPPIV или FrPPIX не влияет на отложение C3 в мышиных эндотелиальных клетках (Фиг.9).

Экзогенная СО полностью заменяет ферментативную активность HO-1 в супрессии острого отторжения сосудов

Все мышиные сердца, трансплантированные крысам, обработанным SnPPIX и экспонированным с СО (400 ppm; 0,04%), сохраняют жизнеспособность длительное время (см. Таблицу III, ниже). Использованная доза СО (400-500 ppm) приблизительно соответствует одной двадцатой от летальной дозы (данные не представлены). У крыс и мышей, экспонированных с СО, неблагоприятных реакций не наблюдалось. СО-экспонирование, прерываемое через 14 (n=3) или 16 (n=3) дней после трансплантации, не влияет на жизнеспособность трансплантата, т.е. трансплантаты продолжают функционировать в течение >50 дней (Таблица III).

Таблица III Экзогенная СО полностью заменяет HO-1 в супрессии отторжения трансплантата Обработка Время жизни (дни) CVF+CsA+SnPPIX 3, 4, 5 (n=2); 6 (n=4); 7 (n=2) CVF+CsA+SnPPIX+CO >50 (n=6)

Для получения данных Таблицы III мышиные сердца трансплантируют крысам, обработанным CVF плюс CsA. В тех случаях, когда указано, трансплантаты реципиентов обрабатывают SnPPIX и экспонируют или не экспонируют с СО. Отторжение трансплантата, наблюдаемое у крыс, обработанных SnPPIX, супрессируется при экспонировании с экзогенной СО (р<0,0001 по сравнению с реципиентами, обработанными CVF плюс CsA плюс SnPPIX). Статистический анализ осуществляют с использованием точного критерия Фишера.

Чтобы определить, препятствует ли экзогенная СО ингибированию ферментативной активности HO-1 с помощью SnPPIX, что можно было бы оценить по способности СО супрессировать отторжение трансплантата, изучали, влияет ли СО на ферментативную активность HO в сердцах, трансплантированных крысам, обработанным SnPPIX. Как показано на Фиг.10, это не происходит. Общая ферментативная активность HO сердец, трансплантированных крысам, обработанным SnPPIX (32,37±7,23 пкмоль/мг/ч), существенно не отличается от активности HO сердец, трансплантированных крысам, обработанным SnPPIX и экспонированным с СО (43,6±7,57 пкмоль/мг/ч; р=0,1095; Фиг.10). Аналогичные результаты получают для печени и сердец реципиентов (Фиг.10).

Экзогенная СО может заменять HO-1-активность в предупреждении отторжения трансплантата. Это может происходить благодаря механизму, связанному с "загрузкой" в результате ингаляции экзогенной СО в RBC и последующей ее доставки в трансплантат через кровообращение в адекватной концентрации. В соответствии с данным предположением, если эндогенная активность HO-1 ингибируется под действием SnPPIX, экзогенная СО должна имитировать действие эндогенной СО, которая продуцируется в том случае, если ферментативная активность HO-1 не ослаблена. Экспонирование трансплантата реципиента с 400 ppm экзогенной СО повышает уровень карбоксигемоглобина с 0,5±1,5% до 32,1±6,9 (Фиг.10). Тот факт, что трансплантированные сердца выживали у животных, экспонированных с СО, даже при этих супрессивных эффектах SnPPIX, может свидетельствовать о том, что такого уровня СО достаточно, чтобы адекватно "зарядить" RBС, доставляя СО в трансплантат, и вызвать супрессию отторжения трансплантата (Фиг.10). Альтернативно, окись углерода, растворенная в плазме, может быть доставлена в трансплантат и во все ткани организма.

