КОРРЕКТОР ПАРАНЕОПЛАСТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ И ТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ Российский патент 2010 года по МПК C07J53/00 C07J63/00 A61K31/58 A61P35/00 

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ену формулы (I), которое может быть использовано в медицине в качестве корректора паранеопластических повреждений и токсических эффектов цитостатической полихимиотерапии.

Указанные свойства предполагают использование соединения в медицине в качестве фармацевтического препарата для профилактического или лечебного применения в составе комплексной противоопухолевой терапии.

Одними из основных требований, предъявляемым к препаратам для химиотерапии злокачественных новообразований, являются высокая эффективность и селективность. В решении этих проблем наряду с разработкой препаратов, обладающих высокой цитостатической активностью, в последнее время также развивается направление, связанное с поиском агентов - модификаторов биологических реакций. Являясь по своей природе мультитаргетными, такие агенты действуют не только на опухолевые клетки, но и на различные регуляторные системы организма, отвечающие за восстановление или стимуляцию противоопухолевой резистентности, усиление эффективности традиционной медикаментозной терапии и ослабление ее побочного токсического действия [1]. В качестве таких агентов в комплексной терапии опухолей традиционно применяются иммуномодуляторы, антикоагулянты, антиоксиданты, гепато- и нейропротекторы и др. [2]. Однако в условиях прогрессирующего паранеопластического процесса их применение может приводить и к нежелательным последствиям, особенно на поздних стадиях развития опухоли (усиление пролиферации и диссеминации, токсичности, аллергическим реакциям). Особый интерес вызывает использование в комбинированной противобластомной терапии препаратов-модификаторов растительного происхождения или их синтетических производных, обладающих низкой токсичностью и широким спектром регулирующих эффектов [3]. В частности, в лечении злокачественных новообразований показана высокая эффективность экстрактов некоторых растений (шлемника байкальского, элеутерококка, подорожника, побегов и листьев облепихи и т.д.), обладающих противоопухолевыми и антиметастатическими свойствами [2]. В качестве перспективных рассматриваются индивидуальные растительные соединения различных классов: алкалоиды, фенолы, полисахариды, высшие терпеноиды и др. Однако до сих пор в онкологической практике не имеется отечественных препаратов-модификаторов на основе индивидуальных растительных соединений или их синтетических производных.

Задачей настоящего изобретения является создание малотоксичного отечественного препарата-модификатора, обладающего противоопухолевыми, антиоксидантными и цитопротекторными свойствами, используемого для повышения противоопухолевой резистентности организма и коррекции паранеопластических нарушений и токсического действия цитостатической химиотерапии.

Поставленная задача решается новым химическим соединением, а именно, 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-еном формулы (I)

обладающим выраженной противоопухолевой активностью; способностью снижать тяжесть патологических изменений в тканях, вызванных паранеопластическими синдромами; проявляющим в условиях цитостатической полихимиотерапии выраженный антиоксидантный и цитопротекторный эффект в нормальных клетках внутренних органов и при этом не стимулирующим пролиферацию и диссеминацию опухоли.

Заявленное соединение относится к тритерпеноидам лупанового ряда, а именно к производным бетулоновой кислоты, которая обладает высокой биологической активностью. В частности, у бетулоновой кислоты и некоторых ее амидов были обнаружены антаоксидантные свойства [4], а также противоопухолевое и антиметастатическое действие [5]. У бетулоновой кислоты и ее производного [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовой кислоты выявлена способность уменьшать некробиотические поражения печеночной паренхимы, вызванные цитостатической противоопухолевой химиотерапией [6]. В работе [7] описан амид бетулоновой кислоты и N-Boc-лизина, обладающий специфической активностью при раке простаты in vitro и in vivo. Амиды бетулоновой кислоты, содержащие фрагменты каприловой, пеларгоновой и ундекановой кислот, ингибируют рост опухолевых клеток МТ-4, MOLT-4, СЕМ и Нер G2 [8]. Дипептид бетулоновой кислоты (N′{N-[3-оксолуп-20(29)-ен-28-оил]-9-аминононаноил}-3-амино-3-фенилпропионовая кислота) запатентован в качестве агента, обладающего противовирусной (анти-ВИЧ, противогерпесной) и иммуностимулирующей активностью [9]. В работе [10] показано, что это соединение ингибирует рост опухолевых клеток МТ-4, MOLT-4, СЕМ и Нер G2. Дипептид является активным индуктором апоптоза в лейкозных клетках и клетках гепатокарциномы in vitro [10].

Соединение I синтезируется путем взаимодействия хлорангидрида бетулоновой кислоты II с N-метилпиперазином в соответствии с уравнением:

Исследование активности 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ена (I) включало в себя определение его противоопухолевого, антиметастатического, антиоксидантного и цитопротекторного действия при введении мышам с солидной карциномой легких Льюиса, а также его противоопухолевого, антиметастатического и антиоксидантаого эффектов в условиях полихимиотерапии и возможности коррекции его цитотоксического действия на нормальные клетки внутренних органов, не затронутые злокачественным перерождением. В качестве эталона использовали стандартную схему полихимиотерапии АСОР (пиклофосфан, доксорубицин, винкристин и преднизолон) [11] в модификации [12]. Статистическую обработку данных проводили методами параметрической статистики с использованием пакета программ "Statistika 6.0". Результаты считали достоверными при р<0,05 по критерию Стьюдента.

Предварительно на белых беспородных мышах массой 22-25 г определялась острая токсичность при однократном внутрижелудочном способе введения. Показано, что соединение I относится к IV классу токсичности, ЛД₅₀ свыше 5000 мг/кг.

