ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЕ СРЕДСТВО С АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ, ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2011 года по МПК A61K31/727 A61K31/198 A61K31/192 A61K47/36 A61P7/02 A61K35/00 A61K35/04 C08B37/10 

Изобретение предназначено для использования в медицине и касается средства, обладающего антикоагулянтной, противовоспалительной, противоопухолевой и антиметастатической активностью.

Заявляемое средство является конъюгатом гепарина с нестероидным противовоспалительным препаратом ибупрофеном, присоединенным к гепарину через остаток лизина (формула I).

Существующая потребность в подобных препаратах связана с лечением осложнений, возникающих при опухолевых заболеваниях. Так, одним из тяжелых синдромов у больных с солидными злокачественными новообразованиями является тромбоз. Причиной этой патологии является высокая, в сравнении с нормальной тканью, тромбопластическая активность злокачественных клеток, запускающая клеточно-тканевые реакции тромбогеморрагического синдрома и приводящая к внесосудистому межклеточному, а затем и внутрисосудистому свертыванию [Клиническая онкогематология. / Под ред. Волковой М.А., М. "Медицина", 2001. - С.469-478]. В этих условиях, учитывая связь системы гемостаза с течением злокачественного процесса, можно ожидать повышения эффективности лечения при применении различных коагулоактивных препаратов, в том числе фибринолитиков, антикоагулянтов и антиагрегантов [Надирадзе И.Ш. Рак, гемостаз и коагулоактивные препараты. Вопросы онкологии, 1989. - Т.35. - №12. С.34-36]. Одним из наиболее активных антикоагулянтов является гепарин, который выступает кофактором антитромбина III и вместе с ним ингибирует активность тромбина, факторов IXa, Xa, XIa и ХIIа системы свертывания крови и калликреина [Марри Р., Греннер Д., Мейес п.и др. Биохимия человека: В 3 т. Т.2. Пер. с англ. - М.: Мир, 1993]. Установлено, что применение гепарина повышает эффективность химиотерапии больных раком легкого [Надирадзе И.Ш. Рак, гемостаз и коагулоактивные препараты. Вопросы онкологии, 1989. - Т 35. - №12. С 34-36; Kakkar A.K., Levine M.N., Kadziola Z., Lemoine N.R. et al. Low molecular weight heparin, therapy with dalteparin, and survival in advanced cancer: the fragmin advanced malignancy outcome study (FAMOUS). J. Clin. Oncol., 2004. - V.22. - №10. - P.1944-1948].

С другой стороны, процессы злокачественного роста и диссеминации, характеризующиеся усилением неоангиогенеза, миграции, адгезии и инвазии опухолевых клеток, непосредственно связаны с разрушением межклеточных контактов, экстрацеллюлярного матрикса и базальных мембран, которые обеспечиваются протеогликанами, и также зависят от уровня ингибиторов плазмина и ингибиторов активатора плазминогена [Герштейн Е.С., Гончаров Д.Ю., Кушлинский Н.Е. и др. Активаторы плазминогена урокиназного и тканевого типов и их ингибитор первого типа при раке пищевода (предварительные результаты). Совр. онкология, 2001. - Т.3. - №4. - С 34.; Лягинский А.В., Егоров Б.Б. Роль активаторов плазминогена в развитии опухоли и процессе ее метастазирования. Вопр. онкологии, 1989. - Т 35. - №12. - С.14]. В этой связи эффективными средствами для купирования этих синдромов могут выступать препараты на основе природных гликозаминогликанов (ГАГ), прежде всего гепарин и его производные. Известно, что гепарин и другие ГАГ участвуют в росте опухолевых клеток, их адгезии, инвазии и миграции, что обусловлено их взаимодействием со специфическими белками. Находящиеся на клеточной поверхности молекулы ГАГ регулируют передачу сигналов снаружи внутрь опухолевых клеток путем взаимодействия с различными факторами роста и сигнальными молекулами. Адгезия опухолевых клеток также поддерживается гликозаминогликанами клеточной мембраны, которые действуют как лиганды для P-селектина и/или как корецепторы для интегринов. С другой стороны, ГАГ могут действовать в межклеточном матриксе как физический барьер, задерживающий метастатические клетки. Здесь они также являются местом накопления различных белков-регуляторов [Иммунология: В 3 т. Т.3. Пер. с англ. / Под ред. У.Пола. - М.: Мир, 1987 - 1989. - С.170-231.; Campo G.M., Avenoso A., Campo S., D'Ascola A. et al. Glycosaminoglycans reduce oxidative damage induced by copper (Cu⁺²), iron (Fe⁺²) and hydrogen peroxide (H₂O₂) in human fibroblast cultures // Glycoconj. J. 2004. - V.20. - P.133-141.; Campo G.M., Avenoso A., Campo S., D'Ascola A. et al. Reduction of DNA fragmentation and hydroxyl radical production by hyaluronic acid and chondroitin-4-sulphate in iron plus ascorbate-induced oxidative stress in fibroblast cultures // Free Radio. Res., 2004. - V.38(6). - P.601-611; Essentials of Glycobiology./Edit. by Varki A., Cummings R., Esko J., Freeze H. et al. - La Jolla, California.: CSHL Press, 1991. - P.653]. Гепарин и другие гликозаминогликаны также играют существенную роль в контролировании воспалительной реакции, которая резко усиливается на фоне паранеопластического состояния [1-4].