Изучали вопрос, супрессирует ли экзогенная СО развитие инфаркта миокарда, при котором происходит отторжение трансплантата у крыс, обработанных SnPPIX. Трансплантаты собирали через 3 дня после трансплантации и количественно, в процентах, определяли площадь, пораженную инфарктом. Сердца, трансплантированные необработанным крысам, поражались почти полным трансмуральным инфарктом правого желудочка (87,1±4,9% площади правого желудочка), наряду с обширным эндомиокардиальным и трансмуральным инфарктом левого желудочка (32,0±6,7% площади левого желудочка; данные не представлены). Инфаркты свидетельствовали о нежизнеспособности эозинофильного миокарда, не содержащего ядер, с интерстициальной геморрагией, отеком и нейтрофилами. Инфаркты левого желудочка всегда были эндомиокардиальными с трансмуральным распространением, в зависимости от степени инфаркта, а инфаркты левого желудочка - более диффузными по природе. Выраженная в процентах площадь поражения инфарктом в обоих желудочках, как правило, увеличивается от верхушки сердца к его основанию. Сердца, трансплантированные крысам, обработанным CVF плюс CsA, характеризовались лишь небольшими диффузными, нетрансмуральными площади инфаркта в правом желудочке (4,5±4,9%), но не в левом (0,7±2,1%) (см. Таблицу IV, ниже). В сердцах, трансплантированных крысам, обработанным CVF плюс CsA плюс FePPIX, были обнаружены небольшие диффузные площади инфаркта в правом желудочке (12,2±9,5%), но не в левом (0,7±1,3%) (Таблица IV). Эти сердца неотличимы от сердец, трансплантированных крысам, обработанным CVF плюс CsA без обработки FePPIX (данные не представлены). В сердцах, трансплантированных крысам, обработанным CVF плюс CsA плюс SnPPIX, обнаруживали существенные трансмуральные инфаркты правого желудочка (26,1±12,7%) с обширными эндомиокардиальными и трансмуральными инфарктами левого желудочка (37,6±15,5%) (Таблица IV), которые по характеру неотличимые от таковых для сердец, трансплантированных необработанным крысам (данные не представлены). Эти поражения были специфичны для трансплантированного сердца. В нативных сердцах реципиентов никакого инфаркта не развивается. Выраженные в процентах площади поражения инфарктом в сердцах, трансплантированных крысам, обработанным SnPPIX, оказались существенно выше (р<0,001), по сравнению с сердцами, трансплантированными крысам, обработанным CVF плюс CsA, а также с обработанным или не обработанным FePPIX (Таблица IV). Сердца, трансплантированные крысам, обработанным SnPPIX, которые подвергались воздействию экзогенной СО, очень незначительно поражались инфарктом в правом (8,4±5,3%) и в левом (1,8±3,4%) желудочках (Таблица IV), причем характер поражения был сходен с таковым в сердцах, трансплантированных крысам, обработанным CVF плюс CsA, а также FePPIX (данные не представлены). Выраженные в процентах площади, пораженные инфарктом, в сердцах, трансплантированных крысам, обработанным SnPPIX, которые подвергались воздействию экзогенной СО, существенно не отличались от выраженных в процентах пораженных инфарктом площадей в сердцах, трансплантированных крысам, обработанным CVF плюс CsA, наряду с обработкой FePPIX или без нее. Вместе с тем, выраженные в процентах площади поражения инфарктом в этих сердцах существенно отличаются (р<0,001) от таковых в сердцах, трансплантированных при такой же обработке, но не подвергнутых воздействию экзогенной СО.

Таблица IV Морфометрический анализ Обработка Правый желудочек Левый желудочек CVF+CsA 4,5±4,9 0,7±2,1 CVF+CsA+FePPIX 12,2±9,5 0,7±1,3 CVF+CsA+SnPPIX 26,1+12,7* 37,6±15,5* CVF+CsA+SnPPIX+CO 8,4±5,3 1,8±3,4

Для получения данных Таблицы IV мышиные сердца трансплантировали крысам (n=3 в группе), обработанным CVF плюс CsA. Если указано, трансплантаты реципиентов были обработаны FePPIX или SnPPIX и экспонированы с СО. Результаты представлены в виде процентов пораженной инфарктом площади. Статистический анализ осуществляли с использованием анализа ANOVA. Знаком звездочки отмечено значимое различие при сравнении со всеми другими обработками.

Экзогенная СО вызывает супрессию тромбоза сосудов и инфильтрацию моноцитов/макрофагов, которая характеризует острое отторжение сосудов.

