ЛИНИЯ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК ФИБРОБЛАСТОВ ЛЕГКОГО ЭМБРИОНА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ И ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2009 года по МПК C12N5/08 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и может быть использовано для получения диагностических и вакцинных препаратов, тестирования диагностических и противовирусных химиопрепаратов.

Известен штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемый для культивирования вируса (авт. свидетельство SU №1317021, опубликовано в Бюллетене изобретений №22, 1987 г.). Однако данный штамм диплоидных клеток обладает недостаточной чувствительностью к ряду вирусов, а именно к вирусу краснухи, кори и эпидемического паротита, а также не обеспечивает репродукцию рота вируса, вирусов гриппа типа А. Кроме того, коэффициент рассева клеток М-22 составляет 2-3.

Известен также штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека, используемый для культивирования вирусов (авторское свидетельство SU №1349245, 1984 г.). Однако указанный штамм диплоидных клеток не чувствителен к репродукции тогавирусов, а также к ротавирусу.

Изобретение направлено на получение новой диплоидной линии клеток человека, обладающей пролиферативной активностью, превышающей известные аналоги, а также более широким спектром чувствительности к вирусам позвоночных и человека.

Данная линия клеток депонирована в Специализированной коллекции клеточных клеток культур позвоночных Российской коллекции клеточных культур, № депонента №РКК (П) 695Д от 20.10.05 г. и обозначена как «FRL-95/05».

Линию клеток «FRL-95/05» получили из фибробластов легкого 22-недельного нормального эмбриона человека, полученного при операции по социальным показаниям женщины 27 лет (история болезни №1378, больница №19, Санкт-Петербург). В анамнезе родителей донора нет злокачественных и генетических заболеваний. Из легкого удалили трахею, бронхи, крупные кровеносные сосуды. С помощью стерильных глазных ножниц фрагментировали легкие на кусочки 1-1,5 см, которые промывали стерильным фосфатным буферным раствором для удаления элементов крови, после чего помещали в стерильную колбу с магнитом и заливали стерильным раствором смеси протеолитических ферментов, а именно 0,15% раствором трипсина, 0,02%-ного раствора версена и фосфатного буфера, рН 7,2-7,4, в равных объемах.

Трипсинизацию проводили на магнитной мешалке. Через каждые 10-15 минут клеточную взвесь сливали, а оставшуюся ткань заливали новой порцией раствора ферментов. Полученные 6 сливов объединили в общий объем, профильтровали через четырехслойный марлевый фильтр и центрифугировали при 600 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливали, осадок тщательно пипетировали и после подсчета клеток в камере Горяева разводили питательной средой до концентрации 500 тыс. клеток в 1 мл. Полученную взвесь клеток заливали в культуральные матрацы и инкубировали при 37°С в течение 3-4 суток до формирования сплошного монослоя, после чего проводили субкультивирование клеток до формирования линии клеток фибробластов с устойчивыми морфологическими и культуральными свойствами. Все процедуры проводили в асептических условиях для предотвращения контаминации линии клеток. Полученную линию диплоидных клеток фибробластов легкого эмбриона человека, обладающую морфологической и культуральной стабильностью, обозначают как «FRL-95/05». Линия<<FRL-95/05» хранится в Специализированной коллекции клеточных культур позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РКК (П) 695 Д и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки

В фазе становления (1-3 пассажа) культура клеток «FRL-95/05» характеризуется смешанным ростом фибробластоподобных и эпителиодных клеток с разной степенью доминирования. Методами прижизненной светооптической, флуоресцентной и электронной микроскопии показано, что к четвертому-пятому пассажу линия «FRL-95/05» характеризуется ориентированным ростом веретеновидных, фибробластноподобных клеток с прозрачной цитоплазмой и овальным ядром, с мелко-зернистым хроматином и 1-2 ядрышками. Клетки изоморфны, формируют характерный гистотипический рисунок «потоков» и «завитков». Морфологические характеристики стабильны при пассировании клеток весь период активного роста. Появление признаком полиморфизма отмечается с 56 пассажа культуры клеток. Изменения касаются нарушения структуры и рисунка монослоя, формы и размера клеток, ядерно-плазменных соотношений и появления в цитоплазме вакуолей и включений. Появляются полигональные и гипертрофированные клетки.

