ПЕПТИДОПОДОБНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/13 A61K31/19 A61K33/08 A61K33/10 A61P31/12 C07K1/06 

Описание патента на изобретение RU2450806C2

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к расширению спектра противовирусных препаратов для нужд ветеринарии. Изобретение относится также к области получения этого вещества.

В настоящее время известен ряд противовирусных препаратов пептидной природы для лечения вирусных инфекций человека и животных. Примерами таких препаратов могут служить смесь димеров рибонуклеазы А и лизоцина (См. патент РФ №2092183 от 10.10.1997, МПК А61К 38/57, А61К 9/02, А61К 9/09) или коммерческий препарат Аллокин-альфа - противовирусный препарат, созданный на основе биологически активных пептидов, выделенных из иммунной системы личинок падальных мух семейства Каллифорид. Главное составляющее вещество препарата - цитокиноподобный пептид аллоферон противовирусного и противоопухолевого свойства, усиливающий цитотоксическую активность имеющихся в наличии иммунных клеток человека. Несмотря на высокую противовирусную активность данных препаратов, им присущ ряд недостатков. Наиболее существенным из них является высокая стоимость получения. Недостатком этих препаратов также является то, что они легко инактивируются в силу своей белковой природы, поэтому требуют специальных условий хранения и высокой степени очистки; имеют небольшой срок хранения (до 1 года). Все это делает невозможным широкое применение данных препаратов для нужд ветеринарии.

Наиболее близким решением, принятым за прототип к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту, является препарат лигавирин, получаемый путем экстракции слабощелочным раствором растительного сырья (опилки, солома, лузга подсолнуха), подвергнутого предварительно частичной биодеградации и модификации ксилотрофными грибами Pleurotus ostreatus, с последующим кислотным осаждением, промывкой водой и сушкой при комнатной температуре. Лигавирин представляет собой комплексное соединение, состоящее из пептидов в количестве 12-21% (См. патент РФ №2070411 от 20.12.1996, МПК А61К 47/38, А61К 47:36, А61К 38:04, А61К 35:84).

К недостаткам данного препарата можно отнести то, что он не является гомогенным соединением. Способом его получения является микробиологическая переработка растительного сырья, без выделения конкретного вещества. Данный препарат не имеет постоянного состава (содержание пептидов 12-21%) и фиксированных противовирусных свойств.

Технической задачей изобретения является расширение арсенала противовирусных средств.

Сущность изобретения заключается в том, что предложено новое пептидоподобное соединение, обладающее противовирусной активностью и отвечающее составу C32H46F12N8O10.

Сущность изобретения заключается также в том, что предложен способ получения пептидоподобного соединения, заключающийся в том, что синтез осуществляют при 22°С в течение 24 ч и мольном соотношении следующих компонентов: 1,12-додекандиамин-этилдиизопропиламин-N-гидроксисукцинимидный эфир Nα,Nim-ди-трет-бутилоксикарбонил-L-гистидина 2.3:5.1:5.1 в этилацетате как растворителе, добавляют в реакционную смесь N,N-диметилэтилендиамин (1 моль, 110 мкл) и перемешивают ее в течение 30 мин, затем промывают последовательно 2%-ным раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (20 мл) и водой (20 мл), удаляют растворитель в вакууме, путем растворения остатка в смеси ТФУ:СН2С12=1:1 (5 мл), выдерживают реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре, удаляют защитные группы трифторуксусной кислотой в вакууме и упаривают остаток с этанолом (3×10 мл).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез

К раствору 1,12-додекандиамина (2.3 ммоль, 0.46 г) и этилдиизопропиламина (5.1 ммоль, 0.87 мл) в 10 мл этилацетата добавляли при перемешивании раствор N-гидроксисукцинимидного эфира Nα,Nim-ди-трет-бутилоксикарбонил-L-гистидина (5.1 ммоль, 2.3 г) в 5 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивали 24 ч при 22°С. Затем в реакционную смесь добавляли N,N-диметилэтилендиамин (1 ммоль, 110 мкл) и перемешивали 30 мин. Реакционную смесь промывали последовательно 2%-ным раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (20 мл) и водой (20 мл). Органический слой сушили над безводным Na2SO4. Растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в смеси ТФУ:CH2Cl2=1:1 (5 мл) и выдерживали реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре. Растворитель и ТФУ удаляли в вакууме, остаток упаривали с этанолом (3×10 мл). Выход трифторацетата N,N'-бис-L-гистидил-1,12-додекандиамина 0.81 г, 37.7%.

