СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ В БРОНХО-АЛЬВЕОЛЯРНОМ СМЫВЕ Российский патент 1996 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицине, в частности к разделу микробиологии, и может быть использовано для определения возбудителя при гнойной бронхолегочной патологии. Предлагаемый способ предназначен для применения в микробиологических (бактериологических) клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений.

Актуальность разработки предлагаемого способа диктуется неуклонным ростом легочной патологии среди населения, обусловленным всевозрастающими неблагоприятными сдвигами экологической среды, создающими оптимальные условия для размножения возбудителей группы гноеродных кокков на бронхиальном эпителии. Последнее является главным этиологическим фактором в развитии бронхолегочных заболеваний. Данные заболевания опасны склонностью к рецидивам и хронизации процесса, чреваты разного рода осложнениями и часто являются причиной инвалидности работоспособной части населения.

Продвинуться в решении проблемы бронхолегочных заболеваний возможно путем разработки высокоинформативных, легкодоступных в широкой медицинской практике и быстрых в исполнении методов выявления наличия возбудителя в бронхоальвеолярных смывах пациентов. Существующие и применяемые в настоящее время микробиологические методы определения бактериального инфицирования данной системы (методические указания по применению унифицированных микробиологических методов исследования в клинико-лабораторных подразделениях. Приказ МЗ СССР N 535 от 22 апреля 1985 г) не вполне отвечают данным требованиям.

Сущность известного метода заключается в первоначальном получении серийных разделений бронхиального смыва в питательном бульоне (10^-1, 10^-3, 10^-5 до 10^-7). Затем при посеве по 0,1 мл из каждого разведения бронхиального смыва на 5% кровяной агар с последующим посевом из исходного разведения 1:9 (т. е. 10^-) на биологически активные среды: желточно-солевой агар, Эндо и Сабуро. Инкубируют в течение суток при 37^oC. На вторые сутки готовят мазки из колоний, окрашивают по Граму, определяют родовую принадлежность микроорганизмов, с дальнейшей идентификацией. Проводят количественную оценку микроорганизмов, выросших при первичных посевах на плотных питательных средах. Для ориентировочной оценки количественного роста бактерий пользуются следующими критериями:
I очень скудный рост рост единичных колоний (до 10);
II скудный рост рост 10 15 колоний
III умеренный рост рост множества сосчитываемых колоний (не менее 50)
IV обильный рост сплошной рост несосчитываемых колоний
Авторы известного метода предполагают, что III и IV степени роста свидетельствуют об этиологической роли данного микроорганизма, I и II степени о носителе и контаминации. Известно, что при воспалительных процессах дыхательных путей, когда высеиваются условно патогенные микроорганизмы, интерпретация полученных результатов представляет определенные трудности и в некоторых случаях не может иметь решающего значения для микробиологического диагноза. Это можно обосновать еще и тем, что при взятии бронхиального смыва введение стерильного бронхоскопа через верхние дыхательные пути ведет к возможному заносу микрофлоры, нормально обитающей на слизистых миндалин и верхних отделах трахеи, что значительно снижает специфичность метода в этиопатогенетическом аспекте. Кроме того, в известном методе для дифференциации возбудителя среди условно-патогенных микроорганизмов в бронхоальвеолярном смыве у больных следует повторять исследование в динамике с интервалом 3 5 дней и только в случае двух-, трехкратного подтверждения выделения однородной микробной популяции устанавливают возбудитель. Притом такая многократная эндоскопия до некоторой степени травмирует слизистую респираторного тракта, вызывая также болевые ощущения у больного. Эти процедуры в процессе обследования удлиняют сроки выдачи результата микробиологического анализа, вплоть до 10-15 суток, и в значительной степени затягивают проведение специфической терапии, в то время как именно своевременно начатое лечение определяет его эффективность и исход заболевания. Кроме того, существующий способ отличается сложностью исследования, необходимостью наличия дорогостоящих питательных сред, трудоемкостью в связи с количественным подсчетом микроорганизмов. Недостаточная специфичность этого способа обусловлена тем, что при его использовании возможно выявление условно-патогенной флоры, занесенной с верхних отделов дыхательных путей, находящейся во взвешенном состоянии бронхоальвеолярного смыва, которая, естественно, будет размножаться в питательном бульоне. Установить же наличие возбудителя в его взаимодействии с клетками бронхиального эпителия, т. е. на уровне входных ворот болезнетворного начала, данный способ не позволяет и, следовательно, не может считаться достаточно специфичным.

Целью изобретения является сокращение времени, упрощение способа при одновременном повышении его специфичности.