Противоопухолевое действие I исследовали на мышах-самках линии C57BL/6 с перевитой внутримышечно карциномой легких Льюиса (5×10⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора). Соединение I вводили через 10 дней после перевивки внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг в течение 7 дней. Группе сравнения проводили цитостатическую полихимиотерапию (ПХТ) по схеме АСОР в режиме однократного парентерального введения циклофосфана (50 мг/кг), доксорубицина (4 мг/кг), винкристина (0,1 мг/кг) и преднизолона (5 мг/кг). Контролем являлись животные с опухолью. Результаты оценивали в динамике по проценту торможения роста опухоли. Установлено, что соединение I обладает высокой противоопухолевой активностью, сравнимой с активностью цитостатической ПХТ АСОР (табл.1, 2).

Антиметастатическую активность I определяли у тех же животных в конце периода введения путем морфометрического анализа срезов обеих долей легких. Объемную плотность (Vv%) метастазов подсчитывали по методу Автандилова [13] с использованием окулярной сетки на 289 точек. Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ). Показано, что соединение I не стимулирует диссеминацию опухоли и проявляет небольшой антиметастатический эффект (ИИМ - 30%) (табл.3). В результате определения концентрации малонового диальдегида в сыворотке крови [14] этих же животных выявлено, что введение соединения I не усиливает интенсивность перекисного окисления в организме животных опухоленосителей, в отличие от цитостатической полихимиотерапии, которая повышает его в 2,5 раза (табл.4).

Путем патоморфологического исследования методом световой микроскопии определяли влияние агента I на состояние тканей внутренних органов у самок мышей линии C57BL/6 с перевитой внутримышечно карциномой легких Льюиса. Агент I вводили, как указано выше; референсной группе проводили однократную ПХТ по схеме АСОР; контролем являлись животные с опухолью. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали печень, почки, сердце, селезенку и проводили стандартную гистологическую обработку. Показано, что введение агента I снижает тяжесть некробиотических повреждений в тканях, вызванных опухолевым ростом. В селезенке отмечены признаки стимуляции процессов кроветворения и повышения иммунной активности. В референсной группе с ПХТ наблюдали изменения, связанные с усилением дегенеративных и альтеративных процессов, а также фиксировали наличие грубых некробиотических нарушений в структуре сердца, печени, почек, селезенки.

Изучение влияния I на противоопухолевый и антиметастатический эффекты цитостатической полихимиотерапии проводили на мышах-самках линии C57BL/6 с перевиваемой карциномой легких Льюиса. Через 10 дней после перевивки животным вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР: доксорубицин (4 мг/кг), циклофосфан (50 мг/кг), винкристин (0,1 мг/кг), преднизолон (5 мг/кг). Через сутки после полихимиотерапии животным в течение 7 дней вводили внутрижелудочно соединение I в дозе 50 мг/кг. Референсной группой являлись животные с ПХТ АСОР, контролем - животные с опухолью. Противоопухолевый эффект определяли в динамике по индексу торможения роста опухоли (ТРО), антиметастатический - в конце периода введения по объемной (Vv%) и поверхностной (Sv %) плотности метастазов, частоте метастазирования и индексу ингибирования метастазирования. Установлено, что введение агента I в условиях ПХТ не оказывает пролиферирующего действия на трансплантаты карциномы легких Льюиса (табл.5, 6). Введение агента I на фоне ПХТ не приводит к существенным изменениям ее антиметастатического эффекта, что указывает на отсутствие стимуляции диссеминации опухоли в условиях стандартной полихимиотерапии (табл.7). Определение в сыворотке крови этих же животных концентрации маркера перекисного окисления МДА [14] показало, что агент I снижает его уровень в 2,5 раза относительно референсной группы, тем самым оказывая значимый антиоксидантный эффект в условиях цитостатической ПХТ (табл.8).

Цитопротекторные свойства агента I изучали на мышах-самках линии C57BL/6 с солидной карциномой легких Льюиса, которую перевивали внутримышечно, как указано выше. Через 10 дней после перевивки животным вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР. Агент I вводили, как указано выше; референсной группе проводили однократную ПХТ по схеме АСОР; контролем являлись животные с опухолью. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали печень, почки, сердце, селезенку и после стандартной гистологической обработки проводили патоморфологическое исследование методом световой микроскопии. Выявлено, что под действием агента I, вводимого на фоне ПХТ, уменьшилась степень дистрофических и некротических поражений экскреторных органов (печень, почки), а также появились признаки повышения иммунной активности и стимуляции процессов кроветворения в селезенке.

Таким образом, новое соединение - 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен формулы (I) - является перспективным агентом с корректорными свойствами в отношении паранеопластических повреждений и токсических эффектов цитостатической полихимиотерапии, обладающим противоопухолевым, антиоксидантным и цитопротекторным действием.

К преимуществам заявляемого соединения следует отнести:

- низкую токсичность;

- выраженную противоопухолевую активность;

- способность снижать тяжесть паранеопластических нарушений в тканях;

- выраженное антиоксидантное и цитопротекторное действие при применении на фоне цитостатической полихимиотерапии;