Электронно-микроскопическое изучение клеток линии «FRL-95/05» на уровне 20 пассажа показывает, что клетки представляют собой фибробластные образования, имеющие характерное для соматических клеток позвоночных субмикроскопическое строение. В клетках хорошо развита сеть эноплазматического ретикулума, состоящего из плоских или расширенных цистерн, усеянных многочисленными рибосомами. Удлиненные, вытянутые вдоль длинной оси клеток ядра содержат одно, реже два ядрышка и диффузный хроматин. Комплекс Гольджи представлен системой плоских цистерн и многочисленными мелкими везикулами. Округлые или овальные митохондрии имеют характерное для этого органоида строение. Матрикс митохондрии более электронноплотный по сравнению с гиалоплазмой. В цитоплазме клеток в умеренных количествах встречаются липидные капли, лизосомо-подобные структуры, равноразмерные вакуоли. Клеточная поверхность относительно ровная, без многочисленных микроворсинок.

Биологические признаки

Линия клеток «FRL-95/05» имеет ограниченный срок жизни, который составляет 75±5 пассажей с четко выраженными стадиями становления (1-3 пассажа), активного роста (4-55 пассажей) и старения (56-75±5 пассажей). Клетки культивируются на культуральных флаконах из пластика и стекла в стационарных и роллерных условиях, но не при суспензионном способе культивирования; формируют многослойную конфлуенту и характеризуются высокой плотностью насыщения монослоя. Число популяционных удвоений на уровнях 15, 30, 50 и 70 пассажей составляет соответственно 2,5; 3,0; 2,3 и 1,2; а время удвоения популяции 48, 46, 53 и 96 ч соответственно. При субкультивировании клетки отделяют от стекла или пластика 0,02% раствором Версена с добавлением 0,1 мл химопсина. Коэффициент рассева клеток в фазе активного роста 3-5.

Среда культивирования

Питательная среда Игла MEM с двойным набором аминокислот и питательная среда 199 в соотношении 1:1 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и гентамицина в концентрации 100 мкг/мл.

Кариологические признаки

При анализе 1000 метафаз на каждой из стадий жизненного цикла линии клеток «FRL-95/05» установлено соответствие хромосомного набора линии нормальному диплоидному кариотипу человека мужского типа. Значение модального числа хромосом 46. Диплоидный набор хромосом имеют в период становления 85,2% метафаз; в период активного роста 95,1% метафаз; в период старения 92,3% метафаз. Полиплоидия соответственно составила 1%; 1,45% и 6,3%.

Сведения о контаминации линии

Исследование линии клеток «FRL-95/05» на присутствие бактерий, грибов, простейших, микоплазмы и вирусов проводили на 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65 пассажах культуры клеток. При контроле взвеси клеток в индикаторных средах, в чувствительных клеточных системах и на лабораторных животных (кролики, взрослые и новорожденные мыши и развивающиеся куриные эмбрионы) посторонние микробные, вирусные агенты и микоплазма не обнаружены. Спонтанная дегенерация клеток не выявлена.

Сведения о туморогенности

Туморогенная активность линии клеток «FRL-95/05» определялась в опытах in vivo при использовании для контроля новорожденных мышей (в возрасте не более 24 час), обработанных антитимоцитарной сывороткой (по схеме: введение 0,1 мл подкожно в день инокуляции взвеси исследуемых диплоидных клеток, а затем на 2, 7, 14 день после рождения) и разделенных на две группы по 10 особей в каждой, одной из которых вводили подкожно суспензию клеток линии «FRL-95/05» в концентрации 1000000 клеток в мл; другой - суспензию клеток перевиваемой линии Hela в той же концентрации. За животными обеих групп наблюдали 21 сут, в течение которых регистрировали образование узлов и развитие опухолей в месте инокуляции материала. По истечении срока наблюдения животных забивали и проводили макроскопическое исследование на наличие опухолей в месте введения клеточной взвеси, а также в лимфатических узлах, легких, почках и печени. По результатам исследования туморогенной активности линии диплоидных клеток «FRL-95/05» не выявлено.

Иозимный спектр

Изучение изоферментов в клетках линии «FRL-95/05» выявляет энзимограмму человека и (?) Г6 ФДГ медленного типа.

Криоконсервация клеток

Клетки линии «FRL-95/05» сохраняют жизнеспособность не менее 80% при консервировании в жидком азоте. Создан банк отконтролированных посевных клеток на уровне 4-го и 6-го пассажа в количестве 600 млн клеток.

