СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК Российский патент 2007 года по МПК A61K31/41 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к способам подавления репродукции вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота с помощью противовирусного препарата в культуре клеток.

Известен способ подавления инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в условиях in vitro при помощи препарата фоспренил (см. Ожерелков С.В. и др. Препарат фоспренил подавляет размножение вирусов диареи и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в чувствительных культурах клеток//Вопросы вирусологии.- 2001.-№5.- С.43-45).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что препарат фоспренил проявляет свою активность только в дозах 80 и 100 мкг/мл.

Недостатком является также то, что противовирусную активность препарата оценивают путем внесения в монослой культуры клеток легких эмбриона коровы, выращенной в пробирках, препарата в смеси с различными разведениями вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Пробирки с инфицированным монослоем клеток инкубируют при 37°С в течение 5 суток, оценивая противовирусную активность препарата путем титрования вируссодержащей суспензии в опытных и контрольных пробирках.

Недостатком является также то, что данные условия экспериментов не обеспечивают высокой противовирусной эффективности препарата, т.к. он в дозе 100 мкг/мл вызывал снижение титра вируса на 1,75 lg ТЦД_50/мл, 80 мкг/мл - 1,5 lg ТЦД_50/мл по сравнению с контролем.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту, является способ подавления инфекционной активности вируса герпеса простого человека в культуре клеток CV-1 при помощи препарата рибамидил (рибавирин, виразол) (см. Г.Л.Линицкая, Ю.Г.Кройча, Г.А. Галегов. Влияние рибамидила на репродукцию вируса простого герпеса в культуре клеток CV1).

Недостатком является то, что данный способ не использовался ранее для подавления инфекционной активности вируса инфекционного риотрахеита крупного рогатого скота.

К недостаткам его можно отнести так же то, что для изучения противовирусного действия препарата использовали перевиваемую линию клеток почек африканских мартышек (CV1), препарат вводили в состав питательной среды поддержки непосредственно после адсорбции вируса в дозе 62,5 мкг/мл, противовирусный эффект препарата изучали только в отношении вируса герпеса простого человека.

Технической задачей изобретения является, расширение временного интервала эффективного действия препарата в отношении вируса, предотвращение токсического действия препарата на клетки за счет снижения его дозы, обеспечение начала лечения в более ранние сроки.

Сущность изобретения заключается в том, что в известном способе подавления репродукции вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в культуре клеток при помощи противовирусного препарата, согласно изобретению, в качестве противовирусного препарата используется рибавирин.

Сущность изобретения заключается также в том, что в культуру клеток MDBK, выращенную микрометодом в культуральных 96-луночных планшетах, вносят вирус в дозе 1-10 ТЦД_50/кл, инкубируют клетки с вирусом в течение 1,5-2 часов, затем вносят противовирусный препарат рибавирин в нетоксичной дозе 50±1 мкг/мл.

Сущность изобретения заключается также в том, что смесь инкубируют в течение 72 часов при температуре 37±0,2°С в условиях атмосферы 5±0,2% СО₂, по окончании срока инкубации вируссодержащую суспензию титруют для определения противовирусного эффекта препарата.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выращивание перевиваемой линии культуры клеток MDBK микрометодом.

Культуру клеток MDBK, выращенную в пластиковых матрасах емкостью 25 см³, снимают с поверхности матраса при помощи смеси трипсина и версена в соотношении 1:9. Клетки ресуспендируют в питательной среде Игла MEM, содержащей 20 мг/мл канамицина, до концентрации 3,5×10 клеток в 1 мл и добавляют сыворотку крови лошади в объеме 5% к объему суспензии клеток (конечная концентрация 2,5%). В каждую лунку 96-луночного микропланшета (Costar) вносят по 0,1 мл суспензии клеток. Микропланшеты закрывают крышкой и инкубируют в условиях СО₂ инкубатора в течение 2 дней до образования монослоя клеток. Для оценки токсичности противовирусного препарата используют сформированный монослой клеток КСТ, полностью покрывающий площадь лунки микропланшета.

Пример 2. Оценка цитотоксичности препарата рибавирин.