- отсутствие стимулирующего влияния на пролиферацию и диссеминацию опухоли при цитостатической полихимиотерапии.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 3-Оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен 1. К раствору 1 ммоль (0,47 г) хлорангидрида бетулоновой кислоты II, полученного согласно [15], в 30 мл сухого CHCl₃, добавляли 1 ммоль (0,12 мл) N-метилпиперазина и 3 мл Et₃N, кипятили с обратным холодильником 8 ч. Реакционную смесь промывали 5% раствором HCl (2 раза по 50 мл), водой (1 раз 50 мл), сушили над Na₂SO₄, растворитель упаривали в вакууме, остаток хроматографировали на колонке с Al₂O₃, элюируя хлороформом, продукт кристаллизовали из CHCl₃-МеОН. Выход 0,38 г (75%). Т. пл. 78-79°С. [α]_D ²⁰+16,4° (с 0,05, CHCl₃). Найдено, %: С 78.36. Н 10.60, N 5.27. C₃₅H₅₆H₂O₂ (Mr 536.839). Вычислено, %: С 78.31, Н 10.51, N 5.22. Спектр ЯМР ¹Н (δ, м. д.): 0.86, 0.92, 0.96, 1.02, 1.12 (5 с, 15Н, 5CH₃), 1.22-2.12 (м, 22Н, СН₂, СН), 1.67 (с, 3Н, СН₃), 2.06-2.18 (м, 4Н, Н2′, Н4′), 2.29 (с, 3Н, СН₃), 2.32-2.56 (м, 3Н, Н13, Н16), 2.84-3.04 (м, 5Н, Н19, Н1′, Н3′), 4.57 и 4.73 (оба уш. сигнала, по 1Н, Н29). Спектр ЯМР ¹³С (δ, м. д.): 14.5, 15.8, 15.9, 19.3, 19.6, 20.9, 21.6, 22.9, 25.6, 26.5, 29.7, 31.3, 32.4, 33.6, 34.1, 35.9, 36.9, 38.1, 39.6, 40.5, 40.8, 41.8, 45.5 (С1′), 45.9 (С4′), 47.3, 50.2, 52.6, 54.3 (С2′), 54.5 (С3′), 55.0, 55.2, 109.1, (С29), 151.2 (С20), 173.4 (CONH), 218.1 (С3).

Пример 2. Изучение противоопухолевого действия соединения I на мышах с перевиваемой карциномой легких Льюиса.

Противоопухолевое действие 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ена (I) исследовали на 34 мышах-самках линии C57BL/6 массой 20-25 г, которым перевивали внутримышечно клеточную суспензию карциномы легких Льюиса в объеме 5×10⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора. Через 10 дней после перевивки мышей делили на 3 группы (по 10-12 особей в каждой). Опытной группе мышей ежедневно в течение 7 дней вводили внутрижелудочно соединение I в виде водно-твиновой взвеси в дозе 50 мг/кг (по 0,2 мл на 10 г массы тела). Эталоном эффекта являлась группа животных, которым проводилась цитостатическая полихимиотерапия (ПХТ) по стандартной схеме АСОР в модификации [12]: однократное парентеральное введение циклофосфана (50 мг/кг), доксорубицина (4 мг/кг), винкристина (0,1 мг/кг) и преднизолона (5 мг/кг). Контролем являлись животные с опухолью. Контроль и группа с полихимиотерапией получали в течение 7 дней водно-твиновую взвесь. Величину противоопухолевого эффекта определяли по индексу торможения роста опухоли (ТРО) как разность средних размеров опухолей в контрольной и опытной группах, отнесенную к среднему размеру опухолей в контроле. В конце опыта ТРО рассчитывали по массе опухоли, которую определяли как разницу между массой лапы с опухолью и здоровой коллатеральной конечностью.

В таблице 1 приведены абсолютные и относительные размеры опухолевых узлов во время введения соединения I. Относительные значения объемов, выраженные в процентах от фоновых значений в каждой группе, позволяют более корректно сравнить результаты лечения в опытной и референсной группах, так как исходные размеры опухолей в них заметно отличаются. Показано, что на протяжении всего периода наблюдений объем опухолевых трансплантатов в группе с введением агента I был достоверно ниже, чем в контроле. В группе сравнения наблюдалась почти такая же динамика роста опухоли. Достоверное превышение объема опухоли в опытной группе над показателями референсной на 4-8 сутки введения отчасти связано с более высокими исходными (фоновыми) объемами опухолей у опытных мышей.

Таблица 1 Изменение динамики роста карциномы легких Льюиса у мышей под влиянием внутрижелудочного введения агента (I) Группа Объем опухоли, см³ (в % относительно фоновых значений) Масса опухоли Сутки после полихимиотерапии 0 (фон) 2 4 7 8 Конт
роль 1,33±0,07
0% 2,05±0,13
54% 2,78±0,18
109% 4,67±0,22
251% 5,56±0,22 ПХТ 1,12±0,08
0% 1,42±0,10**
27% 1,74±0,13***
55% 3,08±0,18***
175% 4,35±0,22** I, 50 мг/кг 1,30±0,05
0% 1,37±0,08**
5% 2,17±0,12**#
67% 3,б2±0,16**#
178% 5,07±0,20# *Р<0,05; **Р<0,001; ***Р<0,0001 - различия с контролем достоверны # Р<0,05 - различия с группой сравнения достоверны

Данные ТРО, приведенные в таблице 2, показывают, что в начале лечения эффект агента не уступал ПХТ, а затем снизился в 1,5 раза относительно референсной группы (частично из-за разницы в фоновых показателях). В целом соединение I проявило высокую противоопухолевую активность в течение всего периода наблюдения.

Таблица 2 Значения индекса торможения роста карциномы легких Льюиса (ТРО) у мышей в период введения агента I Группа ТРО % (по объему опухоли) ТРО % (по массе опухоли) Сутки после полихимиотерапии 0 (фон) 2 4 7 8 ПХТ 16 31 37 34 22 I, 50 мг/кг 2 33 22 22 9

Таким образом, показано, что агент I обладает противоопухолевой активностью, сравнимой с активностью цитостатической ПХТ АСОР.

