ЗАЩИТНАЯ СРЕДА ВЫСУШИВАНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СИМБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии и зоотехнике и может быть использовано при промышленном производстве симбиотического препарата на основе штамма Escherichia coli VL-613.

В настоящее время техническая микробиология является активно развивающимся научным направлением, использующим биотехнологические процессы при разработке и производстве широкого спектра биопрепаратов (вакцин, сывороток, диагностикумов, пробиотиков), биологически активных веществ (ферментов, антибиотиков, пребиотиков и др.), добавок к кормам (белков и аминокислот). Их применение в животноводстве и птицеводстве способствует повышению продуктивности животных и птицы, обеспечению ветеринарного благополучия хозяйств, гарантии качества, биологической и экологической безопасности как самой продукции, так и процесса ее производства.

В настоящее время активно развивается использование симбиотиков не только как антагонистов патогенной микрофлоры, но и как продуцента лизина - незаменимой аминокислоты, которая входит в состав структурных тканевых белков и белковых ферментов, является важным фактором биологически полноценного кормления, способствует улучшению пищеварения, играет важную роль в формировании костяка, повышении продуктивности сельскохозяйственных моногастричных животных (птицы и свиней). Такие симбиотики используются в качестве альтернативы дорогостоящему синтетическому лизину (моногидрохлорид лизина), в основном, импортного производства. Поэтому разработка новых препаратов такой группы и технологии их производства является актуальной проблемой.

Симбиотики - продукты биотехнологического производства, содержащие живые микроорганизмы, продуцирующие в желудочно-кишечном тракте животных и птиц аминокислоты (в том числе незаменимые), ферменты, витамины и таким образом способствующие повышению продуктивности.

Известен способ получения симбиотического препарата на основе Escherichia coli VL-613 (патент РФ №2450051 от 18.08.2010 г.), включающий засев штамма Escherichia coli VL-613, культивирование в жидкой питательной среде на основе перевара Хоттингера, концентрирование бактериальной суспензии с последующим смешиванием со стабилизатором, расфасовку и лиофилизацию препарата.

В качестве ближайшего аналога (прототипа) выбрана технология получения симбиотического препарата «Пролизэр» на основе штамма Escherichia coli VL-613, при которой среда высушивания готовится по следующей прописи: концентрация основных компонентов имеет следующие значения: желатин - 2,0%; сахароза - 10,0%. В качестве растворителя - калий фосфатный буфер (Павленко И.В., Самуйленко А.Я., Еремец В.И. и др. Разработка технологии производства симбиотического препарата Пролизэр на основе Escherichia coli VL-613. Часть 2. Оптимизация условий сохранения жизнеспособности Escherichia coli VL-613 в симбиотическом препарате Пролизэр // Вестник Казанского технологического университета Т.16, - №9, - 2013, - стр. 176-181.)

Однако в данном случае защитная среда высушивания не оптимальна по своему составу, что не позволяет получить стабильную по биологическим свойствам культуру, и срок хранения препарата «Пролизэр» составляет 9 месяцев.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является разработка защитной среды, оптимизированной для процесса сублимационного высушивания и длительного хранения, при получении симбиотического препарата на основе штамма Е. coli VL-613, что позволит получить более стабильный по биологическим свойствам препарат и увеличить срок его хранения.

Техническим результатом изобретения является снижение потерь концентрации жизнеспособных эшерихий при сублимационном высушивании и повышение длительности сохранения биологических свойств симбиотического препарата до 12 месяцев.

Указанная задача решается тем, что после культивирования штамма Escherichia coli VL-613 в жидкой питательной среде на основе перевара Хоттингера, концентрирования бактериальной суспензии, ее смешивают с защитной средой высушивания, состоящей из желатина - 1,5%; сахарозы - 10,0%; хитозана пищевого - 2%, в качестве растворителя - калий фосфатный буфер до 100%, с последующей расфасовкой и лиофилизацией препарата.

Эффективность технологии получения симбиотических препаратов зависит не только от состава питательной среды, режима культивирования, но и от соотношения концентраций компонентов защитной среды высушивания.

Известно, что повышению стабильности препаратов в процессе сушки и в процессе хранения способствуют различные соединения: это природные и синтетические высокомолекулярные соединения - полисахариды (декстран, декстрин, агароза), соли альгиновой кислоты, желатин и поливинилпирролидон. Они создают защитные барьеры для клеток в процессе сушки, после высушивания. В высоких концентрациях (исключая полисахариды) они ухудшают условия удаления влаги при высушивании. Тиомочевина и натриевые соли глутаминовой, лимонной и аскорбиновой кислот, легко окисляясь, блокируют свободнорадикальные и аммоно-карбонильные реакции в сухой биомассе.

Хитин и хитозан являются природными полимерами, относящиеся к природным полисахаридам.

Способ получения симбиотического препарата осуществляют следующим образом.