Чувствительность к вирусам

Клетки линии «FRL-95/05» чувствительны к заражению вирусами краснухи, кори и эпидемического паротита, респираторно-синцитиалыюго, аденовируса, вируса парагриппа (2 и 3 тип). Инфекционный титр вирусов на уровне 15 пассажа равен 5-6 lg ТЦД₅₀/мл; 6,0 lg ТЦД₅₀/мл; 4,5 lg ТЦД₅₀/мл; 4,0 lg ТЦД₅₀/мл и 5,0 lg ТЦД₅₀/мл; 3,5 lg ТЦД₅₀/мл соответственно.

Клетки линии «FRL-95/05» также чувствительны к заражению ротавирусом и вирусом гриппа А, которые накапливаются в клетках на уровне 10-25 пассажей до инфекционного титра 3,5 lg ТЦД₅₀/мл и 5,0 lg ТЦД₅₀/мл соответственно.

Использование линии клеток «FRL-95/05» иллюстрируется следующими примерами. Пример 1.

Культивирование вируса краснухи в культуре клеток «FRL-95/05».

В культуральный сосуд с монослоем клеток «FRL-95/05» на уровне 15 пассажа вносят 0,02% раствора версена с добавлением 0,1 мл химопсина, подогретого до 37°С. Через 8-10 секунд раствор удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат с температурой 37°С на 2-3 мин, затем вносят в него 5 мл ростовой среды и клетки тщательно разбивают пилотированием. Проводят подсчет клеточной суспензии, разводят ее до посевной концентрации 200 тыс.кл/мл ростовой средой (питательная среда Игла MEM с двойным набором аминокислот и питательная среда 199 в соотношении 1:1 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и гентамицина 100 мкг/мл) и разливают по 40 мл в новые культуральные сосуды объемом 250 мл. Культивирование клеток осуществляют при 37°С до момента формирования монослоя. Перед заражением клеток вирусом краснухи культуральные сосуды 1 раз отмывают раствором Хенкса от ростовой среды и вносят расчетное количество посевного вируса краснухи (0,01 ТЦПД₅₀/клетку), проводят адсорбцию вируса в течение 1,5 часов при комнатной температуре, после чего добавляют по 35 мл поддерживающей питательной среды, состоящей из среды Игла MEM с двойным набором аминокислот и среды 199 (в равном соотношении), с добавлением 1% сыворотки крупного рогатого скота и гентамицина (100 мкг/мл). Зараженные клетки инкубируют при температуре 34-35°С, ежедневно регистрируя развитие цитопатогенного эффекта, характерного для вируса краснухи (наблюдение под микроскопом), и делая сборы вируссодержащей культуральной жидкости до полной деградации клеточного монослоя. Вирусные сборы охлаждают при 4-8°С, а затем замораживают в сухом льду со спиртом и оттаивают в водяной бане при 37°С. Указанную процедуру проводят трехкратно. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость вместе с отслоившимися пораженными клетками сохраняют до использования по назначению при температуре -20...-40°С. Инфекционный титр вируса, определяемый титрованием на перевиваемой культуре клеток почек кролика RK-13, равен 5,5±0,5 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 2. Культивирование вируса кори в культуре клеток «FRL-95/05».

Культуральные сосуды с монослоем клеток «FRL-95/05» на уровне 15 пассажа получают, как описано в примере 1.

Перед заражением вирусом кори культуральные сосуды 1 раз отмывают раствором Хенкса от ростовой среды и вносят расчетное количество посевного вируса кори (0,01 ТЦД₅₀/клетку), проводят адсорбцию вируса в течение 1,0 часа при температуре 35°С, после чего добавляют по 35 мл поддерживающей питательной среды, состоящей из среды Игла MEM с двойным набором аминокислот и среды 199 в равном соотношении с добавлением 1% сыворотки эмбрионов коров и гентамицина (100 мкг/мл). Зараженные клетки инкубируют при температуре 35°С, ежедневно регистрируя состояние монослоя (наблюдение под микроскопом), по мере нарастания цитопатогенного эффекта, характерного для вируса кори, делают сборы вируссодержащей культуральной жидкости до полной деградации клеточного монослоя. Вирусные сборы охлаждают при 4-8°С, а затем замораживают в сухом льду со спиртом и оттаивают в водяной бане при 37°С, указанную процедуру проводят трехкратно. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость вместе с отслоившимися пораженными клетками сохраняют до использования по назначению при температуре -20...-40°С. Инфекционный титр вируса кори, определяемый титрованием на перевиваемой культуре клеток Vero, равен 6,0 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 3. Культивирование вируса эпидемического паротита в культуре клеток «FRL-95/05».