Мышиные сердца трансплантировали крысам, обработанным CVF плюс CsA. Вводили SnPPIX или FePPIX, и трансплантаты реципиентов экспонировали с СО (250-400 ppm). Через 3 дня после трансплантации собирали трансплантаты (n=3 в группе) и окрашивали на крысиный IgM, крысиный и мышиный комплемент C1q, крысиный и мышиный Р-селектин, крысиный и мышиный фибрин/фибриноген и крысиные лейкоциты, экспрессирующие CD45. Мышиные сердца, трансплантированные крысам, обработанным CVF плюс CsA, наряду с FePPIX или без него, обнаруживали обширное внутрисосудистое отложение крысиных IgM и C1q (данные не представлены), но не обнаруживали IgG, C3, или C5b-9 (данные не представлены). HO-2, HO-1 и ферритин детектировались в трансплантате эндотелиальных клеток и гладких мышц, а также в миоцитах сердца (данные не представлены). Обнаруживался лишь минимальный тромбоз сосудов или инфильтрация лейкоцитами хозяина, обычно ассоциированными с очаговыми областями инфаркта (данные не представлены). В эндотелии сосудов обнаруживали слабую, но детектируемую экспрессию Р-селектина (данные не представлены). Сердца, трансплантированные крысам, обработанным CVF плюс CsA, при ингибировании активности HO-1 с помощью SnPPIX, обнаруживали аналогичные уровни внутрисосудистого отложения IgM и С1q, по сравнению с контрольными крысами, обработанными FePPIX, и не обнаруживали IgG, C3 или C5b-9 (данные не представлены). Был обнаружен широко распространенный васкулярный тромбоз крупных коронарных сосудов, ассоциированный с агрегатами тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин, и с внутрисосудистыи фибрином. Тромбы постоянно наблюдались в крупных коронарных сосудах в основании сердца. Агрегаты тромбоцитов, экспрессирующие Р-селектин, не обнаруживались в микрососудах (данные не представлены). Была обнаружена обширная инфильтрация в трансплантате нейтрофилами хозяина, а также CD45⁺⁺-лейкоцитами, экспрессирующими маркер CD68/ED-1 моноцитов- МФ и антигены MHC класса II (данные не представлены). Инфильтрирующие моноциты/МФ, обнаруживаемые вблизи артериол и рассеянные по всему миокарду, были ассоциированы с областями инфаркта.

Сердца, трансплантированные крысам, обработанным SnPPIX и экспонированным с СО, были практически неотличимы от сердец, трансплантированных крысам, обработанным CVF плюс CsA, наряду с FePPIX или без него (данные не представлены). В этих сердцах обнаруживался аналогичный уровень IgM и отложение C1q в сосудах при сравнении с сердцами, трансплантированными реципиентам, обработанным SnPPIX, но не экспонированным с СО (данные не представлены). При СО-экспонировании признаки васкулярного тромбоза отсутствовали, что обнаруживалось по отсутствию агрегатов тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин, или внутрисосудистому фибрину. Р-селектин обнаруживался в эндотелии сосудистого трансплантата. Был обнаружен определенный уровень инфильтрации моноцит/МФ, ассоциированной с небольшими очаговыми областями инфаркта (данные не представлены).

Повышение HO-1 в эндотелиальных клетках ингибирует агрегацию тромбоцитов.

Исследовали вопрос, обусловлено ли отсутствие агрегации тромбоцитов в трансплантатах, трансплантированных крысам, экспонированным с СО, или агрегация тромбоцитов in vitro подавляется экспрессией HO-1 в эндотелиальных клетках. Мышиные эндотелиальные клетки экспонировали с CoPPIX или SnPPIX, чтобы, соответственно, индуцировать или подавить в этих клетках HO-активность. Тромбоциты наслаивали на эндотелиальные клетки и тестировали их способность к агрегации, стимулируемую с помощью AДФ (2 мкМ). Тромбоциты, наслаиваемые на необработанные эндотелиальные клетки, нормально агрегировали при стимуляции AДФ (Фиг.11). Когда тромбоциты экспонируют с эндотелиальными клетками, предварительно обработанными SnPPIX, агрегация тромбоцитов усиливалась по сравнению с тромбоцитами, экспонированными с необработанными эндотелиальными клетками (Фиг.11). Это наблюдение свидетельствует о том, что необработанные эндотелиальные клетки имеют исходный уровень HO-активности, что, по-видимому, можно отнести на счет конститутивной экспрессии HO-2 в этих клетках (Фиг.11). Когда тромбоциты экспонировали с эндотелиальными клетками, предварительно обработанными CoPPIX, агрегация тромбоцитов существенно ингибировалась по сравнению с таковой тромбоцитов, экспонированных с необработанными или с SnPPIX-обработанными эндотелиальными клетками (Фиг.11). Данный ингибирующий эффект угнетался, когда тромбоциты экспонировали с эндотелиальными клетками, обработанными и CoPPIX, и SnPPIX (Фиг.11). И CoPPIX, и SnPPIX усиливали экспрессию HO-1 в культивируемых эндотелиальных клетках (данные не представлены). Разное действие этих протопорфиринов должно быть связано со способностью SnPPIX действовать в качестве сильного ингибитора ферментативной активности HO-1.

