СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАЮЩИХСЯ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ, ВЫЗВАННЫХ УСЛОВНО-ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРОЙ Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для диагностики инфекций, передающихся половым путем, вызванных условно-патогенной микрофлорой, для профилактики внутриутробных инфекций и не вынашивания беременности. В соответствии с указаниями «Ветеринарных правил при воспроизводстве сельскохозяйственных животных», утвержденными Главным управлением ветеринарии МСХ СССР, 20 июля 1971 г. (Ветеринарное законодательство Т.2., М.: «Колос», 1973 г.с 127) абортировавших коров исследуют только на бруцеллез, трихомоноз, кампилобактериоз и лептоспироз.

Однако имеется большое количество сообщений, что именно условно-патогенная микрофлора является причиной массовых гинекологических заболеваний коров, послеродовых осложнений, абортов, рождения мертвых и нежизнеспособных телят (Родин И.А; Генетико-иммунологические аспекты профилактики мастита и взаимообусловленных с ним эндометрита у коров и диареи новорожденных телят, автореферат дис… доктора ветеринар. наук: / И.А.Родин, 2002. 49 с.). Вместе с тем, в нормативных документах для микробиологов ветеринарных лабораторий отсутствуют указания на обязательные исследования условно-патогенной микрофлоры как причины массовых заболеваний сельскохозяйственных животных, передающихся половым путем. Для бактериологического исследования посылают патологический материал (плод с плацентой, кусочки паренхиматозных органов, кровь, молоко и др.) свежий или консервированный. Одновременно в лабораторию направляют для серологического исследования молоко, сыворотку крови или кровь от абортировавшего или убитого с диагностической целью животного.

Приказ министерства Здравоохранения РФ от 10 февраля 2003 г. № 50 "О совершенствовании акушерско-гинекологической помощи в амбулаторно-поликлинических учреждениях". В соответствии с этим документом профилактика и диагностика гинекологических заболеваний медицинскими специалистами осуществляется при проведении профилактических осмотров, в обязательном порядке исследуют мазок с верхней трети свода влагалища на бактериологическую обсемененность. Во время таких исследований определяется группа риска среди женщин детородного возраста, которые могут иметь неблагоприятные последствия по причине инфекции.

В ветеринарной практике такие исследования при гинекологической диспансеризации не проводятся. Из известных технических решений наиболее близким по технической сущности к заявляемому объекту является Приказ министерства Здравоохранения СССР №535 от 22 апреля 1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» Москва. 1985 г.

В документе сказано, что содержимое цервикального канала в норме стерильно. Лишь у наружного зева в слизисто-гнойной пробке в небольшом количестве могут быть обнаружены микроорганизмы (преимущественно молочнокислые бактерии) как результат обсеменения микрофлорой верхней трети влагалища.

В соответствии с этим документом взятие материала для микробиологического исследования проводит врач-гинеколог при подозрении на инфекционную природу патологического процесса. Так, после введения зеркала во влагалище материал для исследования берут стерильным ватным тампоном с поверхности заднего свода влагалища. Материал засевают на следующие среды: мясо - пептонный агар (МПА) с добавлением 5% эритроцитов барана, Эндо и на мясо-пептонный бульон с добавлением 1% глюкозы (МПБ). Материал засевают тампоном, используя штриховую технику посева, на половину чашки Петри МПА с добавлением 5% эритроцитов барана, затем производят посев тампоном в МПБ.

Посевы инкубируют при температуре 37°С, просматривая ежедневно. При появлении роста, на плотных средах проводят подсчет колоний различной морфологии, учитывая их соотношение.

При помутнении бульона делают мазки на стекле (окраска по Граму) и в соответствии с результатами микроскопии производят высевы на плотные питательные среды ((МПА) с добавлением 5% эритроцитов барана, желточно-солевой агар, среду Эндо). Затем проводят видовую идентификацию микроорганизмов и определение их чувствительности к антибактериальным препаратам. Отрицательный результат исследования выдается при отсутствии роста на всех питательных средах в течение 72 часов.

Этот способ имеет ряд недостатков, а именно данные исследования позволяют диагностировать уже имеющийся патологический процесс, но не позволяют выявлять состояния дисбиоза репродуктивных органов. Ограниченный набор питательных сред не позволяет определить состояние нормоценоза. Применяемая техника посева не позволяет установить количественное содержание выделенной микрофлоры в КОЕ/мл. В ветеринарии такие исследования практически не осуществляются.