Культуральные сосуды с монослоем клеток «FRL-95/05» на уровне 15 пассажа получают, как описано в примере 1.

Перед заражением вирусом эпидемического паротита культуральные сосуды 1 раз отмывают раствором Хенкса от ростовой среды и вносят расчетное количество посевного вируса эпидемического паротита (0,1 ТЦД₅₀/клетку), проводят адсорбцию вируса в течение 1,5 часа при температуре 35°С, после чего добавляют по 35 мл поддерживающей питательной среды, состоящей из среды Игла MEM с двойным набором аминокислот и среды 199 в равном соотношении с добавлением 1% сыворотки эмбрионов коров и гентамицина (100 мкг/мл). Зараженные клетки инкубируют при температуре 35°С, ежедневно регистрируя состояние монослоя, по мере нарастания цитопатогенного эффекта, характерного для вируса эпидемического паротита (наблюдение под микроскопом), делают сборы вируссодержащей культуральной жидкости до полной деградации клеточного монослоя. Вирусные сборы охлаждают при 4-8°С, а затем трехкратно замораживают в сухом льду со спиртом и оттаивают в водяной бане при 37°С. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость вместе с отслоившимися пораженными клетками сохраняют до использования по назначению при температуре -20...-40°С. Инфекционный титр вируса эпидемического паротита, определяемый титрованием на перевиваемой культуре клеток Vero, равен 4,5 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 4. Культивирование аденовируса в линии клеток «FRL-95/05».

Культуральные сосуды с монослоем клеток «FRL-95/05» на уровне 15 пассажа получают, как описано в примере 1.

Перед заражением аденовирусом культуральные сосуды 1 раз отмывают раствором Хенкса от ростовой среды и вносят расчетное количество посевного аденовируса (0,1 ТЦД₅₀/клетку), проводят адсорбцию вируса в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего добавляют по 35 мл поддерживающей питательной среды, состоящей из среды Игла MEM с двойным набором аминокислот и среды 199 в равном соотношении, без сыворотки крупного рогатого скота, с добавлением гентамицина (100 мкг/мл). Зараженные клетки инкубируют при температуре 37°С, ежедневно регистрируя состояние монослоя (наблюдение под микроскопом). По мере нарастания цитопатогенного эффекта, характерного для аденовируса, делают однократный сбор вируссодержащей культуральной жидкости при полной деградации клеточного монослоя. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость вместе с отслоившимися пораженными клетками сохраняют до использования по назначению при температуре -20...-40°С. Инфекционный титр аденовируса, определяемый титрованием на перевиваемой культуре клеток Нер-2, равен 5,0 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 5. Культивирование респираторно-синтициального (РС-) вируса в линии клеток «FRL-95/05».

Культуральные сосуды с монослоем клеток «FRL-95/05» на уровне 15 пассажа получают, как описано в примере 1.

Перед заражением PC-вирусом культуральные сосуды двукратно отмывают раствором Хенкса от ростовой среды и вносят расчетное количество посевного PC-вируса (1,0 ТЦД₅₀/клетку), проводят адсорбцию вируса в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего добавляют по 35 мл поддерживающей питательной среды, состоящей из среды Игла MEM с двойным набором аминокислот и среды 199 в равном соотношении, без сыворотки крупного рогатого скота, с добавлением гентамицина (100 мкг/мл). Зараженные клетки инкубируют при температуре 37°С, ежедневно регистрируя состояние монослоя (наблюдение под микроскопом), по мере нарастания цитопатогенного эффекта, характерного для PC-вируса, делают 1-2 сбора вируссодержащей культуральной жидкости до полной деградации клеточного монослоя. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость вместе с отслоившимися пораженными клетками сохраняют до использования по назначению при температуре -20...-40°С. Инфекционный титр PC-вируса, определяемый титрованием на перевиваемой культуре клеток Нер-2, равен 4,0 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 6. Культивирование вируса парагриппа (2 и 3 тип) в линии клеток «FRL-95/05»

Культуральные сосуды с монослоем клеток «FRL-95/05» на уровне 15 пассажа получают, как описано в примере 1.

