СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНТЕРОКОККОВ ИЗ СВЕЖЕВЗЯТОГО ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/02 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для диагностики энтерококков.

Известны способы выделения энтерококков, основанные на том, что они относятся к факультативно - анаэробным микроорганизмам и на практике прибегают к прямому посеву на простые питательные среды, либо вначале на среду с добавлением 5% эритроцитов барана, а только потом на селективные питательные среды. Культивирование осуществляется в условиях термостата (37°C) на воздухе. (Медицинская микробиология, под редакцией акад. РАМН В.И. Покровского, проф. O.К.Поздеева. ГЕОТАР МЕДИЦИНА, М., 1999, с.206-207).

Однако известные способы обладают следующими недостатками: при прямом посеве на простые питательные среды энтерококки не всегда можно выделить ввиду малого количества микроорганизмов в исследуемой пробе или вследствие нарушения физиологических и ростовых свойств энтерококков, находящихся в неблагоприятных для них условиях.

Из известных технических решений наиболее близким по технической сущности к заявляемому объекту является Приказ министерства Здравоохранения СССР №535 от 22 апреля 1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений», Москва, 1985 г. В соответствии с этим документом исследуемый материал засевают, используя штриховую технику посева, на половину чашки Петри с кровяным агаром, затем проводят посев в сахарный бульон.

Доставленные в лабораторию жидкие пробы (гной, экссудат, содержимое трубоовариальных образований, околоплодные воды) засевают по 0,1 мл на плотные питательные среды, растирая материал на поверхности среды шпателем. Используют кровяной агар, среду Эндо. Кроме того, посев проводят в сахарный бульон.

Кусочки тканей размельчают, соблюдая стерильность, в микроизмельчителе тканей, или растирают в ступке с песком, добавляя питательный бульон или физиологический раствор. Полученную взвесь засевают на несколько чашек с плотными питательными средами, а также в сахарный бульон.

Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°C, просматривая ежедневно. При появлении роста на плотных средах проводят подсчет колоний различной морфологии, учитывая их соотношение.

При помутнении бульона делают мазки на стекле (окраска по Граму) и в соответствии с результатами микроскопии проводят высевы на плотные питательные среды (кровяной агар, желточно-солевой агар, среду Эндо). Затем проводят видовую идентификацию чувствительности к антибактериальным препаратам.

При отсутствии роста на всех питательных средах в течение 72 часов выдается заключение об отсутствии микрофлоры в пробах.

Этот способ имеет ряд недостатков, а именно при использовании указанной техники посева кусочков тканей в момент размельчения велика вероятность контаминации пробы посторонней микрофлорой, режимы культивирования посевов при 37°C на воздухе не позволяют выявить длительно паразитирующие в условиях отсутствия атмосферного кислорода и приобретающие способность расти только в условиях анаэростата энтерококки.

Целью изобретения является повышение высеваемости энтерококков из патологического материала.

Поставленная цель достигается тем, что патологический материал (плотные кусочки органов не измельчаются) помещается сразу в среду накопления (питательный бульон для культивирования микроорганизмов - ГМФ - бульон с добавлением 1% глюкозы) с последующим культивированием в термостате при Т 37°C на 24 часа. Затем делаем высевы на плотные питательные среды и помещаем в термостат на 24-48 часов. Пробы, которые не дали роста в аэробных условиях, дополнительно засеваем на МПА с 5% эритроцитов барана и помещаем в анаэростат на 24 часа при Т 37°C.

Сущность способа: свежевзятый патологический материал без измельчения помещается в среду накопления, культивируется в термостате Т 37°C на 24 часа. Затем проводят высев на чашки Петри с МПА с добавлением 5% эритроцитов и на энтерококкагар. Посевы выдерживают в термостате 24-48 часов Т 37°C. Пробы, которые не дали роста в аэробных условиях, дополнительно засевают на чашки Петри с МПА с добавлением 5% эритроцитов и помещают в анаэростат на 24 часа Т 37°C. Посевы просматривают, проводят микроскопию и по ее результатам идентифицируют микроорганизмы по общепринятым методикам.

Результаты исследования представлены в таблице №1.

Сравнительная оценка разных способов диагностики.

Таблица № п/п Всего обследовано материала бактериологическим методом Количество положительных находок в соответствии с 535 Приказом Количество дополнительно выявленных по предлагаемому способу Дополнительно выявленные по предлагаемому способу, % 1. 50 проб тканей эмбриона, взятых у женщин с неразвивающейся беременностью, находящихся в гинекологическом стационаре 16 5 31,2% 2. 50 мазков цервикального канала шейки матки коров с гинекологическими заболеваниями 29 18 36%

Методика посева клинического материала из женских половых органов в соответствии с 535 Приказом предполагает культивирование микроорганизмов только в аэробных условиях. Культивирование посевов в строгих анаэробных условиях позволяет дополнительно выявлять от 31,2 до 36% культур энтерококков, что связано с условиями экосистемы, в которой данные микроорганизмы паразитируют. В цервикальном канале и матке макроорганизма в норме микроаэрофильные или строгие анаэробные условия, что создает предпосылки для адаптации энтерококков к подобным условиям и предполагает их соблюдение при выделении энтерококков из клинического материала.

Высеваемость энтерококков в анаэробных условиях увеличивается от 31,2 до 36% и позволяет обнаруживать присутствие микроорганизмов в клиническом материале, не дающих роста в аэробных условиях.

Пробу свежевзятого патологического материала без измельчения помещают в среду накопления - ГМФ бульон с добавлением 1% глюкозы и культивируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч. Затем проводят высев на чашки Петри с МПА с добавлением 5% эритроцитов и на энтерококкагар. Посевы выдерживают в термостате в течение 24-48 ч при 37°С. Пробы, которые не дали роста в аэробных условиях, дополнительно засевают на чашки Петри с МПА с добавлением 5% эритроцитов и помещают в анаэростат на 24 ч при 37°С. Посевы просматривают, проводят микроскопию и по ее результатам идентифицируют микроорганизмы по общепринятым методикам. Это увеличивает высеваемость энтерококков в анаэробных условиях от 31,2 до 36% и позволяет обнаруживать присутствие микроорганизмов в клиническом материале, не дающих роста в аэробных условиях. 1 табл.

Способ выделения энтерококков из свежевзятого патологического материала, характеризующийся тем, что пробу патологического материала непосредственно помещают в ГМФ-бульон с добавлением 1% глюкозы с последующим культивированием в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч, затем делают высевы на твердые питательные среды, разлитые в чашки Петри - МПА с добавлением 5% эритроцитов барана и энтерококкагар, посевы выдерживают в термостате в течение 24-48 ч, пробы, которые не дали роста в аэробных условиях, дополнительно засевают на МПА с добавлением 5% эритроцитов барана и помещают в анаэростат на 24 часа при температуре 37°С.