HO-1 генерирует СО, которая угнетает апоптоз эндотелиальных клеток.

Одним из основных признаков, который характеризует отторжение мышиных сердец, трансплантированных крысам, обработанным SnPPIX, является обширный апоптоз эндотелиальных клеток и миоцитов сердца (Фиг.12). Апоптоз не происходит в мышиных сердцах, трансплантированных крысам, обработанным FePPIX (Фиг.12). Выясняли, угнетается ли апоптоз эндотелиальных клеток in vitro данной способностью HO-1 (Soares et al., Nature Med. 4:1073-1077, 1998; и Brouard et al., J. Exp. Med. 192:1015, 2000), или данный цитопротекторный эффект опосредуется в результате образования СО. Апоптоз не происходил в мышиных сердцах, трансплантированных крысам, обработанным SnPPIX и экспонированным с СО, что дает основание полагать, что дело обстоит именно так (Фиг.12). Изучали in vitro, при ингибировании активности HO-1 под действием SnPPIX, будет ли экзогенная СО предохранять эндотелиальные клетки от опосредованного TNF-α апоптоза. Представленные на Фиг.6 данные позволяют предположить, что это так и есть. Сверхэкпрессия HO-1 угнетала опосредованный TNF-α апоптоз эндотелиальных клеток, происходящий в присутствии актиномицина D (Фиг.12). Антиапоптозный эффект HO-1 опосредован ее ферментативной активностью, поскольку экспонирование эндотелиальных клеток со SnPPIX блокировало антиапоптозный эффект HO-1 (Фиг.12). При ингибировании активности HO-1 под действием SnPPIX, экзогенная СО (10000 ppm) вызывала супрессию опосредованного TNF-α апоптоза, что наводит на мысль, что HO-1 подавляет апоптоз эндотелиальной клетки в результате образования СО (Фиг.12).

Окись углерода подавляет развитие трансплантат-ассоциированного атеросклероза.

Аорты крыс Brown Norway трансплантировали крысам Brown Norway (сингенным) необработанным крысам линии Lewis (аллогенным) или крысам Lewis, экспонированным с окисью углерода (250 ppm; аллогенным, с окисью углерода). Образцы собирали через 56 дней после трансплантации и окрашивали модифицированным elastic tissue-masson trichrome или гематоксилинэозином. Участки аорты крыс Brown Norway трансплантировали крысам с возникшими атеросклеротическими нарушениями, которые соответствуют нарушениям, ассоциированным с хроническим отторжением трансплантата (данные не представлены). Эти нарушения становились заметными через 20-30 дней после трансплантации и резко выраженными через 50-60 дней (данные не представлены). По этой причине все анализы осуществляли по прошествии 56 дней после трансплантации. Эти нарушения характеризовались гиперплазией интимы, утратой медиальных клеток гладких мышц (SMC) и накоплением лейкоцитов в адвентициальной оболочке и не наблюдались в аортах реципиентов трансплантатов (данные не представлены). Симптомов этих нарушений не наблюдали, если участки крысиной аорты трансплантировали сингенным реципиентам. Чтобы проверить, действительно ли СО будет подавлять развитие этих нарушений, трансплантаты аорты пересаживали аллогенным реципиентам, которых затем экспонировали с СО (250 ppm) сразу после трансплантации и в последующие 56 дней. Гиперплазия интимы подавлялась в трансплантатах аорты реципиентов, экспонированных с СО, по сравнению с трансплантатами, которые пересаживали реципиентам, экспонированным с воздухом, поскольку в адвентициальной оболочке происходило накопление лейкоцитов (данные не представлены). СО существенно не влияла на утрату медиальных SMC по сравнению с трансплантатами, пересаживаемыми необработанным реципиентам (данные не представлены).

Пример III. Методики обработки органов и тканей, донора и реципиента в процессе проведения трансплантации.