Данные 1Н ЯМР-спектра для трифторацетата N,N'-бис-L-гистидил-1,12-додекандиамина (D2O) δ, м.д. (J/Гц): 1.61 (м, 4Н, -О-CH2(CH 2)2СН2О-); 1.71 (м, 4Н, -NH-CH2CH2CH 2O-); 2.87-3.12 (м, 4Н, His-CH-CH 2); 3.20 (м, 4Н, -NH-CH 2-); 4.03 (т, 2Н, His-CH, J=7.3); 7.27 (с, 2Н, CHIm); 8.56 (с, 2Н, CHIm). ESI-MS, m/z найдено 475.6 [М+H]+ вычислено 474.64. Элементный анализ. Найдено С 41,01; Н 4,67; F 24,80; N 11,90. C32H46F12N8O10. Вычислено С 41,29; Н 4,98; F 25,49; N 12,04.

Исходя из метода синтеза, данных элементного анализа, 1Н ЯМР и ESI - мас-спектроскопии полученному соединению была приписана структурная формула:

Полученному пептидоподобному соединению присвоено рабочее название ринумид.

Пример 2. Определение влияния условий и сроков хранения ринумида на стабильность его химического состава.

Ринумид хранили в условиях бытового холодильника при -4±2°С и при комнатной температуре 20±2°С в течение двух лет (срок наблюдения). Проводили элементный анализ препарата с периодичностью один раз в три месяца. В результате проведенных исследований не было отмечено отклонений в его составе.

Таким образом, полученный препарат стабилен (срок наблюдения 2 года), не требует особых условий хранения.

Пример 3. Оценка цитотоксичности ринумида

Цитотоксичность ринумида оценивали путем добавления его разведений в среде Игла MEM к выращенному монослою перевиваемой клеточной культуры КСТ (коронарные сосуды теленка) в лунки 96-луночного планшета (Costar), до конечных концентраций 39,06-5000,0 мкг/мл (по четыре лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в СО2-инкубаторе в течение 3 суток.

Токсичность препаратов оценивали по четырехкрестовой системе, анализируя морфологию клеток и целостность монослоя при микроскопировании в инвертированном микроскопе.

Таблица 1 Доза препарата Цитотоксическое действие (ЦТД) 5 мг/мл ++++ 2,5 мг/мл ++++ 1,25 мг/мл ++++ 625,0 мкг/мл ++++ 312,5мкг/мл -+-+ 156,25 мкг/мл ---- 78,125 мкг/мл ---- 39,06 мкг/мл ----

Из данных таблицы 1 видно, что минимальная нетоксичная доза ринумида для культуры клеток КСТ составляет 156,25 мкг/мл.

Учитывая результаты определения нетоксичной дозы, рассчитали максимально переносимую концентрацию (МПК) препарата для культуры клеток КСТ, которая составила 78,125 мкг/мл. За МПК принимали 1/2 дозы, при которой отсутствовало цитопатическое действие вещества.

Пример 4. Оценка противовирусной активности ринумида в отношении вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) в условиях in vitro в культуре клеток.

Для оценки противовирусного действия препарата ринумида культуру клеток КСТ заражали вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (штамм «ВК-1») в дозе не менее 1-10 ТЦД/кл. Через 1,5 часа после заражения в лунки с культурой клеток вносили ринумид в дозе 78,0±1,0 мкг/мл (опыт) или разводящую питательную среду (контроль). Культивировали при 37°С в течение 72 часов, после чего вируссодержащую суспензию титровали для определения инфекционной активности вируса ВД-БС КРС.

Противовирусный эффект препарата рассчитывали по разнице инфекционных активностей вируса в контрольных и опытных образцах (Вирусология. Методы, под ред. Б.Мейхи, М.: «Мир», 1988) и выражали в lg снижения титров вируса (Н.Д.Львов и соавт., Вопросы вирусологии, 1986, №2). В каждом опыте проводили дополнительный контроль на токсичность испытуемой дозы препарата.

Определение инфекционного титра вируса ВД-БС КРС проводили микрометодом (Вирусология. Методы, под ред. Б.Мейхи, М.: «Мир», 1988) в 96-луночных культуральных планшетах с культурой клеток КСТ с использованием не менее 4 параллельных рядов. Инфекционный титр вируса выражали в ТЦД50/0,1 мл (50%-ная тканевая цитопатическая доза).

Разница титра вируса в опытных и контрольных образцах более чем в 21g ТЦД50/мл свидетельствует о противовирусной активности ринумида.

В таблице 2 представлены показатели снижения инфекционной активности вируса (выраженной в lg) в контроле, где вирус репродуцировался без препарата, и в опыте, где репродукция осуществлялась в присутствии препаратов.

Таблица 2 Титр вируса (lg ТЦД50/мл)
контроль
Титр вируса (lg ТЦД50/мл)
опыт
4,83±0,07 2,75±0,12

Из данных таблицы 2 видно, что ринумид в значительной степени (на 2,08 lg ТЦД50/мл) подавляет инфекционную активность вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Снижение титра вируса было достоверным (более 2 lg ТЦД50/мл) при внесении препарата через 1,5 часа после заражения культуры клеток.