На основе полученного нами патента РФ №2450051, который является оптимальным по питательной среде и процессу культивирования, была получена бактериальная культура Escherichia coli шт. VL-613 с общей концентрацией по окончанию культивирования 16-30 млрд. м.к./см³.

Для этого в стерильный ферментер, который снабжен системой автоматического контроля и регулирования основных технологических параметров (температура, обороты мешалки, pH, рО₂, еН), загружают жидкую питательную среду - бульон Хоттингера (приготовленный на основе перевара Хоттингера с содержанием 600-800 мг% аминного азота), приготовленную по следующей прописи, масс. %:

Перевар Хоттингера 8,0-22,0 Пептон 0,8-1,2 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,7-0,9 Хлористый натрий 0,7-0,9 Глюкоза 0,15-0,25 Дрожжевой экстрат 0,4-0,6 Вода дистиллированная до 100,0

Готовая стерильная питательная среда должна содержать 160-180 мг% аминного азота и иметь pH 7,4-7,6 ед. pH.

В ферментер с питательной средой инокулируют 18-24-часовую матриксную культуру эшерихий (Escherichia coli шт. VL-613), выращенную в жидкой питательной среде по составу, аналогичному со средой культивирования, в соотношении 5-10% от объема питательной среды в ферментере, и культивируют при (37±1)°C в течение 4-7 часов. Общая концентрация эшерихий по окончанию культивирования составляет 16-30 млрд. м.к./см³.

Полученную бактериальную культуру концентрируют, осадок бакмассы после концентрирования смешивают с защитной средой высушивания. После тщательного перемешивания бактериальной суспензии до концентрации 10-14 млрд./см Е. coli в жидком препарате ее расфасовывают по 2 или 4 см с соблюдением условий асептики в стерильные флаконы объемом 10 или 20 см и проводят сублимационное высушивание.

Результаты испытания защитной среды высушивания с разными концентрациями компонентов представлены в табл. 1.

Анализируя полученные данные по оптимизации состава ЗС для процесса сушки эшерихий, можем считать опыт №7 (табл. 1) - лучшим.

Защитная среда высушивания готовится по следующей прописи: желатин - 1,5%; сахароза - 10,0%; хитозан пищевой - 2%. В качестве растворителя - калий фосфатный буфер до 100%.

Количество жизнеспособных (ж/с) эшерихий в процессе длительного хранения определяли через 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения (табл. 2).

Пример 1. Контроль (защитная среда - прототип)

Контрольная среда высушивания готовится по следующей прописи: концентрация основных компонентов имеет следующие значения: желатин - 2,0%; сахароза - 10,0%. В качестве растворителя - калий фосфатный буфер до 100%.

Концентрация жизнеспособных клеток эшерихий перед сушкой 12,83 млрд/см³.

Пример 2. Разработанная защитная среда

Защитная среда высушивания готовится по следующей прописи: концентрация основных компонентов имеет следующие значения: желатин - 1,5%; сахароза - 10,0%; хитозан пищевой - 2%. В качестве растворителя - калий фосфатный буфер до 100%.

Концентрация жизнеспособных клеток эшерихий перед сушкой 12,4 млрд/см³.

В таблице 3 представлены данные по сохраняемости ж/с эшерихий на защитных средах высушивания: в прототипе (1), в предлагаемой среде (2) в процессе длительного хранения - с 1 по 12 месяц хранения.

Из данных таблицы 3 можно сделать вывод, что на разработанной защитной среде Е. coli лучше переносят процесс сублимационного высушивания и длительного хранения. При этом срок хранения препарата увеличивается до 12 месяцев, а сохраняемость жизнеспособных клеток выше на 15,34%, чем у прототипа.

На рисунке 1 показана зависимость выживаемости Е. coli в процессе длительного хранения препарата (срок наблюдения 12 месяцев).

Преимущества защитной среды высушивания для получения симбиотического препарата по разработанной технологи:

1. Использование оптимизированной защитной среды высушивания позволяет повысить выживаемость Е. coli штамма VL-613 в процессе сублимационного высушивания и длительного хранения препарата на 15-17% по сравнению с прототипом.

2. Срок хранения симбиотического препарата Escherichia, coli штамма VL-613 составляет 12 месяцев.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве симбиотических препаратов. Защитная среда высушивания для получения симбиотического препарата содержит желатин, сахарозу, пищевой хитозан и калий фосфатный буфер в заданных соотношениях. Изобретение позволяет снизить потерю концентраций жизнеспособных Escherichia coli при сублимационном высушивании и повысить длительность сохранения биологических свойств симбиотического препарата до 12 месяцев. 1 ил., 3 табл., 2 пр.

Защитная среда высушивания для получения симбиотического препарата на основе штамма Escherichia coli VL-613, содержащая желатин, сахарозу, калий фосфатный буфер, отличающаяся тем, что дополнительно содержит хитозан при следующем содержании компонентов, %:
желатин 1,5 сахароза 10 пищевой хитозан 2 калий фосфатный буфер до 100