СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИМБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ Escherichia coli VL-613 Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии и зоотехнии и может быть использовано при промышленном производстве симбиотического препарата из штамма Escherichia coli VL-613.

Симбиоз птицы и микроорганизмов играет важную роль в нормальном функционировании организма птицы и реализации их генетического потенциала продуктивности.

Особенно четко проявляется роль микрофлоры желудочно-кишечного тракта в питании птицы (синтез аминокислот, витаминов, ферментов и других биологически активных веществ). Одним из наиболее плодотворных путей использования полезных форм микроорганизмов в птицеводстве являются пробиотики. По эффективности применения пробиотики не уступают антибиотикам (кормового и ветеринарного назначения), но одновременно не оказывают побочного действия на организм птицы и микрофлору кишечника, т.е. являются экологически чистыми. Их использование позволяет получить продукцию птицеводства, не содержащую остатков химиотерапевтического действия и антибиотических препаратов.

При интенсивном ведении птицеводства в условиях промышленной технологии содержания птицы биологически полноценное кормление является решающим фактором получения высокой продуктивности.

При этом предусматривается обеспечение птицы не только качественными белковыми и энергетическими компонентами, но и лимитирующими аминокислотами и другими жизненно необходимыми веществами.

Известно, что недостаток лимитирующих аминокислот нельзя восполнить за счет кормов животного происхождения, доля которых в комбикормах для птицы к тому же снижается, а цена на них растет. Для повышения полноценности растительных комбикормов широко используют добавки синтетических аминокислот.

Среди незаменимых аминокислот лизин занимает особое место. Он входит в состав структурных тканевых белков и белковых ферментов, способствует улучшению пищеварения, играет важную роль в формировании костяка, повышении продуктивности, оказывает благотворное влияние на воспроизводительные функции птицы.

В настоящее время во многих странах при кормлении продуктивных животных и птицы используют кормовые добавки бактерий, продуцирующих аминокислоты, в т.ч. лизин. Препараты - продуценты этой аминокислоты в зависимости от технологии производства существенно отличаются между собой, прежде всего, по концентрации действующего вещества. Это обстоятельство становится главной причиной разработки технологии производства таких препаратов, которые, будучи введенными в желудочно-кишечный тракт животных и птицы, продуцируют одну из незаменимых аминокислот - лизин.

Симбиотики - продукты биотехнологического производства, содержащие живые микроорганизмы, продуцирующие в желудочно-кишечном тракте животных и птиц аминокислоты (в том числе незаменимые), ферменты, витамины и таким образом способствующие повышению продуктивности.

Лиофильно высушенная баккультура Е.coil представляет собой симбиотический препарат, а та же баккультура, нанесенная на носители (цеолит, глауконит и другие) и высушенная конвекционным способом, представляет кормовую добавку. Симбиотический препарат применяется методом выпаивания, а не добавлением к корму.

Известны способы культивирования бактерий рода Escherichia, которые проводятся на плотных (1) и жидких (2) питательных средах. Однако способ культивирования эшерихий на плотных питательных средах является не технологичным и малопродуктивным - культуру эшерихий выращивают в течение 24 часов в чашках Петри на твердой питательной среде. Культивирование в жидких питательных средах проводится без регулирования основных технологических параметров - окислительно-восстановительного потенциала, количества растворенного в культуральной жидкости кислорода и длительностью в течение 24-48 часов, в силу чего эти способы не пригодны для промышленного получения препарата.

Известен также способ получения кормовой добавки, содержащей культуру штамма Escherichia coli - продуцент лизина (3). Однако и в данном случае выращивание эшерихий проводится в неуправляемом режиме - без регулирования окислительно-восстановительного потенциала, количества растворенного в культуральной жидкости кислорода, рН, в течение 6-12 ч, что не позволяет получить стабильную по биологическим свойствам культуру.

Целью заявляемого изобретения является сокращение времени выращивания культуры, снижение себестоимости препарата, а также повышение качества и стабильности получения симбиотического препарата на основе Escherichia coli VL-613.

Эта цель достигается за счет того, что периодическое глубинное культивирование Escherichia coli VL-613 проводят в питательной среде в течение 4-7 часов в соответствии с разработанным алгоритмом управления процессом, концентрируют полученную культуру, бактериальную массу ресуспендируют в защитной среде и лиофильно высушивают для длительного сохранения биологических свойств симбиотического препарата.

Способ осуществляют следующим образом.