Целью изобретения являются ранняя диагностика инфекций, вызванных условно-патогенной микрофлорой, сопровождающаяся абортами, нарушениями репродуктивной функции животных.

Поставленная цель достигается тем, что после 50-60 дней после родов при подготовке к осеменению выявляется присутствие в половых путях животных условно-патогенной микрофлоры с выраженными патогенными и антибиотико-резистентными свойствами, что позволяет провести своевременные профилактические и лечебные мероприятия.

Способ заключается в том, что тампон после отбора пробы опускают в пробирку с 5 мл физиологического раствора. Материал в сумке-холодильнике в течение 1-1,5 часов доставляют в лабораторию. Из исходной взвеси 1:5 готовят последовательные 10 - кратные разведения от 10¹ до 10¹⁰, меняя пипетки. Исходную взвесь и все последующие разведения по 0,1 мл засевают на сектора следующих пластинчатых сред: мясо-пептонный агар с добавлением 5% эритроцитов барана, Эндо, Плоскирева, желточно-молочно-солевой агар, Энтерококкагар, Сабуро и на агар Цейсслера с инкубацией последней в анаэростате. Одновременно проводят посевы на жидкие, разлитые высоким столбиком в пробирки, среды: Бликфельдта и Бифидумсреду, сахарный бульон. Посевы выращивают при 37°С в течение 24-72 часов (на Сабуро температура 24°С - 5 суток) в оптимальные для каждого искомого микроорганизма сроки. По результатам микроскопии мазков, окрашенных по Граму, проводят дальнейшую идентификацию выделенных культур микроорганизмов по общепринятым методикам. Результаты исследований представлены в таблицах 1 и 2.

В таблице 1 представлены наши результаты бактериологического исследования 607 проб цервикальной слизи от коров. Сравниваются данные, полученные в 2007,2008 и 2009 гг. по содержанию лакто- и бифидобактерий в цервикальном биоценозе. Необходимо отметить, что они отличаются незначительно. В наших исследованиях в хозяйствах Омской области присутствие лактобактерий в количестве 1-10⁵ зарегистрировано у 4% - 8,7%, а бифидобактерий 1,1% - 10,5% от всех обследованных коров, соответственно, в 10⁷ только у 1,8%-0,6% и 2,3%-1,1%.

Таблица 1 Количественные показатели лакто- и бифидобактерий цервикального канала коров в динамике № Количество микроорганизмов, КОЕ/мл Представители облигатной микрофлоры Бифидобактерий, % Лактобактерий, % 2007 г. 2008 г. 2009 г. 2007 г. 2008 г. 2009 г. 1. Не обнаружено 33,7 42,7 64,7 41,9 40,6 47,2 2. 1·10¹ 25,3 30,1 21,9 23,9 22,4 26,0 3. 1·10³ 18,4 16,0 19,0 18,9 19 23,6 4. 1-10⁵ 10,5 6,0 1,1 8,7 9 2,4 5. 1-10⁷ 2,3 5,2 1,1 1,8 9 0,6

Таблица 2 Количественный и качественный состав условно-патогенной микрофлоры и грибов, выделенный из цервикальной слизи от коров через 50-60 дней после родов и подготовленных к осеменению Вид микроорганизма Количество культур, выделенных в разведении: Из среды накопления МПБ 10¹ 10² 10³ 10⁴ 10⁵ 10⁶ 10⁷ Е. faecalis гем(+) 26(строгие анаэробные условия)   122 72   3   28 Е. faecalis гем(-)     35 25   3   16 E.faecium     4 5 1     3 E.coli. гем(+)     2 2     1 1 Е. coli. гем(-) 1 2   77     2 8 Е.соli.лактоза(-)             1   K.pnevmonia     1 1     1 1 S.aureus     23 8     1 2 S.epidermidis     43 14     1   S.agalactiae     6 6     1 1 S.pyogenes     9 4       1                   P.vulgaris       1       1 P.mirabilis               5 E.cloacae 2   2 2       3 C.freundii     4 4       1 A. lwoffii               1 A.niger     9 1         Mucor spp. 2   4 1         C.albicans     1           Всего 31 2 265 223 1 6 8 72

Наибольшее количество бифидо- и лактобактерий обнаружено в разведении 1·10¹ и 1-10³. Вероятно, эти показатели и являются оптимальными при количественной оценке нормофлоры половых органов коров в Омской области.