Пример 5. Оценка противовирусной активности ринумида, после его хранения

Ринумид хранили в течение двух лет в условиях бытового холодильника при -4±2°С и при комнатной температуре +20±2°С в течение двух лет (срок наблюдения). С периодичностью один раз в шесть месяцев проводили оценку его противовирусной активности в отношении вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.

В результате проведенных исследований ринумид показал противовирусную активность в отношении тестируемого вируса на протяжении всего срока наблюдения, вызывая снижение его активности на 2,0-2,25 lg ТЦД50/МЛ.

Таблица 3 Срок хранения, мес. Титр вируса (lg ТЦД50/мл) контроль Титр вируса (lg ТЦД50/мл) опыт При -4±2°С При +20±2°С 6 5,08±0,14 2,92±0,07 2,83±0,07 12 5,67±0,07 3,67±0,07 3,58±0,07 18 5,5±0,12 3,5±0,12 3,42±0,07 24 5,58±0,07 3,58±0,07 3,5±0,12

Установлено, что полученное соединение обладает противовирусной активностью, которая сохраняется на протяжении двух лет (срок наблюдения) при режиме его хранения -4±2°С и +20±2°С.

Таким образом, заявляемое пептидоподобное соединение позволяет достоверно снижать репродукцию вируса ВД-БС КРС в чувствительной культуре клеток, т.е. обладает противовирусной активностью.

Полученное пептидоподобное соединение имеет стабильный химический состав, сохраняет противовирусную активность на протяжении двух лет (срок наблюдения) при режиме его хранения -4±2°С и +20±2°С.

Ринумид может использоваться в ветеринарной практике при разработке методов профилактики и лечения инфекций крупного рогатого скота, вызванных вирусами семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, в частности вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.

Похожие патенты RU2450806C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК 2004
  • Глотов Александр Гаврилович
  • Глотова Татьяна Ивановна
RU2294742C2
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2010
  • Сильников Владимир Николаевич
  • Буракова Екатерина Анатольевна
  • Глотова Татьяна Ивановна
  • Глотов Александр Гаврилович
  • Репин Владимир Евгеньевич
RU2443705C1
СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК 2005
  • Глотов Александр Гаврилович
  • Глотова Татьяна Ивановна
RU2300375C2
ВОДОРАСТВОРИМОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, НА ОСНОВЕ СОЕДИНЕНИЯ СЕРЕБРА С ЦИСТИНОМ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2005
  • Третьяков Василий Васильевич
  • Сильников Владимир Николаевич
  • Власов Валентин Викторович
  • Рихтер Владимир Александрович
  • Третьякова Ольга Владимировна
  • Курбатов Анатолий Васильевич
  • Обухов Александр Васильевич
  • Жевачевский Николай Герасимович
  • Донченко Александр Семенович
  • Тихонов Валерий Лаврентьевич
  • Тихонова Наталья Владимировна
  • Шкиль Николай Алексеевич
  • Глотов Александр Гаврилович
  • Глотова Татьяна Ивановна
  • Храмцов Виктор Викторович
RU2277908C1
ЦИТОПАТОГЕННЫЙ ШТАММ ВИРУСА BOVINE VIRAL DIARRHEA - MUCOSAL DISEASE VIRUS ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ КЛИНИКИ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА У ТЕЛЯТ 2006
  • Глотов Александр Гаврилович
  • Глотова Татьяна Ивановна
RU2315100C2
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ РЕСПИРАТОРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ТЕЛЯТ ПРИ ПОМОЩИ КОМПЛЕКСНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНОГО ПРЕПАРАТА ЙОДАНТИПИРИН И МИНЕРАЛЬНОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ВИТАРТИЛ 2014
  • Глотова Татьяна Ивановна
  • Глотов Александр Гаврилович
  • Семенова Ольга Владимировна
  • Самородова Инна Моисеевна
RU2540436C1
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА У ТЕЛЯТ ПРИ ПОМОЩИ ПРОТИВОВИРУСНОГО ПРЕПАРАТА ЙОДАНТИПИРИН 2006
  • Глотов Александр Гаврилович
  • Глотова Татьяна Ивановна
  • Нефедченко Алексей Васильевич
RU2320324C1
ЛИНИЯ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК ФИБРОБЛАСТОВ ЛЕГКОГО ЭМБРИОНА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ И ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ 2006
  • Сухобаевская Лариса Петровна
  • Литвинчук Людмила Филипповна
  • Лаврентьева Ирина Николаевна
RU2343194C2
ВАКЦИНА ПРОТИВ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЭМУЛЬСИОННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ 2007
  • Мищенко Владимир Александрович
  • Думова Виктория Валентиновна
  • Лисицын Вячеслав Викторович
  • Павлов Дмитрий Константинович
  • Никешина Татьяна Борисовна
  • Кононов Александр Владимирович
  • Костыркин Юрий Алексеевич
  • Гришина Елена Сергеевна
RU2342157C1
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2000
  • Глотов А.Г.
  • Юшков Ю.Г.
RU2196574C2