Нижеследующие примеры иллюстрируют методы, используемые при обработке донора, органа и реципиента окисью углерода во время операции трансплантации. В процессе операции трансплантации можно использовать любой один или несколько из следующих методов.

Обработка донора

Перед заготовкой органа или ткани, можно донора подвергнуть ингаляции окисью углерода (250 ppm) в течение одного часа. Окись углерода можно вводить в дозах, варьирующих от 10 ppm до 1000 ppm в течение времени от одного часа до шести часов, или в течение всего периода с того момента, когда становится возможным обрабатывать донора, мозг которого утратил биологическую активность (труп), во время удаления данного органа. Обработку следует начинать как можно скорее после установления факта утраты мозгом биологической активности. В некоторых случаях желательно начинать обработку до утраты мозгом биологической активности.

Что касается животных, не являющихся человеком (например, свиньи), которых используют в качестве доноров для ксенотрансплантации, живое животное можно обрабатывать относительно высокими уровнями вдыхаемой окиси углерода, поскольку продуцируемый карбоксигемоглобин не снижает жизнеспособность и функциональность органа, который подлежит трансплантации. Например, можно использовать уровни, превышающие 500 ppm (например, 1000 ppm или выше, вплоть до 10000 ppm, особенно кратковременно).

Обработка органа in situ

Перед извлечением органа у донора его можно полить раствором, например, буфером или средой без эритроцитов, пока он еще находится у донора. Цель состоит в том, чтобы полить данный орган раствором, насыщенным окисью углерода, и сохранять его в атмосфере окиси углерода, так чтобы окись углерода оставалась в режиме насыщения. Поливка может иметь место в течение определенного времени по меньшей мере 10 минут, например, 1 час, несколько часов или дольше. В идеальном случае данный раствор должен доставлять клеткам донорского органа окись углерода в наивысшей концентрации.

Обработка органа или ткани

Орган или ткань можно предварительно хранить в среде, которая содержит окись углерода, начиная со время его удаления из донора до момента трансплантации реципиенту. Это можно осуществлять путем хранения органа или ткани в среде, содержащей СО, или путем их перфузии такой средой. Так как это происходит предпочтительно ex vivo, а не в организме животного, можно применять очень высокие концентрации СО-газа (например, 10000 ppm для поддержания среды в режиме насыщения СО).

Обработка реципиента

Реципиента можно обработать окисью углерода. Обработку можно начать в день трансплантации по меньшей мере за 30 минут до начала хирургической операции. Альтернативно, обработку можно начать по меньшей мере за 30 минут до реперфузии данного органа у реципиента. Ее можно продолжать по меньшей мере в течение 30 минут, например, 1 часа. Дозы окиси углерода между 10 ppm и 3000 ppm можно доставлять, варьируя время, например, минуты или часы, и можно вводить в день трансплантации и на следующий день после трансплантации. Например, реципиент может вдыхать концентрацию окиси углерода, например, 3000 ppm, задерживая дыхание в течение трех последовательных 10 секунд. Альтернативно, реципиент может вдыхать, скажем, 200 ppm в течение длительного срока, такого как 20 дней. Концентрации карбоксигемоглобина можно использовать в качестве ведущего показателя для надлежащего введения пациенту окиси углерода. Как правило, обработка реципиентов не вызывает у них повышение уровня карбоксигемоглобина выше уровней, приемлемых для пациента, нуждающегося в трансплантации.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения

Следует иметь в виду, что несмотря на то, что настоящее изобретение описано в заявке довольно подробно, представленное описание предназначено для иллюстрации изобретения и не ограничивается рамками настоящего описания, которые определяются прилагаемой формулой изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в рамках нижеследующей формулы изобретения.

Настоящее изобретение относится к способам трансплантации органов, тканей и индивидуальных клеток, а также к способам поддержания клеток in vitro и повышения выживаемости и/или функциональности донорского органа, ткани или клетки после трансплантации. Указанные способы включают в себя введение окиси углерода в эффективном количестве, достаточном для повышения выживаемости и/или функциональности клетки. Изобретение также относится к применению окиси углерода для поддержания животной клетки перед трансплантацией и для лечения или предупреждения отторжения трансплантированного органа или ткани. 19 н. и 50 з.п. ф-лы, 4 табл., 12 ил.