1. Марри Р., Греннер Д., Мейес п.и др. Биохимия человека: В 3 т. Т.2. Пер. с англ. - М.: Мир, 1993.

2. Энциклопедия лекарств. / Под ред. Крылова Ю.Ф. - М.: РЛС, 2001. - 1504 С.

3. Chung Y.I., Tae G., Hong Y.S. A facile method to prepare heparin-functionalized nanoparticles for controlled release of growth factors. Biomaterials, 2006. - V.27 (12). - P.2621-2626.

4. Cripps J.G., Crespo F.A., Romanovskis P., Spatola A.F et al. Modulation of acute inflammation by targeting glycosaminoglycan-cytokine interactions. // Inter. Immunopharmacology, 2005. - V.5 (11). - P.1622-1632.

Выраженный отрицательный заряд и конформационные особенности молекул гепарина позволяют им вступать в электростатические взаимодействия с медиаторами воспаления, создавая их депо, и/тем самым осуществлять регуляцию выхода медиаторов в межклеточное пространство [Надирадзе И.Ш. Рак, гемостаз и коагулоактивные препараты. Вопр. онкологии, 1989. - Т 35. - №12. С 34-36]. Кроме того, гепарин является прямым ингибитором протеаз, принимающих участие в воспалении [Campo G.M., Avenoso А., Campo S., D'Ascola A. et al. Purified human plasma glycosaminoglycans limit oxidative injury induced by iron plus ascorbate in skin fibroblast cultures. // Toxicology in Vitro, 2005. - V.19. - P.561-572.; Handel Т.M., Johnson Z., Crown S.E., Lau E. K. et al. Regulation of protein function by glycosaminoglycans - as exemplified by chemokines // Annu. Rev. Biochem., 2005. - V.74. - P.385-410].

Благодаря способности гепарина к химической модификации, можно создавать на его основе полусинтетические производные с заданными свойствами. Например, использование аминосоединений для модификации природных ГАГ с образованием амидной связи по карбоксильной группе остатка уроновой кислоты обеспечивает образование устойчивых и высокоактивных конъюгатов ГАГ с фармакофорами с известными биологическими свойствами [Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Лукина B.C., Суфиярова Р.Ш., Парфенова Т.И., Башкатов С.А., Сибагатуллин Н.Г., Джемилев У.М. Способ получения модифицированных гликозаминогликанов, обладающих анальгезирующими свойствами. Пат.РФ №2283320 (2006 г.); Ponedelkina I. Yu., Odinokov V.N., Vakhmsheva E.S., Golikova M.T., et al. Modification of Hyaluronic Acid with Aromatic Ammo Acids // Russian J. Bioorg. Chem., 2005. - V.31. - N 1. - P.82-86]. С другой стороны, модификация природными аминокислотами улучшает и свойства нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), что было показано на примере конъюгатов ибупрофена-лизина, индометацина-фенилаланина, индометацина-глицина и др. Установлено, что некоторые конъюгаты природных аминокислот с НПВС не уступают по активности исходным противовоспалительным препаратам, но в десятки раз менее токсичны, в частности, не обладают гастротоксичностью. [Аникина Л.В. Биологическая активность амидов индометацина, напраксена, ибупрофена и природных аминокислот. Диссер. на соиск. уч. ст. к.б.н. - Томск, 2002]. Перспективным является подход, основанный на создании конъюгатов гликозаминогликанов и НПВС. Показано, что структурная модификация гиалуроновой кислоты, гепарина и хондроитинсульфата противовоспалительными агентами 5-аминосалициловой кислотой и 4-аминоантипирином усиливает антифлогогенную и анальгетическую активность полученных соединений [Пат. РФ №2191782 и №2283320].