Пример 3. Изучение антиметастатического действия соединения I на мышах с перевиваемой карциномой легких Льюиса.

Антиметастатические свойства изучали на мышах-самках линии C57BL/6 массой 20-25 г с солидной карциномой легких Льюиса. Клеточную суспензию опухоли перевивали внутримышечно в объеме 5×10⁶ в 0,1 мл физиологического раствора. Через 10 дней после перевивки опытной группе мышей ежедневно в течение 7 дней вводили внутрижелудочно соединение I в виде водно-твиновой взвеси в дозе 50 мг/кг (по 0,2 мл на 10 г массы тела). В качестве группы сравнения использовали такую же группу животных с полихимиотерапией АСОР (однократное парентеральное введение циклофосфана, доксорубицина, винкристина и преднизолона на десятый день после перевивки опухоли). Контроль и группа с полихимиотерапией получали в течение 7 дней водно-твиновую взвесь. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали легкие и после стандартной гистологической обработки исследовали методом световой микроскопии. Антиметастатический эффект определяли путем морфометрического анализа срезов обеих долей легких. Объемную плотность (Vv%) метастазов подсчитывали по методу Автандилова [13] с использованием окулярной сетки на 289 точек. Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (ЧМ) (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ):

где А_к - частота метастазирования в контрольной группе, А - частота метастазирования в опытной группе, В_к - плотность метастазов у животных контрольной группы,

В - плотность метастазов у животных опытной группы.

Установлено, что агент I тормозит диссеминацию опухоли в 1,2 раза относительно контроля, тогда как введение химиотерапевтических препаратов АСОР уменьшает количество метастатических поражений в 7,5 раза. Однако в обеих группах показатели объемной и поверхностной плотности метастазов не имели достоверных различий с контролем ввиду значительных колебаний (табл.3). По количеству животных без метастазов опытная группа практически не отличалась от контроля, в отличие от референсной группы. По этим причинам ИИМ агента I уступал в 3 раза данному показателю группы ПХТ (табл.3). Тем не менее, величина ИММ агента (30%) свидетельствует о наличии у него слабого антиметастатического действия.

Таблица 3. Показатели метастазирования карциномы легких Льюиса в легких мышей после 7-дневного введения агента I Группа метастазы Vv% ЧМ, % ИИМ, % Контроль 9,77±5,55 3,38±1,92 83 0 ПХТ 1,40±0,86 0,48±0,29 55 91 I 7,97±3,37 2,76±1,16 85 30 Vv% - объемная плотность метастазирования; ЧМ - частота метастазирования; ИИМ - индекс ингибирования метастазирования

Таким образом, установлено, что соединение I не стимулирует диссеминацию опухоли, проявляя небольшой антиметастатический эффект.

Пример 4. Исследование антиоксидантного действия I на мышах с перевиваемой карциномой легких Льюиса

Мышей-самок линии C57BL/6 массой 20-25 г делили на 3 группы по 10-12 особей в каждой. Клеточную суспензию карциномы легких Льюиса перевивали всем животным внутримышечно в объеме 5×10⁶ в 0,1 мл физиологического раствора. Через 10 дней после перевивки опытной группе в течение 7 дней вводили внутрижелудочно агент I в виде водно-твиновой взвеси в дозе 50 мг/кг, референсной группе проводили однократную ПХТ по схеме АСОР. Контролем являлись животные с опухолью, в качестве физиологической нормы брали группу интактных животных без опухоли. Контрольные животные и группа с полихимиотерапией АСОР получали в те же сроки эквивалентное количество водно-твиновой взвеси. Животных выводили из опыта декапитацией, получали сыворотку крови и определяли в ней концентрацию малонового диальдегида общепринятым методом [14]. Данные, представленные в табл.4, показывают, что в условиях неопластического роста усиливаются процессы перекисного окисления, что выражается в достоверном повышении уровня малонового диальдегида во всех экспериментальных группах относительно физиологической нормы (интактных животных). На этом фоне агент I проявил тенденцию к снижению концентрации малонового диальдегида в крови животных, тогда как введение цитостатических препаратов оказало прооксидантное действие группе с ПХТ. Различие в уровне МДА между опытной и референсной группами составило 2,5 раза и являлось статистически достоверным (табл.4).

Таблица 4 Изменение биохимических показателей в крови мышей с карциномой легких Льюиса под влиянием 7-дневного введения агента I Группа Норма Контроль ПХТ I МДА, мкмоль/л 0,57±0,16 1,31±0,07 2,76±0,70 1,09±0,08^{## ##} р<0.005 - достоверно относительно группы ПХТ

Таким образом, показано, что введение агента I не повышает интенсивность перекисного окисления в организме животных-опухоленосителей, в отличие от цитостатической полихимиотерапии, которая оказывает прооксидантное действие.

Пример 5. Влияние агента на тяжесть патоморфологических нарушений внутренних органов у мышей с перевиваемой карциномой легких Льюиса.

Влияние агента I на патоморфологические нарушения, вызванные опухолевым ростом, изучали на 3 группах мышей-самок линии C57BL/6, которым перевивали внутримышечно солидную карциному легких Льюиса, как указано выше. Через 10 дней после перевивки опытной группе в течение 7 дней вводили внутрижелудочно агент (I) в виде водно-твиновой взвеси в дозе 50 мг/кг, референсной группе проводили однократную ПХТ по схеме АСОР, как указано выше. Контролем являлись животные с опухолью, в качестве физиологической нормы брали группу интактных животных без опухоли. Контрольные животные и группа с полихимиотерапией АСОР получали в те же сроки эквивалентное количество водно-твиновой взвеси, контрольная группа в те же сроки - водно-твиновую смесь. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали печень, почки, сердце, селезенку и после стандартной гистологической обработки проводили патоморфологическое исследование методом световой микроскопии. Результаты патоморфологического анализа по каждой группе животных представлены ниже.

