СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2012 года по МПК C07D487/08 A61K31/4995 A61P31/04 A61P31/12 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и бактериологии, а именно к новым средствам, обладающим антибактериальной активностью для нужд ветеринарии.

В настоящее время известно около 20 рекомендуемых к применению в медицинской практике противовирусных препаратов, принадлежащих к различным классам химических соединений. Некоторые из них испытаны в качестве терапевтических средств для лечения вирусных заболеваний животных (в основном для собак и кошек). У известных препаратов Арговит и Гамапрен антибактериальная или противовирусная активность сочетается с иммуномодулируещей. Собственно иммуномодуляторы также находят широкое применение при лечении вирусных инфекций, осложненных бактериальными инфекциями. Однако препараты, применяемые в медицинской практике, имеют высокую стоимость, что исключат возможность их широкого применения в ветеринарной практике.

Известно средство, представляющее собой комплекс серебра с медицинским поливинилпирролидоном (патент РФ №2147237, опубл. 10.04.2000). Известное средство (препарат Арговит, ТУ 9310-13-00008064-00) обладает широким спектром антимикробной активности в отношении аэробной и анаэробной микрофлоры, проявляет вирулицидную и фунгицидную активность, оказывает противовоспалительное действие. Выпускается в виде стабилизированного концентрированного раствора, из которого путем разведения дистиллированной водой готовят разбавленные рабочие растворы для применения. Арговит в виде разбавленного раствора разрешен для перорального применения для профилактики и лечения кишечных инфекций бактериальной и вирусной этиологии, а в виде аэрозоля - для профилактики и лечения бронхолегочных инфекций у сельскохозяйственных животных.

Недостатками известного средства являются высокая стоимость и недостаточная стабильность при хранении, поскольку препарат Арговит выпускается в виде стабилизированного концентрированного 20%-ного раствора (содержание серебра в пересчете на 100% сухого препарата составляет 5-7%). Перед использованием препарат необходимо разбавлять в широких пределах (от 0,05 до 5,0%) в зависимости от назначения. При длительном хранении и, особенно под воздействием таких факторов, как свет, колебания температуры, замораживание, происходит агрегация кластерных частиц с образованием коллоидных, малоактивных частиц серебра. Возможно также появление пленки металлического серебра на поверхности концентрата.

Известны производные 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, обладающие противовирусной активностью по отношению к вирусам гриппа A/WSN/33 (H1N1) и вирусу клещевого энцефалита (патент РФ №2399669, опубл. 20.09.2010). Однако концентрация соединения, необходимая для инактивации указанных вирусов, составляет 20 мкМ, что почти в два раза превышает значение IC₅₀ (12 мкМ). Кроме того, для получения данных соединений с умеренным выходом (57%) требуется большой расход растворителей.

Наиболее близкими структурными аналогами к заявляемому соединению - прототипом, являются четвертичные соли 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, обладающие антибактериальной активностью [М.Thomas, D.Montenegro, A.Castaco, L.Friedman, J.Leb, M.L.Huang, L.Rothman, H.Lee, C.Capodiferro, D.Ambinder, E.Cere, J.Galante, J.L.Rizzo, K.Melkonian, R.Engel. Polycations. 17. Synthesis and properties of polycationic derivatives of carbohydrates // Carbohydrate Research 344 (2009) 1620-1627]. Данные соединения представляют собой поликатионные молекулы на основе полиолов. Данные соединения проявляют антибактериальную активность к ряду микроорганизмов, однако они не обладают противовирусным действием.

Технической задачей изобретения является получение нового эффективного, низкотоксичного и стабильного средства, обладающего антибактериальной активностью.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым соединением, представляющим собой 1,5-бис-(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан дихлорид дибромид, обладающим антибактериальной активностью.

На фиг.1 представлена структурная формула заявляемого соединения, а на фиг.2 - общая схема его синтеза.