Задачей изобретения является расширение спектра терапевтического действия потенциального лекарственного средства. Она решается применением конъюгата гепарина с аминокислотой D,L-лизином и нестероидным противовоспалительным препаратом ибупрофеном в качестве антикоагулянтного средства с противовоспалительной, противоопухолевой и антиметастатической активностью.

Условия синтеза и физико-химические характеристики агента (I) приведены в работе [Лукина Е.С. Конъюгация гликозаминогликанов с аминами и карбоновыми кислотами. Дис. канд. хим. наук - Уфа, 2007]. Конъюгат гепарина с ибупрофеном получали по реакции N-гидроксисукцинимидного производного ибупрофена с D,L-лизин-модифицированным гепарином. Содержание остатков ибупрофена в конъюгате составляло ~100% мольн., т.е. на каждое дисахаридное звено гепарина приходился один остаток ибупрофена (схема).

R=SO₃H или Ac, SO₃H/Ac=70/30

Реагенты и условия:

а. [2]=0.1-0.2 ммоль/мл, 2:1:DCC=1:1:1.05, глим, 0-20°С, 10-20 мин;

b. [4]=0.015 ммoль/мл, 4:5:KДИ=1:5:3, Н₂O, рН 4.7-4.8, 20-250°С, 2 ч;

с. [6]=0.02 ммоль/мл, 6:3=1:4-5, (0.1 М NaHCO₃/H₂O)/DMF(1:1), рН=8.5, 20°С, 16-20 ч.

Аналогом заявленного соединения по антикоагулянтному действию является фармакопейный гепарин формулы II, состоящий из сульфатированных остатков D-глюкозамина и L-идуроновой кислоты (моль-масса в среднем 12000-16000 Да).

Аналогом заявленного соединения по противовоспалительному действию является фармакопейный препарат ибупрофен формулы III.

Ибупрофен действует как блокатор циклооксигеназы 1 и 2 типов в каскаде арахидоновой кислоты, что приводит к уменьшению синтеза простагландинов классов Е, F и I и биогенных аминов. Препарат обладает жаропонижающей, анальгетической и антиагрегантной активностью [Машковский М.Д.. Лекарственные средства. - М.: Новая волна, 2006. С.475-477].

L-Лизин является незаменимой аминокислотой, которая в свободном виде участвует в энергетическом обмене, формировании коллагена, улучшает усвоение кальция из крови и транспорт его в костную ткань, понижает уровень триглицеридов в плазме. В составе ГАГ лизин может выступать участником конформационных взаимодействий с интегринами плазмолеммы [Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е. Межклеточные взаимодействия. - Москва: Медицина, 2003. - 288 с.].

Биологическая активность заявленного соединения (I) изучалась путем определения противовоспалительного, противосвертываюшего, противоопухолевого и антиметастатического действия. В качестве препарата сравнения с противовоспалительным действием брали ибупрофен (таблетки в оболочке по 0.2 г, ОАО "Татхимфармпрепараты"). Референсным препаратом с антикоагулянтным эффектом являлся фармакопейный гепарин (5000 ЕД в 1 мл; ОАО "Синтез"). В качестве эталона противоопухолевого действия использовали стандартную схему полихимиотерапии АСОР (циклофосфан, доксорубицин, винкристин и преднизолон) [Гершанович М.Л., Филов В.А., Акимов М.А., Акимов А.А. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей. - СПб.: Сотис, 1999. С.105]. Статистическую обработку данных проводили методами параметрической статистики с использованием пакета программ "Statistika 6.0". Результаты считали достоверными при p<0.05 по критерию Стьюдента.

Для определения противовоспалительной активности использовали стандартные модели воспаления, вызванного каррагенином и гистамином [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: Ремедиум, 2000. С.240]. Соединение (I) вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг. Препарат сравнения ибупрофен (таблетки в оболочке по 0.2 г, ОАО "Татхимфармпрепараты") вводили тем же способом в дозах 15 и 50 мг/кг. Доза 15 мг/кг сопоставима с дозой ибупрофена в конъюгатах с гепарином (11.5 мг/кг), рассчитанной исходя из массовой доли ибупрофена. Противовоспалительный эффект оценивали по уменьшению, по сравнению с контролем, индекса отека, который рассчитывали в процентах как отношение разности здоровой и воспаленной лапы к массе здоровой. Результаты, полученные на обеих моделях, свидетельствуют о высокой противовоспалительной активности соединения I, которая превышает в 1.2-1.4 раз активность ибупрофена в дозе 15 мг/кг (таблицы 1, 2).