По результатам, представленным в таблице 1 и 2: отсутствие бифидо- и лактобактерий в цервикальном канале коровы при наличии условно-патогенных микроорганизмов с выраженными гемолитическими свойствами в количестве 10² и в количестве более 10⁴ КОЕ/мл без гемолитических свойств в цервикальном канале свидетельствуют о том, что половые пути коровы инфицированы, что может препятствовать осеменению или вызвать аборт. Отсутствие бифидо- и лактобактерий в цервикальном канале коровы при наличии условно-патогенной микрофлоры в ассоциациях, состоящих из 2 и более видов, особенно если они обладают выраженными вирулентными и антибиотико-резистентными свойствами, свидетельствует о том, что половые пути коровы инфицированы.

Количественный и качественный состав условно-патогенной микрофлоры и грибов, выделенный из цервикальной слизи от коров через 50-60 дней после родов и подготовленных к осеменению, представлен в таблице 2. Всего от 608 коров было выделено 607 культур.

488 культур условно-патогенных микроорганизмов, принадлежащих к факультативным анаэробам (энтерококки, стафилококки, кишечная палочка, клебсиелла, протей, стрептококки и др.) выделены в количестве 10²-10³ КОЕ/мл, из них 257 культур обладали гемолитическими свойствами. Содержание условно-патогенных микроорганизмов с выраженными гемолитическими свойствами в количестве 10² и в количестве более 10⁴ КОЕ/мл без гемолитических свойств в цервикальном канале свидетельствуют о том, что половые пути коровы инфицированы, что может препятствовать осеменению или вызвать аборт.

26 культур Е. faecalis гем (+) выделены только из среды накопления (МПБ с 1% глюкозы), в строгих анаэробных условиях свидетельствует о длительной персистенции в цервикальном канале, а значит, хроническом течении инфекции.

Бактериологическое исследование цервикальной слизи у 3-7% маточного поголовья через 50-60 дней после отела перед осеменением позволит проводить раннюю диагностику инфекций, передающихся половым путем, вызванных условно-патогенной микрофлорой с выраженными патогенными и антибиотико-резистентными свойствами. Способ ранней диагностики позволит профилактировать аборты, заболевания репродуктивных органов и проводить своевременные профилактику и лечение. Обеспечит сокращение срока сервис-периода и сокращения количества яловых коров.

Способ ранней диагностики инфекций, передающихся половым путем, включает в себя взятие пробы из цервикального канала шейки матки коров после 50-60 дней после родов при подготовке к осеменению, посев на МПА с добавлением 5% эритроцитов барана, желточно-солевой агар, среду Эндо, Плоскирева, Энтерококкагар, Сабуро и на агар Цейсслера с инкубацией последней в анаэростате. Одновременно проводят посевы на жидкие, разлитые высоким столбиком в пробирки среды Бликфельдта и Бифидумсреду, сахарный бульон. Посевы выращивают при температуре 37°С, в оптимальные для каждого искомого микроорганизма сроки. Окрашивают мазки по Граму и проводят дальнейшую идентификацию выделенных культур микроорганизмов по общепринятым методикам. Способ позволяет проводить раннюю диагностику инфекций, передающихся половым путем, вызванных условно-патогенной микрофлорой, профилактировать аборты, заболевания репродуктивных органов и проводить своевременные профилактику и лечение. 2 табл.

Способ ранней диагностики инфекций, передающихся половым путем, вызванных условно-патогенной микрофлорой, включающий взятие пробы, посев на МПА с добавлением 5% эритроцитов барана, желточно-солевой агар, среду Эндо, Сабуро, посевы выращивают при температуре 37°С в течение 72 ч, окраску мазков по Граму с дальнейшей идентификацией выделенных культур микроорганизмов по общепринятым методикам, отличающийся тем, что пробу берут из цервикального канала шейки матки коров после 50-60 дней после родов при подготовке к осеменению, дополнительно высевают на среду Плоскирева, Энтерококкагар, на агар Цейсслера с инкубацией последней в анаэростате, одновременно проводят посевы на жидкие, разлитые высоким столбиком в пробирки среды Бликфельдта и Бифидумсреду, сахарный бульон.