1. Способ трансплантации органа, предусматривающий
(a) введение донору фармацевтической композиции, содержащей окись углерода;
(b) получение у донора органа, выбранного из группы, состоящей из почки, печени, сердца, кожи, тонкого кишечника и поджелудочной железы; и
(c) трансплантацию указанного органа реципиенту, где количество окиси углерода, вводимое донору, является количеством, достаточным для повышения выживаемости или функциональности органа у реципиента после трансплантации.

2. Способ по п.1, где фармацевтическую композицию вводят живому донору или донору после смерти его мозга.

3. Способ по п.1, где фармацевтическую композицию, содержащую окись углерода, вводят донору до или после смерти его мозга.

4. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция представляет собой первую фармацевтическую композицию, а способ дополнительно предусматривает обработку органа in situ у донора второй фармацевтической композицией, содержащей окись углерода.

5. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий обработку органа ех vivo перед стадией трансплантации второй фармацевтической композицией, содержащей окись углерода.

6. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция представляет собой первую фармацевтическую композицию, а способ дополнительно предусматривает стадию введения реципиенту второй фармацевтической композиции, содержащей окись углерода, перед стадией (с), в течение стадии (с), после стадии (с), перед и в течение стадии (с), перед и после стадии (с) или перед, в течение и после стадии (с).

7. Способ по п.1, где орган представляет собой почку.

8. Способ по п.1, где донор и реципиент относятся к одному и тому же виду или к разным видам.

9. Способ трансплантации органа реципиенту, предусматривающий
(a) получение органа от донора,
(b) введение в полученный орган фармацевтической композиции, содержащей окись углерода; и
(c) трансплантацию органа реципиенту, где количество окиси углерода, вводимое в орган на стадии (b), является количеством, достаточным для повышения выживаемости или функциональности указанного органа у реципиента после трансплантации данного органа.

10. Способ по п.9, где стадию (b) осуществляют путем перфузии органа in situ, пока орган находится у донора.

11. Способ по п.9, где стадию (b) осуществляют ex vivo.

12. Способ по п.11, дополнительно предусматривающий перед стадией (b) стадии введения донору второй фармацевтической композиции, содержащей окись углерода; и изъятие органа у донора.

13. Способ по п.12, согласно которому вторую фармацевтическую композицию вводят живому донору или донору после смерти его мозга.

14. Способ по п.12, при котором вторую фармацевтическую композицию вводят донору перед и после смерти его мозга.

15. Способ по п.9, дополнительно предусматривающий стадию введения реципиенту второй фармацевтической композиции, содержащей окись углерода, перед стадией (с), в течение стадии (с), после стадии (с), перед и в течение стадии (с), перед и после стадии (с) или перед, в течение и после стадии (с).

16. Способ по п.9, где орган представляет собой печень, почку, сердце, поджелудочную железу, легкое, тонкий кишечник или кожу.

17. Способ по п.9, согласно которому донор и реципиент относятся к одному и тому же виду или к разным видам.

18. Способ трансплантации органа, предусматривающий
(a) получение от донора органа, выбранного из группы, состоящей из печени, почки, сердца, поджелудочной железы, легкого, тонкого кишечника или кожи;
(b) трансплантацию органа реципиенту и
(c) введение реципиенту до, в процессе или после стадии (b) фармацевтической композиции, содержащей окись углерода в количестве, достаточном для повышения выживаемости трансплантированного органа у реципиента.

19. Способ по п.18, где фармацевтическую композицию вводят реципиенту в пределах 1-20-дневного срока после (b), по меньшей мере, однократно в период, начиная с 21 дня после (b), или многократно либо непрерывно в течение периода, начиная с 21 дня после (b).

20. Способ по п.18, где фармацевтическую композицию вводят реципиенту при установлении того, что трансплантированный орган подвергается или близок к тому, чтобы подвергнуться хроническому отторжению, или при установлении того, что трансплантированный орган подвергается или близок к тому, чтобы подвергнуться острому отторжению.

21. Способ по п.18, дополнительно предусматривающий перед получением органа от донора стадию введения донору второй фармацевтической композиции, содержащей окись углерода.

22. Способ по п.21, где вторую фармацевтическую композицию вводят живому донору или донору после смерти его мозга.

23. Способ по п.18, дополнительно предусматривающий перед стадией (b) стадию введения в орган второй фармацевтической композиции, содержащей окись углерода.

24. Способ по п.23, при котором вторую фармацевтическую композицию вводят в орган донора in situ и/или ex vivo.