Антикоагулянтную активность соединения (I) определяли через 20 мин после его внутрибрюшинного введения в дозе 50 мг/кг путем определения протромбинового времени по стандартной методике с использованием набора реактивов "Техпластин-тест" ("Технология-стандарт") и коагулометра "clot 1A" ("Hospitex"). Препарат сравнения - гепарин - вводили аналогичным способом в дозах 5 и 50 мг/кг (диапазон действующих доз). Контрольным животным вводили эквивалентный объем физиологического раствора. Установлено, что соединение I обладает антикоагулянтной активностью, сравнимой с фармакопейным гепарином (таблица 3).

Исследование противоопухолевой активности проводили на мышах с перевиваемой карциномой легких Льюис. Соединение I вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг в растворе 0.9% хлорида натрия с эмульгатором Tween 80. Группе сравнения вводили однократно парентерально комплекс противоопухолевых препаратов по стандартной схеме АСОР (доксорубицин, циклофосфан, винкристин, преднизолон), контрольным мышам - раствор 0.9% хлорида натрия с эмульгатором Tween 80. Противоопухолевый эффект определяли по динамике изменения объема первичных узлов, а также по индексу торможения роста опухоли, который определяли как отношение разности массы опухоли в контрольной и опытной группах к массе опухоли в контроле. Антиметастатические свойства определяли у этих же животных путем морфометрического анализа гистологических препаратов обеих долей легких с использованием окулярной сетки на 289 точек по методу Автандилова [Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. - М.: Медицина, 1990. 384 с.]. Установлено, что соединение I обладает значимой противоопухолевой активностью, сравнимой с эффектом противоопухолевых препаратов, применяемых по схеме АСОР (таблицы 4, 5). Показано, что соединение I обладает выраженным антиметастатическим действием, уменьшая объемную плотность метастазов в легких в 4 раза по сравнению с контролем. Индекс ингибирования метастазирования составляет 78% (таблица 6).

Таким образом, новое соединение - конъюгат гепарина с лизином и ибупрофеном формулы (I) - можно рассматривать как перспективный противовоспалительный агент, обладающий антикоагулянтной, противоопухолевой и антиметастатической активностью. К отличительным признакам соединения следует отнести:

1. Высокую противововоспалительную активность.

2. Антикоагулянтное действие.

3. Значимый противоопухолевый эффект.

4. Выраженную антиметастатическую активность.

Изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1. Исследование противовоспалительного действия на гистаминовой модели воспаления

Опыт проводили на 72 беспородных мышах самцах массой 22-28 г. Животных делили на 4 группы. Соединение I вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг в растворе хлорида натрия 0.9% с эмульгатором Tween 80 (в три приема). Препарат сравнения ибупрофен (таблетки в оболочке по 0.2 г, ОАО "Татхимфармпрепараты") вводили в том же режиме в дозах 50 и 15 мг/кг. Доза 15 мг/кг соответствует дозе ибупрофена в конъюгатах с гепарином (11.5 мг/кг), рассчитанной исходя из массовой доли ибупрофена. Контрольным животным вводили эквивалентный объем физиологического раствора.

Через 1 час после первого введения агентов (1/3 часть дозы) всем мышам субпланарно в подушечку задней лапы вводили 0.1% водный раствор гистамина (флогоген) в объеме 0.05 мл. Введение агентов повторяли дважды с интервалами 1 час. Через 3 часа после последнего введения животных умерщвляли путем кранио-цервикальной дислокации, отсекали задние лапы ниже голеностопного сустава и определяли массу каждой. На основании этих данных рассчитывали индекс отека, который определяли в процентах как отношение разности масс здоровой и воспаленной лапы к массе здоровой. Противовоспалительный эффект оценивали по разнице индексов отека в контрольной и опытной группах. Результаты приведены в таблице 1.