Реферат патента 2012 года ПЕПТИДОПОДОБНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Заявленная группа изобретений относится к ветеринарной вирусологии и касается пептидоподобного соединения, обладающего противовирусными свойствами, а также способа его получения. Для этого осуществляют синтез при 22°С в течение 24 ч и мольном соотношении следующих компонентов: 1,12-додекандиамин-этилдиизопропиламин-N-гидроксисукцинимидный эфир Nα,Nim-ди-трет-бутилоксикарбонил-L-гистидина 2.3:5.1:5.1 в этилацетате как растворителе, добавляют в реакционную смесь N,N-диметилэтилендиамин (1 моль, 110 мкл) и перемешивают ее в течение 30 мин, затем промывают последовательно 2%-ным раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (20 мл) и водой (20 мл), удаляют растворитель в вакууме, путем растворения остатка в смеси ТФУ:СН2Сl2=1:1 (5 мл), выдерживают реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре, удаляют защитные группы трифторуксусной кислотой в вакууме и упаривают остаток с этанолом (3×10 мл). Заявленное пептидоподобное соединение позволяет расширить арсенал противовирусных средств для лечения и профилактики вирусных заболеваний крупного рогатого скота при достоверном снижениии репродукции вируса за счет стабильности химического состава и сохранении противовирусной активности в течение 2-х лет. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 5 пр.

Формула изобретения RU 2 450 806 C2

1. Способ получения пептидоподобного соединения, обладающего противовирусной активностью, заключающийся в том, что синтез осуществляют при 22°С в течение 24 ч и мольном соотношении следующих компонентов: 1,12-додекандиамин-этилдиизопропиламин-N-гидроксисукцинимидный эфир Nα,Nim-ди-трет-бутилоксикарбонил-L-гистидина 2.3:5.1:5.1 в этилацетате как растворителе, добавляют в реакционную смесь N,N-диметилэтилендиамин (1 моль, 110 мкл) и перемешивают ее в течение 30 мин, затем промывают последовательно 2%-ным раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (20 мл) и водой (20 мл), удаляют растворитель в вакууме, путем растворения остатка в смеси ТФУ:СН2Сl2=1:1 (5 мл), выдерживают реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре, удаляют защитные группы трифторуксусной кислотой в вакууме и упаривают остаток с этанолом (3·10 мл).

2. Соединение, обладающее противовирусной активностью, полученное способом по п.1 и отвечающее составу C32H46F12N8O10.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2012 года RU2450806C2

ВОДОРАСТВОРИМОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, НА ОСНОВЕ СОЕДИНЕНИЯ СЕРЕБРА С ЦИСТИНОМ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2005
  • Третьяков Василий Васильевич
  • Сильников Владимир Николаевич
  • Власов Валентин Викторович
  • Рихтер Владимир Александрович
  • Третьякова Ольга Владимировна
  • Курбатов Анатолий Васильевич
  • Обухов Александр Васильевич
  • Жевачевский Николай Герасимович
  • Донченко Александр Семенович
  • Тихонов Валерий Лаврентьевич
  • Тихонова Наталья Владимировна
  • Шкиль Николай Алексеевич
  • Глотов Александр Гаврилович
  • Глотова Татьяна Ивановна
  • Храмцов Виктор Викторович
RU2277908C1
СПОСОБ АВТОМАТИЧЕСКОГО УПРАВЛЕНИЯ ПРОЦЕССОМ РЕГЕНЕРАЦИИ УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ НА УСТАНОВКЕ ПЕРИОДИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ 1992
  • Сахненко В.И.
  • Скориченко Н.А.
  • Астратьев А.А.
  • Павлов Ю.В.
  • Кашмет В.В.
  • Крылов В.Н.
  • Рябоконь В.Н.
  • Шевляков В.С.
  • Почекуев А.Ю.
  • Яковлев П.С.
  • Булыгин П.Н.
RU2074011C1
СТЕНА ДОМА 1997
  • Вардапетов Э.А.
  • Козлов К.В.
  • Ратушный С.Г.
RU2168592C2

RU 2 450 806 C2

Авторы

Глотова Татьяна Ивановна

Глотов Александр Гаврилович

Кунгурцева Ольга Владимировна

Сильников Владимир Николаевич

Королева Людмила Сергеевна

Тихонов Валерий Лаврентьевич

Донченко Александр Семенович

Тихонов Дмитрий Валерьевич

Даты

2012-05-20Публикация

2010-07-05Подача