Цитотоксичность препарата оценивают путем добавления его разведений в среде Игла MEM к монослою клеточной культуры MDBK в лунки 96-луночного планшета (Costar), до конечных концентраций 20-1000 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в СО₂-инкубаторе в течение 5 суток. Контролем служат клетки без добавления исследуемого соединения. В монослой культуры клеток вносят исследуемый препарат в концентрации 20-2000 мкг/мл. Инкубацию препарата с клетками проводят в течение 5 суток. По окончании этого срока оценивают жизнеспособность клеток визуально по состоянию монослоя в целом и после окрашивания 1% раствором трипанового синего, приготовленного на фосфатном буфере рН 7,2-7,3. Через 5 минут внесения краски подсчитывают количество живых (неокрашенных) и мертвых (окрашенных в голубой цвет) клеток в камере Горяева и по формуле определяют количество клеток в 1 мл, учитывая кратность разведения клеточной суспензии раствором краски. Токсичность различных доз рибавирина определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным результатам рассчитывают минимальную нетоксичную дозу препарата.

Таблица 1Концентрация препарата, мкг/млЦитотоксическое действие препарата (+;-)Количество жизнеспособных клеток,2000+% 13,451000+19,89500+28,47200+48,35100+76,1550-98,2620-99,120-99,9Примечание: +- наличие цитотоксического действия;
- - отсутствие цитотоксического действия.

Из данных таблицы 1 видно, что минимальная нетоксичная доза рибавирина для культуры клеток MDBK составляет 50 мкг/мл.

Пример 3. Оценка противовирусного действия препарата рибавирин на вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в культуре клеток.

Для оценки противовирусного действия препарата рибавирин культуру клеток MDBK заражают вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (штамм «ТК-А») с инфекционной активностью 5,58±0,12 lg ТЦД_50/мл. Через 1; 1,5; 3; 6; 9 часов после заражения в лунки с культурой клеток вносят рибавирин в дозе 50 мкг/мл. Через 72 часа вируссодержащую жидкость титруют для определения инфекционной активности вируса. Разница титра вируса в опытных и контрольных образцах не менее чем в 2 lg ТЦД₅₀/мл свидетельствует о противовирусной активности рибавирина.

Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2Титр вируса до внесения препарата (lg ТЦД_50/мл)Титр вируса (lg ТЦД _50/мл) после внесения препарата (через час)1,01,53695,58±0,124,67±0,120,5±0,124,67±0,125,58±0,125,58±0,12

Из данных таблицы 2 видно, что рибавирин в значительной степени (на 5,08 lg ТЦД_50/мл) подавляет инфекционную активность вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Снижение титра вируса было достоверным (более 2 lg ТЦД_50/мл) при внесении препарата через 1,5 часа после заражения культуры клеток.

Таким образом, заявляемый способ позволяет достоверно снижать репродукцию вируса ИРТ КРС в чувствительной культуре клеток, что в дальнейшем может использоваться в ветеринарной практике при разработке методов профилактики и лечения инфекций крупного рогатого скота, вызванных вирусами семейства Herpesviridae, в частности вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Противовирусный эффект препарата рибавирин проявляется при условии внесения его в монослой культуры клеток через 1,5 часа после ее контакта с вирусом, опыты проводятся в более чувствительной культуре клеток MDBK, а препарат используется в дозе 50 мкг/мл, что в 1,25 раза ниже и, соответственно, менее токсично. Внедрение технических характеристик заявляемого способа позволит значительно снизить затраты труда на проведение исследований, а также количество используемого препарата.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Способ предусматривает выращивание перевиваемой линии культуры клеток MDBK микрометодом в 96-луночных культуральных планшетах. Затем в культуру клеток вносят вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в дозе 1-10 ТЦД_50/кл и инкубируют клетки с вирусом в течение 1,5-2 часов. Затем вносят противовирусный препарат в нетоксичной дозе 50±1 мкг/мл. Оценку противовирусной активности рибавирина проводят через 72 часа инкубации смеси препарата с вирусом при температуре 37±0,2°С в условиях атмосферы 5±0,2% CO₂. Способ позволяет предотвратить токсическое действие препарата на клетки за счет снижения его дозы, обеспечивает возможность проведения лечения в более ранние сроки. 2 табл.

Способ подавления репродукции вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в культуре клеток, включающий внесение в культуру клеток вируса и противовирусного препарата, отличающийся тем, что в качестве противовирусного препарата используют рибавирин, при этом вирус в культуру клеток вносят в дозе 1-10 ТЦД_50/кл, инкубируют клетки с вирусом в течение 1,5-2 ч, а затем вносят рибавирин в нетоксичной дозе (50±1) мкг/мл, смесь инкубируют в течение 72 ч при температуре (37±0,2)°С в условиях атмосферы (5±0,2)% СО₂, причем в качестве культуры клеток используют культуру клеток MDBK, выращенную микрометодом в 96-луночных культуральных планшетах.