Сравнение данных показывает, что при воспалении, индуцированном гистамином, соединение I проявляет достоверный противовоспалительный эффект, превышающий в 1.2 раза активность фармакопейного ибупрофена в дозе 15 и практически не уступающий его же эффекту при введении в дозе 50 мг/кг (51% против 55% соответственно). Таким образом, на данной модели воспаления выявлена высокая антифлогогенная активность конъюгата.

Пример 2. Исследование противовоспалительного действия на каррагениновой модели воспаления

Каррагениновую модель воспаления воспроизводили аналогично описанной выше гистаминовой модели. В качестве флогогена использовали 1% водный раствор каррагенина в объеме 0.05 мл.

Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Влияние соединения I на воспаление лапы мышей, вызванное каррагенином Группа Индекс отека, % p Индекс отека относительно контроля, % Противовоспалительный эффект, % Соединение I, 50 мг/кг 48.05±5,17 0.10 74 26 Референс, 15 мг/кг 53.24±9,41 0.38 82 18 Референс, 50 мг/кг 37.12±5,24* 0.01 57 43 Контроль 64.81±8.28 - 100 0 *р<0.05 - различия с контролем достоверны

Как видно из таблицы, введение соединения I вызывает снижение каррагенинового отека лапы на 26% относительно контроля. Показано, что противовоспалительный эффект конъюгата превосходит в 1.4 раза эффект фармакопейного ибупрофена в дозе 15 мг/кг, которая сопоставима с его дозировкой в конъюгате. Отмечено, что в условиях каррагениновой модели воспаления доза 15 мг/кг ибупрофена является недостаточной для достоверного противовоспалительного действия препарата.

Пример 3. Исследование антикоагулянтного действия

Эксперимент проводили на беспородных мышах массой 25-30 г (по 6 особей в группе). Соединение I вводили внутрибрюшинно в растворе 0.9% хлорида натрия с эмульгатором Tween-80 в дозе 50 мг/кг (гепарину в соединении I соответствует доза 16 мг/кг). Референсным препаратом являлся фармакопейный гепарин (раствор гепарина с активностью 5000 ЕД в 1 мл; ОАО "Синтез"), который вводили аналогично двум группам мышей в дозах 5 и 50 мг/кг (1 мг = 130 ЕД). Обе дозы лежат в интервале терапевтических доз для человека (3340 и 33400 ЕД соответственно). Раствор гепарина готовили путем разведения стандартного препарата физиологическим раствором до необходимой концентрации и вводили внутрибрюшинно по 0.2 мл/10 г массы. Контрольным животным вводили эквивалентный объем физиологического раствора с эмульгатором Tween-80. Через 20 минут после введения агентов животных умерщвляли путем мгновенной декапитации. Собранную кровь стабилизировали цитратом натрия (9:1), центрифугировали в течение 7 минут при 1000 об/мин. Полученную плазму повторно центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин, и определяли протромбиновое время с использованием набора реактивов "Техпластин-тест" ("Технология-стандарт") и коагулометра "clot 1A" ("Hospitex") по стандартной методике.

В таблице 3 приведены значения протромбинового времени, отражающие антикоагулянтные свойства агентов.

Таблица 3 Влияние соединения I на время свертывания крови у мышей Группа Протромбиновое время, сек Соединение I 11.16* Гепарин 5 мг/кг 10.94* Гепарин 50 мг/кг 16.20** Контроль 8.04 ** р<0.001; *р<0.01 относительно контроля

Сравнение данных показывает, что конъюгат гепарина с лизином и ибупрофеном достоверно повышает протромбиновое время до уровня референс препарата в дозе 5 мг/кг. Таким образом, соединение I обладает антикоагулянтной активностью, сравнимой с фармакопейным гепарином.

Пример 4. Исследование противоопухолевой активности на перевиваемой карциноме легких Льюис

Мышам линии С57В1/6 (30 шт.) производили внутримышечную перевивку суспензии 5×10⁶ опухолевых клеток солидной карциномы легких Льюис в объеме 0.1 мл (перевивочный материал из коллекции опухолевых штаммов Института цитологии и генетики СО РАН). Соединение I вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг в растворе 0.9% хлорида натрия с эмульгатором Tween 80. Группе сравнения вводили однократно парентерально комплекс противоопухолевых препаратов по стандартной схеме АСОР: доксорубицин (4 мг/кг), циклофосфан (50 мг/кг), винкристин (0.1 мг/кг), преднизолон (5 мг/кг). Контрольным мышам - раствор 0.9% хлорида натрия с эмульгатором Tween 80.