В стерильный ферментер, который снабжен системой автоматического контроля и регулирования основных технологических параметров (температура, обороты мешалки, рН, pО₂, eH), загружают жидкую питательную среду - бульон Хоттингера (приготовленный на основе перевара Хоттингера с содержанием 600-800 мг% аминного азота), приготовленную по следующей прописи, масс.%:

Перевар Хоттингера 18,0-22,0 Пептон 0,8-1,2 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,7-0,9 Хлористый натрий 0,7-0,9 Глюкоза 0,15-0,25 Дрожжевой экстрат 0,4-0,6 Вода дистиллированная До 100,0

Готовая стерильная питательная среда должна содержать 160-180 мг% аминного азота и иметь рН 7,4-7,6 ед. рН.

В ферментер с питательной средой инокулируют 18-24-часовую матриксную культуру эшерихий (Escherichia coli шт. VL-613), выращенную в жидкой питательной среде по составу аналогичному со средой культивирования, в соотношении 5-10% от объема питательной среды в ферментере, и культивируют при (37±1)°С в течение 4-7 часов.

После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал (eH) культуральной жидкости снижают до (-100)-(-80) мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до окончания процесса культивирования с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скоростью вращения мешалки поддерживают парциональное давление растворенного кислорода (рО₂) в культуральной жидкости на уровне (20±5)% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне (7,2-7,4) ед.рН подачей 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации (0,1-0,2) % при лимитировании роста эшерихий глюкозой, характеризующемся резким повышением рО₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.

Общая концентрация эшерихий по окончанию культивирования составляет (16-30) млрд. м.к./см³.

Полученную бактериальную культуру концентрируют, осадок смешивают с защитной средой высушивания. После тщательного перемешивания смешанную с защитной средой высушивания бактериальную суспензию расфасовывают с соблюдением условий асептики в стерильные флаконы и проводят ее лиофилизацию.

С одного культивирования в ферментере объемом 10 л получается симбиотического препарата для выпаивания 45000 голов бройлеров.

Пример 1.

Способ получения препарата с минимальными значениями параметров

еН Культуральной жидкости снижают до - 100 мВ; рО₂ поддерживают на уровне 15%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,2 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,1%.

Культивирование - в течение 4-х часов.

Накопление - 16,0 млрд. м.к./см³.

Пример 2.

Способ получения препарата с оптимальными значениями параметров

еН Культуральной жидкости снижают до - 90 мВ; рО₂ поддерживают на уровне 20%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,3 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,15%.

Культивирование - в течение 5-х часов.

Накопление - 23,0 млрд. м.к./см³.

Пример 3.

Способ получения препарата с максимальными значениями параметров

еН Культуральной жидкости снижают до - 80 мВ; рО₂ поддерживают на уровне 25%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,4 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,2%.

Культивирование - в течение 6-ти часов.

Накопление - 30,0 млрд. м.к./см³.

Пример 4.

Способ получения препарата со значениями параметров ниже минимальных

еН Культуральной жидкости снижают до - 110 мВ; рО₂ поддерживают на уровне 10%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,1 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,05%.

Культивирование - в течение 3-х часов.

Накопление - 9,0 млрд. м.к./см³.

Пример 5.

Способ получения препарата со значениями параметров выше максимальных

еН Культуральной жидкости снижают до - 70 мВ; рО₂ поддерживают на уровне 30%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,5 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,25%.

Культивирование - в течение 7-ми часов.

Накопление - 37,0 млрд. м.к./см³.

Технологические параметры изготовления симбиотического препарата из штамма Escherichia coli VL-613, указанные в примерах, приведены в таблице 1.

Таблица 1 Значения технологических параметров периодического культивирования эшерихий Время культивирования, час еН, мВ рН, ед. рO₂, % Количество глюкозы, % Накопление, млрд/см³ Минимальные значения параметров 3 -100 7,2 15 0,1 16,0 Оптимальные значения параметров 4 -90 7,3 20 0,15 23,0 Максимальные значения параметров 5 -80 7,4 25 0,2 30,0 Значения параметров ниже минимальных 6 -110 7,1 10 0,05 9,0 Значения параметров выше максимальных 7 -70 7,5 30 0,25 37,0

Препарат, приготовленный по примерам 1-3, после сублимационного высушивания содержит 80-85% жизнеспособных клеток и соответствует требованиям технических условий, тогда как препарат, приготовленный по примерам 4 и 5, содержит 25-30% жизнеспособных клеток и является малопригодным для применения.

При выращивании бройлеров на полноценных рационах, в которых синтетический лизин (моногидрохлорид лизина) заменяли симбиотическим препаратом из штамма Escherichia coli VL 613, отмечено повышение продуктивности цыплят за счет улучшения перевариваемости и использования питательных веществ корма.