Поставленная цель в способе определения патогенной микрофлоры в бронхоальвеолярном смыве достигается тем, что дополнительно проводят 3-кратное центрифугирование промывных вод бронхов стерильным физиологическим раствором при 500 1000 оборотах в течение 5 10 минут и засев полученного осадка эпителиальных клеток бронха на кровяной агар с оценкой микрофлоры проводят на следующие сутки. Центрифугирование бронхиального смыва позволяет концентрировать комплекс клеток с адсорбированными на них микроорганизмами, находящимися на первой стадии паразитирования возбудителя на уровне входных ворот гнойно-воспалительной инфекции бронхиального дерева. Использование посева осадка, состоящего преимущественно из клеток бронхиальных эпителиоцитов, нагруженных бактериями, полученных из очага воспаления, обеспечивает чистоту предлагаемого метода, обусловленного однородностью микробной популяции, при посеве осадка на плотную питательную среду. Именно для этого и необходимо проводить 3-кратное центрифугирование при 500 1000 оборотах в течение 5 10 минут. Использование этих режимов является оптимальным вариантом для осаждения клеток бронхиального эпителия. Меньшее количество оборотов недостаточно, ибо часть клеток остается на взвеси, а нарастание количества оборотов (до 2,5 3 тысяч) не изменяет достигнутого результата при 500 1000 об/мин и, следовательно, является оптимальным. Длительность центрифугирования 5 10 минут также оптимальна для осаждения клеток с адгезированными на них бактериями при трехкратном центрифугировании.

Предложенный способ осуществляют следующим образом: исследуют бронхоальвеолярный смыв, направленный бронхологом для микробиологической диагностики хронического бронхита. 2 3 мл смыва трехкратно центрифугируют, омывая осадок стерильным физиологическим раствором при 500 1000 об/мин в течение 5 10 мин. Полученный осадок бактериологической петлей засевают на 5% кровяной агар. Сутки инкубируют в термостате при 37^o. Через 18 24 часа идентифицируют микроорганизмы по морфологическим и культуральным свойствам: отмечают характерные особенности колоний, в мазках из колоний, окрашенных по Граму, отмечают форму бактерий, их взаимное расположение и отношение к красителям (грамположительность и грамотрицательность).

Пример 1. Обследован больной П. 37 лет, амбулаторная карта N 569, диагноз: хронический параэндобронхит. Исследован бронхоальвеолярный смыв с использованием центрифугирования в методе микробиологического анализа. Смыв доставлен в лабораторию 27.02.91 г. Произведен посев клеточного осадка после центрифугирования на 5% кровяной агар, инкубирован 24 часа при 37^oC. 28.02.91 г. путем просмотра колоний на кровяном агаре выявлена чистая культура гемолитического стрептококка. Возбудитель идентифицирован по морфологическим и тинкториальным особенностям (приготовление мазка и колоний с окраской по Граму) и дана характеристика колоний (мелкие, прозрачные, плоские) с учетом гемолитических свойств. Полученные данные позволили выдать результат: в бронхоальвеолярном смыве выделен гемолитический стрептококк. Проведенное исследование позволило внести уточнение в этиологию заболевания и на этой основе уже через сутки начать специфическую терапию с учетом конкретного возбудителя.

Пример 2. Обследован больной Г. 50 лет, амбулаторная карта N 570. Клинический диагноз: хронический гнойный бронхит.

Бронхоальвеолярный смыв от 27.02.89 г. проведен аналогичный микробиологический анализ. В посеве получена чистая культура золотистого стафилококка, подтвержденная после идентификации. Результат выдан 28.02.89 г. Диагноз уточнен, что послужило основанием для своевременного специфического противобактериального лечения.

Таким образом, определение патогенной микрофлоры в бронхиально-альвеолярном смыве, предназначенный для использования в диагностике заболеваний бронхолегочной системы, отличается рядом преимуществ перед известным.

Повышение специфичности способа достигнуто регистрацией бактерий в осадке, полученном путем центрифугирования смыва бронхиального лаважа с выявлением уникальной способности бактерий взаимодействовать с эпителиальными клетками слизистой оболочки бронхов и их способности фиксироваться и размножаться на них.

Другим важным преимуществом предлагаемого способа является сокращение сроков исполнения исследования до 1 суток (в 5 10 раз по сравнению с известным).

Кроме того, данный способ является более доступным в плане материальных затрат, так как исключает применение дорогостоящих питательных сред.

Итак, положительный эффект предлагаемого способа определения патогенной микрофлоры в бронхиально-альвеолярном смыве заключается в повышении специфичности, ускорении, упрощении и удешевлении его проведения.

Применение предлагаемого способа позволяет получить экономический эффект за счет сокращения пребывания больного в стационаре в связи с уменьшением времени, затраченного на обследование, и проведением целенаправленного патогенетически обоснованного лечения.

Использование: медицина, микробиология, определение возбудителя при гнойной бронхолегочной патологии. Сущность изобретения: способ включает взятие промывных вод бронхов и засев на 5% кровяной агар с последующей идентификацией микроорганизмов. Для сокращения времени и упрощения способа, а также для одновременного повышения специфичности дополнительно проводят трехкратное центрифугирование промывных вод бронхов при 13,9 - 27,8 g в течение 5 - 10 минут и засев полученного осадка на кровяной агар проводят на следующие сутки.

Способ определения патогенной микрофлоры в бронхо-альвеолярном смыве, включающий получение промывных вод бронхов, посев их на кровяной агар с последующей индентификацией микроорганизмов, отличающийся тем, что перед посевом дополнительно проводят трехкратное центрифугирование промывных вод бронхов при 13,9 27,8 g в течение 5 10 мин и осуществляют посев полученного осадка эпителиальных клеток на агар.