На 2-е, 3-й, 5-е, 7-е и 8-е сутки после введения определяли объем опухолей путем измерений размеров первичного узла по трем взаимно перпендикулярным направлениям. На 9-е сутки мышей умерщвляли дислокацией шейного отдела позвоночника и подсчитывали индекс торможения роста опухоли, который определяли как отношение разности масс опухоли в контрольной и опытной группах к массе опухоли в контроле.

Изменение объемов трансплантатов карциномы легких Льюис под влиянием вводимых агентов показано в табл.4.

Установлено, что соединение I достоверно задерживало рост опухоли в течение 5 дней после введения. Величины индексов торможения роста опухоли для обеих групп, отражающие противоопухолевую активность, приведены в таблице 5.

Таблица 5 Значения индексов торможения роста опухоли в опытной и референсной группах Группа Торможение роста опухоли, % 2 сут 3 сут 5 сут 7 сут 8 сут Соединение I 40 32 24 14 17 АСОР 39 34 35 40 34

Данные таблицы 5 показывают, что соединение I при однократном парентеральном введении в дозе 50 мг/кг оказывает заметное противоопухолевое действие. В первые 4-5 суток эффект агента не уступает действию противоопухолевых препаратов, применяемых по схеме АСОР, затем снижается в 2 раза. Таким образом, показано, что соединение I обладает значимой противоопухолевой активностью.

Пример 5. Исследование антиметастатического действия на перевиваемой карциноме легких Льюис

Мышам линии С57В1/6 (20 шт.) производили внутримышечную перевивку солидной карциномы легких Льюис, как указано выше. Соединение I вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг в растворе 0.9% хлорида натрия с эмульгатором Tween 80, контрольным мышам - раствор 0,9% хлорида натрия с эмульгатором Tween 80. Через 8 суток после введения соединения I мышей умерщвляли цервикальной дислокацией. Легкие извлекали и фиксировали в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2-7.8) в течение 4 суток, а затем подвергали стандартной гистологической обработке на гистологическом комплексе "MICROM" (Karl Zeiss), включая автоматическую проводку, заливку в парафиновые блоки и приготовление срезов толщиной 4-5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты исследовали методом световой микроскопии в проходящем свете. Морфометрический анализ срезов проводили с использованием окулярной сетки на 289 точек с подсчетом объемной плотности (V_v) метастазов на срезах обеих долей легких по методу Автандилова. Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (ЧМ) (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ) [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: Ремедиум, 2000. С.240]:

,

где А_к - частота метастазирования в контрольной группе, А - частота метастазирования в опытной группе, В_к - плотность метастазов у животных контрольной группы, В - плотность метастазов у животных опытной группы. Влияние соединения I на процесс метастазирования показано в табл.6.

Таблица 6 Показатели метастазирования карциномы легких Льюис в легких мышей под влиянием соединения I Группа V_v, % ЧМ, % ИИМ, % Контроль 0.111±0.023 100 0 соединение I 0.027±0.010** 90 78 **р<0,01 - различия с контролем достоверны V_v, % - объемная плотность метастазирования; ЧМ - частота метастазирования; ИИМ - индекс ингибирования метастазирования

Установлено, что соединение I, введенное в дозе 50 мг/кг, оказывает антиметастатическое действие, статистически достоверно снижая объемную плотность метастазов в легких в 4 раза по сравнению с контролем. На выраженный антиметастатический эффект агента указывает также высокий индекс ингибирования метастазирования (табл.6).

Таким образом, предлагаемое изобретение обладает следующими преимуществами, а именно:

- высокой противововоспалительной активностью;

- антикоагулянтным действием;

- существенным противоопухолевым эффектом;

- выраженной антиметастатической активностью.

Предложено применение конъюгата гепарина с лизином и ибупрофеном формулы (1) в качестве противовоспалительного средства с антикоагулянтной, противоопухолевой и антиметастатической активностью. Показано, что конъюгат обладает противовоспалительной активностью, которая в 1,4 раз превышает активность ибупрофена, антикоагулянтная активность сравнима с фармакопейным гепарином. При этом его противоопухолевое действие не уступает действию доксорубицина, циклофосфана, винкристина, преднизолона и показана антиметастатическая активность. 6 табл.

Применение конъюгата гепарина с лизином и ибупрофеном формулы

в качестве противовоспалительного средства с антикоагулянтной, противоопухолевой и антиметастатической активностью.