Интактные животные. В легких у всех животных выявлялось умеренное венозное полнокровие. Стенки долевых бронхов имели типичное строение. Слизистая выстлана высоким призматическим эпителием, подслизистый слой слабо выражен; мышечная оболочка образована гладкомышечными волокнами; адвентиция в виде плотной волокнистой соединительной ткани. Межальвеолярные перегородки тонкие. Воспалительных и дегенеративных изменений не выявлено. Миокард интактных животных имел типичное строение. Саркоплазма мышечных клеток равномерно окрашена эозином в розовый цвет, в большей части клеток контурируется поперечная исчерченность. Ядра кардиомиоцитов овально-вытянутые, занимают в клетке центральное положение, хроматин имеет глыбчатое строение. Соединительная ткань представлена фибробластами, которые располагаются вдоль мышечных клеток. Волокнистая соединительная ткань представлена адвентицией вокруг сосудов среднего и мелкого калибра. Патологических изменений в сердце не выявлено. Архитектоника печени сохранена. Выявляются венозное полнокровие, очаговая гидропическая дистрофия в центролобулярных отделах долек, единичные некрозы отдельных клеток, инфильтрированные лимфогистиоцитами. Почки, селезенка имеют типичное строение, патологических изменений в этих органах не выявлено.

Контрольная группа (опухоль). У животных контрольной группы наблюдались патологические изменения, связанные с прогрессированием опухоли. В легких у всех животных на фоне умеренного венозного полнокровия выявлялись крупно- и мелкоочаговые метастазы, расположенные периваскулярно и субплеврально. Просветы терминальных бронхов и альвеол были эмфизематозно расширены. В паренхиме печени у всех животных выявлялись единичные мелкие клеточные метастазы и диффузные моноцеллюлярные некрозы гепатоцитов. В печеночных клетках центролобулярных отделов долек развилась очаговая гидропическая дистрофия и мелковезикулярная липидная инфильтрация. Синусоиды были незначительно расширены, в просвете их выявлялись инфильтраты, состоящие из нейтрофилов. В селезенке у всех животных выявлялась незначительная гиперплазия белой пульпы; в мозговом веществе - единичные мегакариоциты и незначительная инфильтрация полинуклеарами (нейтрофилы, эозинофилы).

Референсная группа (ПХТ). У мышей референсной группы через 8 дней после проведения полихимиотерапии наряду с уменьшением метастатических очагов отмечалось усиление патологических сдвигов в органах, вызванное токсическим воздействием цитостатических препаратов. В легких на фоне венозного полнокровия наблюдалось эмфизематозное расширение просветов терминальных бронхов и альвеол; у отдельных животных выявлялись лишь единичные периваскулярные клеточные метастазы. При исследовании миокарда в проходящем свете установлено венозное полнокровие, более интенсивное окрашивание цитоплазмы части кардиомиоцитов эозином в розовый цвет и фрагментация ее на отдельные глыбки. При исследовании срезов в поляризованном свете выявлялись контрактурные изменения кардиомиоцитов (слияние анизотропных и изотропных дисков, усиление интенсивности свечения). В паренхиме печени на фоне венозного полнокровия появились более грубые некродистрофические изменения, чем у животных контрольной группы: гидропическая и очаговая баллонная дистрофия, моноцеллюлярные и крупноочаговые некрозы гепатоцитов, выраженная инфильтрация синусоидов полинуклеарами, единичные метастатические клетки. В почках были отмечены тонкие базальные мембраны клубочков, расширение мезангиального матрикса. В эпителиоцитах дистальных и проксимальных канальцев выявлялась умеренно выраженная гидропическая дистрофия. В интерстициальной ткани у всех животных были отмечены отек и венозное полнокровие. В селезенке наблюдалась гиперплазия белой пульпы, выраженная инфильтрация красной пульпы полинуклеарами, очаги внекостномозгового кроветворения в стадии некроза.

Опытная группа (опухоль + агент I). При введении агента I животным с перевитой опухолью в легких выявляются единичные крупно- и мелкоочаговые метастазы, сохраняется венозное полнокровие и эмфизематозные изменения бронхов и альвеол. В миокарде патологических изменений не выявлено. В печени выявляется уменьшение степени выраженности дистрофического поражения по сравнению с животными контрольной группы (гидропическая дистрофия носит очаговый характер и выявляется в отдельных клетках центролобулярной зоны). Кроме того, отмечается уменьшение инфильтрации полинуклеарными клетками синусоидов и портальных трактов. Сохраняются по-прежнему, как и в контроле, диффузные моноцеллюлярные некрозы на фоне умеренного венозного полнокровия. В почках, как и в контрольной группе, выявляются признаки умеренно выраженного тубулоинтерстициального нефрита (дистрофия эпителиоцитов всех отделов нефрона, в просвете канальцев цилиндры и спущенный эпителий). В селезенке животных данной группы отмечается выраженная инфильтрация синусов красной пульпы нейтрофилами и эозинофилами (полинуклеарные клетки) и гиперплазия белой пульпы.

Таким образом, введение агента I в дозе 50 мг/кг мышам с карциномой Льюиса снижает тяжесть некробиотических повреждений тканей, вызванных опухолью. На общее положительное действие изучаемого агента указывает также гиперплазия белой пульпы селезенки, которая свидетельствует о повышении иммунной активности. Кроме того, инфильтрация красной пульпы селезенки клетками гранулоцитарного ряда свидетельствует о стимуляции процессов кроветворения. Для морфологической картины в референсной группе характерны изменения, связанные с усилением дегенеративных и альтеративных процессов, а также наличие грубых некробиотических нарушений в структуре сердца, печени, почек, селезенки.