25. Способ по п.18, где донор и реципиент относятся к одному и тому же виду или к разным видам.

26. Способ повышения функциональности донорского органа, предусматривающий
(a) получение органа у донора, находящегося в критическом состоянии, и
(b) экспозицию полученного органа с фармацевтической композицией, содержащей окись углерода.

27. Способ поддержания выделенной животной клетки in vitro перед трансплантацией, предусматривающий
(a) обеспечение сосуда, содержащего герметизированный газ, содержащий газ окиси углерода,
(b) получение выделенной клетки in vitro, причем клетка представляет собой первичную клетку,
(c) высвобождение герметизированного газа из указанного сосуда с целью образования атмосферы, содержащей газ окись углерода, и
(d) поддержание животной клетки in vitro в присутствии атмосферы, содержащей газ окись углерода.

28. Способ поддержания выделенной животной клетки in vitro перед трансплантацией, предусматривающий
(a) обеспечение культуральной среды, содержащей, по меньшей мере, 0,0001 г СО/100 г среды; и
(b) поддержание выделенной клетки в указанной среде.

29. Способ по п.27 или 28, дополнительно предусматривающий введение композиции окиси углерода реципиенту перед трансплантацией, во время трансплантации, после трансплантации, перед и после трансплантации или перед, в течение и после трансплантации.

30. Способ по п.27 или 28, где животная клетка представляет собой часть островка поджелудочной железы, клетку печени, β-клетку поджелудочной железы, фибробласт, клетку костного мозга, нейронную клетку или клетку миоцит.

31. Применение животной клетки, поддерживаемой согласно способу по п.27, для трансплантации.

32. Применение окиси углерода для получения культуральной среды для поддержания животной клетки перед трансплантацией реципиенту.

33. Применение по п.32, где животную клетку получают у реципиента или у донора, который не является реципиентом.

34. Применение по п.32, где животную клетку получают у донора способом, предусматривающим
(a) введение донору композиции, содержащей окись углерода;
и
(b) получение клетки из ткани донора.

35. Способ повышения выживаемости животной клетки после ее изъятия у донора, предусматривающий
(a) введение фармацевтической композиции, содержащей окись углерода, живому донору или донору после смерти его мозга и
(b) получение выделенной клетки у донора, где введенного донору количества окиси углерода достаточно для повышения выживаемости клетки после ее изъятия из организма донора.

36. Способ по п.35, где фармацевтическая композиция представляет собой герметизированный газ.

37. Способ по п.35, дополнительно предусматривающий
(c) поддержание клетки in vitro в присутствии второй фармацевтической композиции, содержащей окись углерода.

38. Способ по п.37, где клетку со стадии (с) помещают в жидкую среду.

39. Способ по п.38, где стадию (с) осуществляют путем создания источника герметизированного газа окиси углерода и контакта жидкой среды с газом окисью углерода, высвобождаемым из источника герметизированного газа окиси углерода.

40. Способ по п.38, где указанная жидкая среда включает в себя окись углерода.

41. Способ по п.35, где клетка представляет собой часть островка поджелудочной железы, клетку печени, β-клетку поджелудочной железы, фибробласт, клетку костного мозга, нейронную клетку или клетку миоцит.

42. Способ трансплантации животной клетки, предусматривающий
(a) введение живому донору или донору после смерти его мозга фармацевтической композиции, содержащей окись углерода;
(b) получение из организма донора выделенной клетки и
(c) трансплантацию клетки реципиенту, где введенного донору количества окиси углерода достаточно для повышения выживаемости клетки после ее изъятия из организма донора.

43. Способ по п.42, где донор не является реципиентом или донор и реципиент представляют собой одно и то же животное.

44. Способ по п.42, дополнительно предусматривающий стадию введения реципиенту второй фармацевтической композиции, содержащей окись углерода, перед стадией трансплантации, в течение стадии трансплантации, после стадии трансплантации, перед и после стадии трансплантации или перед, в течение и после стадии трансплантации.

45. Способ по п.42, где клетка представляет собой часть островка поджелудочной железы, клетку печени, β-клетку поджелудочной железы, фибробласт, клетку костного мозга, нейронную клетку или клетку миоцит.

46. Способ повышения выживаемости или функционирования животной клетки, трансплантированной реципиенту, предусматривающий
(а) трансплантацию животной клетки реципиенту и
(b) вдыхание реципиентом фармацевтической композиции перед, в течение и/или после стадии трансплантации количества окиси углерода, достаточного для повышения выживаемости или функционирования трансплантированной клетки у реципиента.