Для определения эффективности замены кристаллического лизина (моногидрохлорид лизина) продуцентом лизина на основе штамма Escherichia coli VL613 в экспериментальном хозяйстве ВНИТИП проведен опыт на цыплятах-бройлерах кросса «Кобб-500» с 7-суточного до 5-недельного возраста по схеме, представленной в таблице 2.

Первые семь дней цыплята всех групп получали одинаковый гранулированный комбикорм с питательностью согласно нормам по кроссу «Кобб-500», в дальнейшем использовали рассыпной комбикорм согласно схеме опыта.

Таблица 2 Схема опыта Группы Количество голов Характеристика кормления Контроль 35 Основной рацион с добавлением синтетического лизина (моногидрохлорид лизина) Опытная 35 Основной рацион - без добавления синтетического лизина, но с добавлением симбиотического препарата

Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3 Показатели Группы Контроль Опытная 1 2 3 Живая масса, г суточного цыпленка 50 50 Живая масса по группе, г 194,1+43,54 204,06±4,02 в 7 дней 380,5±7,99 403,86±7,03 в 14 дней 754,00±17,63 813,86±17,78 в 21 день 1312,29±28,80 1454,00±29,10 в 28 дней 2092,70±45,84 2212,66±43,80 в 38 дней 2107,00±46,17 2483,6±44,79 Живая масса в 38 дней, в том числе     петушков 2024,30±66,19 2299,75±53,19 курочек 1786,28±52,90 2067,50±56,65 Сохранность поголовья, % 100 100 Расход корма на 1 гол., кг 3,59 3,48 Затраты корма на 1 кг прироста, кг 1,74 1,61 Среднесуточный прирост живой массы, г 54,1 59,1

Как видно из таблицы 3, живая масса опытных бройлеров превышала контроль. При этом она была достоверно выше контроля за весь цикл выращивания бройлеров. Исследуемый препарат позволяет обеспечить синтез лизина в организме цыплят в наиболее ответственный период жизни, когда пищеварительная система отличается наибольшей уязвимостью и незрелостью. Использование препарата не повлияло отрицательно на сохранность бройлеров и конверсию корма.

Таким образом, использование симбиотического препарата на основе Escherichia coli VL-613 при выпаивании бройлерам высокопродуктивных кроссов позволяет полностью заменить синтетический лизин (моногидрохлорид лизина).

Источники информации

1. Патент РФ №2175351, С12Р 13/04, C12N 1/20, C12N 15/31, C12N 1/20, C12R 1/185, 27.01.2001.

2. Патент РФ №2189253, А61К 39/108, 09.04.2001.

3. Патент РФ №2347807, C12N 1/20, А33К 1/14, C12R 1/185, 27.02.2009.

Способ получения симбиотического препарата на основе Escherichia coli VL-613 предусматривает засев, культивирование бактерий в жидкой питательной среде на основе перевара Хоттингера, концентрирование бактериальной суспензии с последующим смешиванием со стабилизатором, расфасовку и лиофилизацию препарата. При этом в процессе культивирования Escherichia coli VL-613 сразу после засева окислительно-восстановительный потенциал бактериальной культуры снижают до минус (80-100) мВ. До окончания процесса культивирования рО₂ поддерживают на уровне 20±5% от насыщения кислородом воздуха, рН регулируют на уровне 7,0-7,4. Дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,1-0,2% при лимитировании роста Escherichia coli VL-613 глюкозой. Длительность процесса культивирования при этом составляет 4-6 ч. Изобретение обеспечивает повышение качества и стабильности симбиотического препарата на основе Escherichia coli VL-613. Препарат содержит 80-85% жизнеспособных клеток и позволяет полностью заменить синтетический лизин в полноценных рационах при выращивании бройлеров. 3 табл., 5 пр.

Способ получения симбиотического препарата из Escherichia coli VL-613, включающий засев, культивирование в жидкой питательной среде на основе перевара Хоттингера, концентрирование бактериальной суспензии с последующим смешиванием со стабилизатором, расфасовку и лиофилизацию препарата; при этом в процессе культивирования Escherichia coli VL-613 сразу после засева окислительно-восстановительный потенциал бактериальной культуры снижают до минус (80-100) мВ, после чего до окончания процесса культивирования рО₂ поддерживают на уровне (20±5) % от насыщения кислородом воздуха, рН регулируют на уровне (7,0-7,4), а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации (0,1-0,2) % при лимитировании роста Escherichia coli VL-613 глюкозой, длительность процесса культивирования составляет 4-6 ч.