Пример 6. Изучение влияния соединения I на противоопухолевый эффект цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой легких Льюиса.

Мышей-самок линии C57BL/6 делили на 3 группы по 10-12 особей в каждой. Всем животным перевивали внутримышечно клеточную суспензию карциномы легких Льюиса, как указано выше. Через 10 дней после перевивки двум группам животных вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР: доксорубицин (4 мг/кг), циклофосфан (50 мг/кг), винкристин (0,1 мг/кг), преднизолон (5 мг/кг). Одной из этих групп через сутки после полихимиотерапии вводили внутрижелудочно соединение I в виде водно-твиновой взвеси по 0,2 мл на 10 г массы тела в дозе 50 мг/кг, вторая группа с ПХТ АСОР являлась референсной. Контролем являлись животные с опухолью. Введение агента I опытным мышам продолжали 7 дней. Контроль и группа с полихимиотерапией АСОР получали в те же сроки эквивалентное количество воды с твином. Величину противоопухолевого эффекта определяли по индексу торможения роста опухоли (ТРО), как разность средних размеров опухолей в контрольной и опытной группах, отнесенную к среднему размеру опухолей в контроле. В конце опыта ТРО рассчитывали по массе опухоли, которую определяли как разницу между массой лапы с опухолью и здоровой коллатеральной конечностью.

В таблице 5 показана динамика роста опухоли в процессе лечения. Представлены абсолютные и относительные (в % относительно фона) значения объема трансплантатов, позволяющие нивелировать разницу в их размерах до лечения. Установлено, что агент I, вводимый на фоне ПХТ, не стимулирует развитие опухоли: в опытной и референсной группах наблюдался достоверный противоопухолевый эффект относительно контроля. Отмечено, что под влиянием агента I относительные размеры опухоли дополнительно снизились в 1,2-1,4 раза по сравнению с референсной группой, однако этот эффект не был статистически достоверным (табл.5).

Таблица 5 Изменение динамики роста карциномы легких Льюиса под влиянием введения агента (I) на фоне цитостатической полихимиотерапии (ПХТ) Группа Объем опухоли, см³ (в % относительно фоновых значений) Масса опухоли Сутки после полихимиотерапии 0 (фон) 2 4 7 8 конт
роль 1,33±0,07
0% 2,05±0,13
54% 2,78±0,18
109% 4,67±0,22
251% 5,56±0,22 ПХТ 1,12±0,08
0% 1,42±0,10**
27% 1,74±0,13***
55% 3,08±0,18***
175% 4,35±0,22** ПХТ+1 1,29±0,09
0% 1,62±0,08*
26% 1,79±0,12***
39% 3,27±0,17***
153% 4,57±0,19** *Р<0,05; **Р<0,001; ***Р<0,0001 различия с контролем достоверны

Значения показателя ТРО показывают заметный противоопухолевый эффект в опытной и референсной группах (табл.6). С учетом выявленных различий в фоновых значениях можно отметить, что агент I способен незначительно усиливать противоопухолевое действия ПХТ.

Таблица 6 Значения индекса торможения роста карциномы легких Льюиса (ТРО) у мышей в период введения агента I на фоне полихимиотерапии (ПХТ) Группа ТРО, % (по объему опухоли) ТРО, % (по массе опухоли) Сутки после полихимиотерапии 0 2 4 7 8 ПХТ 16 31 37 34 22 ПХТ+1, 50 мг/кг 3 21 36 30 18

Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что введение агента I в условиях ПХТ не оказывает пролиферирующего действия на трансплантаты карциномы легких Льюиса. У соединения выявлена тенденция к усилению противоопухолевого действия ПХТ.

Пример 7. Изучение влияния соединения I на антиметастатический эффект цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой легких Льюиса.

Антиметастатические свойства изучали на мышах самках линии C57BL/6 массой 20-25 г с солидной карциномой легких Льюиса. Клеточную суспензию карциномы легких Льюиса перевивали внутримышечно в объеме 5×10⁶ в 0,1 мл физиологического раствора. Через 10 дней после перевивки двум группам животных вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР: доксорубицин (4 мг/кг), циклофосфан (50 мг/кг), винкристин (0,1 мг/кг), преднизолон (5 мг/кг). Одной из этих групп, начиная через сутки после полихимиотерапии, в течение 7 дней вводили внутрижелудочно соединение I в виде водно-твиновой взвеси в дозе 50 мг/кг, вторая группа с ПХТ являлась референсной. Контроль и группа с полихимиотерапией получали в течение 7 дней водно-твиновую взвесь. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали легкие и после стандартной гистологической обработки исследовали методом световой микроскопии. Антиметастатический эффект определяли путем морфометрического анализа срезов обеих долей легких. Объемную плотность (Vv%) метастазов подсчитывали по методу Автандилова [13] с использованием окулярной сетки на 289 точек. Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (ЧМ) (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ) [Архипов С.А. и др., 1984]:

, где

А_к - частота метастазирования в контрольной группе, А - частота метастазирования в опытной группе, В_к - плотность метастазов у животных контрольной группы,

В - плотность метастазов у животных опытной группы.