47. Способ по п.46, где газ окиси углерода поставляется в сосуде, содержащем герметизированный газ, содержащий окись углерода.

48. Способ по п.46, дополнительно предусматривающий стадию экспонирования клетки с композицией окиси углерода ex vivo перед стадией трансплантации.

49. Способ по п.46, где перед стадией трансплантации животную клетку поддерживают в жидкой среде, которая содержит, по меньшей мере, 0,0001 г окиси углерода/100 г среды.

50. Способ по п.46, где перед стадией трансплантации клетку поддерживают in vitro в атмосфере, содержащей окись углерода.

51. Способ по п.46, где клетку получают у реципиента или у донора, который не является реципиентом.

52. Способ по п.46, где клетку извлекают из организма донора, перед тем как ее трансплантировать реципиенту; а фармацевтическую композицию, содержащую окись углерода, вводят донору перед и/или во время извлечения клетки из организма донора.

53. Способ по п.46, где клетка представляет собой часть островка поджелудочной железы, клетку печени, β-клетку поджелудочной железы, фибробластную клетку, клетку костного мозга, нейронную клетку или клетку миоцит.

54. Применение газа окиси углерода для приготовления фармацевтической композиции для улучшения выживаемости трансплантированной клетки у реципиента после трансплантации.

55. Набор для поддержания выделенной животной клетки перед, в процессе или после трансплантации клетки пациенту, включающий в себя сосуд, содержащий герметизированный газ, содержащий по меньшей мере 0,001 млн^-1 окиси углерода и этикетку с описанием способа применения газа для повышения выживаемости выделенной животной клетки перед, в процессе или после трансплантации клетки пациенту.

56. Стерильная клеточная среда для поддержания выделенной животной клетки перед трансплантацией, содержащая (а) питательные вещества, пригодные для поддержания животной клетки в культуре, и (b) по меньшей мере около 0,0001 г окиси углерода/100 г среды.

57. Способ поддержания in vitro выделенной животной клетки, пригодной для трансплантации, предусматривающий
(a) обеспечение сосуда, содержащего герметизированный газ, содержащий газ окиси углерода,
(b) получение выделенной животной клетки in vitro, где клетку помещают в среду, содержащую растворенную окись углерода,
(c) высвобождение герметизированного газа из указанного сосуда с целью образования атмосферы, содержащей газ окиси углерода; и
(d) поддержание клетки в присутствии указанной атмосферы.

58. Применение газа окиси углерода для получения среды для поддержания животной клетки перед ее трансплантацией реципиенту.

59. Применение животной клетки, поддерживаемой согласно способу по п.57, для трансплантации.

60. Способ по п.20, где фармацевтическую композицию вводят реципиенту при установлении того, что трансплантированный орган подвергается или близок к тому, чтобы подвергнуться хроническому отторжению.

61. Применение окиси углерода для производства фармацевтической композиции для лечения или предупреждения хронического отторжения у пациента, который подвергается или близок к тому, чтобы подвергнуться хроническому отторжению трансплантированного органа или ткани.

62. Применение по п.61, где фармацевтическая композиция представлена в газообразной форме.

63. Применение по п.62, где окись углерода присутствует в газообразной композиции в количестве от 0,001 до 3000 млн^-1.

64. Применение по любому из пп.61-63, где органом или тканью является печень, почка, сердце, поджелудочная железа, тонкий кишечник или кожа.

65. Способ лечения или предупреждения хронического отторжения у пациента, который подвергается или близок к тому, чтобы подвергнуться хроническому отторжению трансплантированного органа или ткани, предусматривающий введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество окиси углерода.

66. Способ по п.65, где фармацевтическая композиция представлена в газообразной форме.

67. Способ по п.66, где окись углерода присутствует в газообразной композиции в количестве от 0,001 до 3000 млн^-1.

68. Способ по любому из пп.65-67, где органом или тканью является печень, почка, сердце, поджелудочная железа, тонкий кишечник или кожа.

69. Способ по п.19, где фармацевтическую композицию вводят реципиенту по меньшей мере однократно в течение периода, начиная с 21 дня после (b), или многократно либо непрерывно в течение периода, начиная с 21 дня после (b).