Перед заражением вирусом парагриппа 2-го или 3-его типа культуральные сосуды 1 раз отмывают раствором Хенкса от ростовой среды и вносят расчетное количество посевного вируса (1,0 ТЦД₅₀/клетку), проводят адсорбцию вируса в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего добавляют по 35 мл поддерживающей питательной среды, состоящей из среды Игла MEM с двойным набором аминокислот, и среды 199 в равном соотношении, без сыворотки крупного рогатого скота, с добавлением гентамицина (100 мкг/мл). Зараженные клетки инкубируют при температуре 37°С, ежедневно регистрируя состояние монослоя (наблюдение под микроскопом), по мере нарастания цитопатогенного эффекта, характерного для вируса парагриппа, делают однократный сбор вируссодержащей культуральной жидкости при полной деградации клеточного монослоя. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость вместе с отслоившимися пораженными клетками сохраняют до использования по назначению при температуре -20...-40°С. Инфекционный титр вируса парагриппа 2 или 3 типа, определяемый титрованием на перевиваемой культуре клеток Нер-2, равен 3,5 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 7. Культивирование ротавируса в линии клеток «FRL-95/05».

Культуральные сосуды с монослоем клеток «FRL-95/05» на уровне 10 пассажа получают, как описано в примере 1.

Перед заражением вирусом культуральные сосуды однократно отмывают раствором Хенкса от ростовой среды и вносят расчетное количество посевного ротавируса (1,0 ТЦД₅₀/клетку), проводят адсорбцию вируса в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего добавляют по 35 мл поддерживающей питательной среды, состоящей из среды Игла MEM с двойным набором аминокислот и среды 199 в равном соотношении, без сыворотки крупного рогатого скота, с добавлением гентамицина (100 мкг/мл) и трипсина из расчета 10 мкг/мл. Зараженные клетки инкубируют при температуре 37°С, ежедневно регистрируя состояние монослоя (наблюдение под микроскопом), по мере нарастания цитопатогенного эффекта, характерного для ротавируса, делают 1-2 сбора вируссодержащей культуральной жидкости до полной деградации клеточного монослоя. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость вместе с отслоившимися пораженными клетками сохраняют до использования по назначению при температуре -20...-40°С. Инфекционный титр ротавируса, определяемый титрованием на перевиваемой культуре клеток СПЭВ, равен 3,5 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 8 Культивирование вируса гриппа А в линии клеток «FRL-95/05». Культуральные сосуды с монослоем клеток «FRL-95/05» на уровне 25 пассажа получают, как описано в примере 1. Перед заражением вирусом культуральные сосуды однократно отмывают раствором Хенкса от ростовой среды и вносят расчетное количество посевного вируса гриппа А (0,01 ТЦПД₅₀/клетку), проводят адсорбцию вируса в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего добавляют по 35 мл поддерживающей питательной среды, состоящей из среды Игла MEM с двойным набором аминокислот и среды 199 в равном соотношении, без сыворотки крупного рогатого скота, с добавлением гентамицина (100 мкг/мл) и трипсина из расчета 10 мкг/мл. Зараженные клетки инкубируют при температуре 34°С, ежедневно регистрируя состояние монослоя, по мере нарастания цитопатогенного эффекта, характерного для вируса гриппа (наблюдение под микроскопом), делают 1 сбор вируссодержащей культуральной жидкости при полной деградации клеточного монослоя. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость вместе с отслоившимися пораженными клетками сохраняют до использования по назначению при температуре -20...-40°С. Инфекционный титр вируса гриппа А, определяемый титрованием на перевиваемой культуре клеток MDCK, равен 5,0 lg ТЦД₅₀/мл.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Получена новая линия диплоидных клеток фибробластов легкого эмбриона человека РКК (П) 695Д, обладающая пролиферативной активностью, превышающей известные аналоги; а также широким спектром чувствительности к вирусам позвоночных и человека. Изобретение может быть использовано для выделения и идентификации вирусов, накопления вирусной биомассы с целью получения диагностических и вакцинных препаратов, тестирования диагностических и противовирусных химиопрепаратов.

Линия диплоидных клеток фибробластов легкого эмбриона человека №РКК (П) 695Д (Специализированная коллекция клеточных клеток культур позвоночных Российской коллекции клеточных культур) для выделения, идентификации вирусов и получения диагностических и вакцинных препаратов.