Установлено, что в обеих группах с введением цитостатических препаратов наблюдалось существенное в 5,5-7,5 раз снижение объемной и поверхностной плотности метастазов относительно контроля. Однако в обеих группах показатели объемной и поверхностной плотности метастазов не имели достоверных различий с контролем ввиду значительных колебаний (табл.7). По количеству животных без метастазов опытная группа практически не отличалась от контроля, в отличие от референсной группы, где наблюдалось снижение количества мышей без метастатических поражений в 1,5 раза. Тем не менее, величина ИММ у животных опытной группы свидетельствует о незначительном, по отношению к референсной группе, снижении антиметастатического эффекта ПХТ под влиянием агента (в 1,1 раза).

Таблица 7 Показатели метастазирования карциномы легких Льюиса в легких мышей после 7-дневного введения агента I на фоне полихимиотерапии (ПХТ) Группа метастазы Vv% ЧМ% ИИМ % контроль 9,77±5,55 3,38±1,92 83 0 ПХТ 1,40±0,8б 0,48±0,29 55 91 ПХТ+1 1,71±1,08 0,59±0,37 90 81

Таким образом, введение агента I на фоне ПХТ не приводит к существенным изменениям ее антиметастатического эффекта, что указывает на то, что он не стимулирует диссеминацию опухоли в условиях стандартной полихимиотерапии.

Пример 8. Исследование антиоксидантного действия соединения I в условиях цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой легких Льюиса

Мышей-самок линии C57BL/6 массой 20-25 г делили на 3 группы по 10-12 особей в каждой. Клеточную суспензию карциномы легких Льюиса перевивали внутримышечно в объеме 5×10⁶ в 0,1 мл физиологического раствора. На 10-й день после перевивки двум группам животным вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР. Одной из этих групп через сутки после полихимиотерапии внутрижелудочно вводили агент I в виде водно-твиновой взвеси в дозе 50 мг/кг, вторая группа с ПХТ АСОР являлась референсной. Контролем являлись животные с опухолью, в качестве физиологической нормы брали группу интактных животных без опухоли. Введение агента I опытным мышам продолжали 7 дней. Контрольные животные и группа с полихимиотерапией АСОР получали в те же сроки эквивалентное количество воды с твином. Животных выводили из опыта декапитацией, получали сыворотку крови и определяли в ней концентрацию малонового диальдегида в реакции с тиобарбитуровой кислотой [14].

Результаты, представленные в таблице 8, свидетельствуют об усилении перекисного окисления липидов в постцитостатическом периоде. Показано, что агент I, вводимый в течение семи дней в дозе 50 мг/кг дней на фоне полихимиотерапии, снижает в 2,5 раза концентрацию маркера ПОЛ - МДА в крови животных по сравнению с референсной группой.

Таблица 8 Изменение биохимических показателей в крови мышей с карциномой легких Льюиса под влиянием 7-дневного введения I на фоне цитостатической полихимиотерапии АСОР Группа Норма Контроль ПХТ ПХТ+1 МДА, мкмоль/л 0,57±0,16 1,31±0,07 2,76±0,70 1,11±0,13^{# #} р<0.05 - достоверно относительно группы ПХТ

Таким образом установлено, что агент I оказывает значимый антиоксидантный эффект в условиях ПХТ мышей комплексом цитостатических препаратов.

Пример 9. Изучение цитопротекторных свойств соединения I в условиях цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой легких Льюиса.

Цитопротекторные свойства агента I изучали на 35 мышах-самках линии C57BL/6 с солидной карциномой легких Льюиса, которую перевивали внутримышечно, как указано выше. На 10-й день после перевивки двум группам животных вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР (однократное парентеральное ведение циклофосфана, доксорубицина, винкристина и преднизолона на десятый день после перевивки опухоли). Одной из этих групп через сутки после полихимиотерапии вводили внутрижелудочно агент I в виде водно-твиновой взвеси по 0,2 мл на 10 г массы тела в дозе 50 мг/кг, вторая группа с ПХТ АСОР являлась референсной. Контролем являлись животные с опухолью. Введение агента I опытным мышам продолжали 7 дней. Контрольная и референсная группы получали в те же сроки эквивалентное количество водно-твиновой смеси. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали печень, почки, сердце, селезенку и после стандартной гистологической обработки проводили патоморфологическое исследование методом световой микроскопии.

Результаты патоморфологического анализа по каждой группе животных представлены ниже.

Контрольная группа. У животных контрольной группы наблюдались патологические изменения, связанные с влиянием паранеопластических процессов, характерных для стадии прогрессии опухоли. В легких у всех животных на фоне умеренного венозного полнокровия выявлялись крупно- и мелкоочаговые метастазы, расположенные периваскулярно и субплеврально. Просветы терминальных бронхов и альвеол были эмфизематозно расширены. В паренхиме печени у всех животных выявлялись единичные мелкие клеточные метастазы и диффузные моноцеллюлярные некрозы гепатоцитов. В печеночных клетках центролобулярных отделов долек развилась очаговая гидропическая дистрофия и мелковезикулярная липидная инфильтрация. Синусоиды были незначительно расширены, в просвете их выявлялись инфильтраты, состоящие из нейтрофилов. В селезенке у всех животных выявлялась незначительная гиперплазия белой пульпы; в мозговом веществе - единичные мегакариоциты и незначительная инфильтрация полинуклеарами (нейтрофилы, эозинофилы).

Референсная группа (ПХТ). У мышей референсной группы через 8 дней после проведения полихимиотерапии наряду с уменьшением метастатических очагов отмечалось усиление патологических сдвигов в органах, вызванных токсическим воздействием цитостатических препаратов. В легких на фоне венозного полнокровия наблюдалось эмфизематозное расширение просветов терминальных бронхов и альвеол; у отдельных животных выявлялись лишь единичные периваскулярные клеточные метастазы. В паренхиме печени на фоне венозного полнокровия появились более грубые некродистрофические изменения, чем у животных контрольной группы: гидропическая и очаговая баллонная дистрофия, моноцеллюлярные и крупноочаговые некрозы гепатоцитов, выраженная инфильтрация синусоидов полинуклеарами, единичные метастатические клетки. В почках были отмечены тонкие базальные мембраны клубочков, расширение мезангиального матрикса. В эпителиоцитах дистальных и проксимальных канальцев выявлялась умеренно выраженная гидропическая дистрофия. В интерстициальной ткани у всех животных были отмечены отек и венозное полнокровие. При исследовании миокарда в проходящем свете установлено венозное полнокровие, более интенсивное окрашивание цитоплазмы части кардиомиоцитов эозином в розовый цвет и фрагментация ее на отдельные глыбки. При исследовании срезов в поляризованном свете выявлялись контрактурные изменения кардиомиоцитов (слияние анизотропных и изотропных дисков, усиление интенсивности свечения). В селезенке наблюдалась гиперплазия белой пульпы, выраженная инфильтрация красной пульпы полинуклеарами, очаги внекостномозгового кроветворения в стадии некроза.

Опытная группа (ПХТ + агент I). При введении агента I на фоне полихимиотерапии в исследуемых органах отмечались следующие положительные изменения. В легких уменьшилась площадь метастазов по сравнению с контролем. В печени выявлено уменьшение степени некродистрофического поражения: уменьшение количества некрозов гепатоцитов (сохранились лишь моноцеллюлярные), преимущественно мелковезикулярная липидная инфильтрация, большое количество увеличенных в размерах купферовских клеток в просвете синусоидов. У всех животных этой группы по-прежнему сохранялась выраженная инфильтрация полинуклеарами синусоидов и портальных трактов. В почках также отмечено уменьшение степени тяжести дистрофического поражения эпителиоцитов (гидропическая дистрофия встречалась лишь в отдельных клетках), уменьшение явления отека интерстициальной ткани. В селезенке наблюдалась гиперплазия белой пульпы и увеличение количества очагов внекостномозгового кроветворения по сравнению с животными референсной группы без признаков распада и дегенерации. В миокарде грубых патологических изменений не выявлено.

Таким образом, под действием агента I, вводимого на фоне ПХТ, уменьшилась степень дистрофических и некротических поражений экскреторных органов (печень, почки), а также появились признаки повышения иммунной активности и стимуляции процессов кроветворения в селезенке.

Источники информации

1. Кулик Г.И. Вопросы онкологии. 1986. № 7. С.778-786.

2. Гольберг Е.Д., Зуева Е.П. Препараты из растений в комплексной терапии злокачественных заболеваний. Томск, изд. Томского университета, 2002. 130 с.

3. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Агафонов В.И. // Эксперим. и клин. фармакология. 1995. Т.85. № 1. С.3-7.

4. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Н.И.Петренко, Э.Э.Шульц, Н.В.Узенкова и др. // Доклады академии наук. 2004. Т.399. № 2. С.274-277.

5. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Петренко Н.И., Узенкова Н.В., Шульц Э.Э., Попова Н.А. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2006. № 1. С.69-72.

6. Жукова Н.А., Семенов Д.Е., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Позднякова С.В., Грек О.Р. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2005. Т.14. № 9. С.348-351.

7. В.В.Saxena, L.Zhu, M.Hao, E.Kisilis, M.Katdare, O.Oktem, A.Bomshteyn, P.Rathnam. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006. V.14. 6349-6358.

8. Покровский А.Г., Шинтяпина А.Б., Н.В.Пронкина, B.C.Кожевников, Плясунова О.А., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. // Доклады академии наук. 2006. Т.407. № 5. С.698-701.

9. Патент РФ 2211843 от 25.01.2002 г. по заявке 2002102338/04. БИПМ. 2003. № 25. Ч.3. С.498-499.

10. Шинтяпина А.Б., Шульц Э.Э., Петренко Н.И., Узенкова Н.В., Толстиков Г.А., Пронкина Н.В., Кожевников B.C., Покровский А.Г. // Биоорганическая химия. 2007. Т.33. № 6. 620-626.

11. Гершанович М.Л., Филов В.А., Акимов М.А., Акимов А.А. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей. С-Пб.: Сотис, 1999. С.105.

12. Грек О.Р., Мишенина С.В., Пупышев А.Б. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2002. Т.134. № 10. С.413-417.

13. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. - M.: Медицина, 1990. 384 с.

14. Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике. Минск: Беларусь, 2000. Т.2. С.207.

15. Флехтер О.Б., Бореко E.И., Нигматуллина Л.Р., Павлова Н.И., Николаева С.Н., Савинова О.В., Еремин В.Ф., Балтина Л.А., Галин Ф.3., Толстиков Г.А. Синтез и противовирусная активность гидразидов и замещенных бензальгидразидов бетулиновой кислоты и ее производных. // Биоорган. химия. - 2003. - Т.29. - № 3. - С.326-332.

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ену формулы (I), которое может быть использовано в медицине в качестве корректора паранеопластических повреждений и токсических эффектов цитостатической полихимиотерапии.

Соединение I обладает выраженной противоопухолевой активностью, снижает тяжесть патологических изменений в тканях, вызванных паранеопластическими синдромами, проявляет в условиях цитостатической полихимиотерапии выраженный антиоксидантный и цитопротекторный эффект в нормальных клетках внутренних органов и при этом не стимулирует пролиферацию и диссеминацию опухоли. 8 табл.

3-Оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен формулы (I):

обладающий свойствами корректора паранеопластических повреждений и токсических эффектов цитостатической полихимиотерапии.