Заявляемое средство, представляющее собой 1,5-бис-(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан дихлорид дибромид со структурной формулой, представленной на фиг.1, может быть использовано для лечения вирусного заболевания животных (например, вирусной диареи слизистых крупного рогатого скота), сопровождающегося бактериальными инфекциями.

Способ получения заявляемого средства заключается в следующем.

Исходный реагент хлорид 1-додецил-4-аза-1-азониабицикло[2.2.2]октан растворяют в метаноле при кипячении с обратным холодильником. Далее к раствору при перемешивании добавляют двумя порциями с интервалом 10-12 часов 1,5-дибромпентан в соотношении 1:(2-2,16), смесь перемешивают при кипячении 10-12 часов. После охлаждения к реакционной смеси добавляют ацетонитрил, выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме. Маточный раствор упаривают на ротационном испарителе, к вязкому сиропообразному остатку добавляют восьмикратный объем ацетонитрила, перемешивают на магнитной мешалке при кипении с обратным холодильником 1-2 ч. После охлаждения выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме. Полученные осадки объединяют. Выход целевого продукта составляет (80,4%-83,7%).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Получение 1,5-бис-(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан дихлорида дибромида.

Хлорид 1-додецил-4-аза-1-азониабицикло[2.2.2]октана (20,6 г, 65 ммоль) растворяют при кипячении с обратным холодильником в 20 мл метанола. К раствору, при кипячении и перемешивании на магнитной мешалке добавляют двумя порциями с интервалом 12 ч 1,5-дибромпентан (4,0 мл, 30 ммоль). После добавления последней порции реакционную смесь перемешивают 12 ч при кипячении. После охлаждения к реакционной смеси добавляют 20 мл ацетонитрила, выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме (15,8 г, 61%). Маточный раствор упаривают на ротационном испарителе, к вязкому сиропообразному остатку добавляют 40 мл ацетонитрила, перемешивают на магнитной мешалке при кипении с обратным холодильником 1 ч. После охлаждения выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме (5,9 г, 23%). Полученные осадки объединяют. Выход 21,7 г (83,7%).

Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д. (J, Гц): 0.93 (уш. т, 6Н, CH ₃(CH₂)₁₁N⁺, J 6.6), 1.32-1.45 (м, 36Н, CH₃(CH ₂)₉CH₂CH₂N⁺); 1.32 (м, 2Н, ⁺NCH₂CH₂CH ₂CH₂CH₂N⁺);

1.88 (м, 4Н, CH₃(СН₂)₉CH ₂CH₂N⁺); 1.98 (м, 4Н, ⁺NCH₂CH ₂CH₂CH ₂CH₂N⁺); 3.62 (м, 4Н, СН₃(CH₂)₁₀СН ₂N⁺); 3.75 (м, 4Н, CH₂CH ₂N⁺); 4.07-4.12 (м, 24Н, ⁺N(CH ₂CH ₂)₃N⁺.

Спектр ЯМР ¹³С, δ, м.д.: 12.95 (2C, CH₃(CH₂)₁₁N⁺); 21.64 (2C, CH₃ CH₂(CH₂)₁₀N⁺); 22.21 (2C, CH₃CH₂ CH₂(CH₂)₉N⁺); 25.63 (4C, ⁺NCH₂ CH₂CH₂ CH₂CH₂N⁺, CH₃(CH₂)₂ CH₂(CH₂)₈N⁺); 28.66 (2C, CH₃(CH₂)₃ CH₂(CH₂)₇N⁺); 28.95 (4C, CH₃(CH₂)₄ CH₂ CH₂(CH₂)₅N⁺); 29.10 (3C, ⁺N(CH₂)₂ CH₂(CH₂)₂N⁺, CH₃(CH₂)₆ CH₂ CH₂(CH₂)₃N⁺); 29.21 (2С, CH₃(CH₂)₈ CH₂(CH₂)₂N⁺); 31.54 (2C, CH₃(CH₂)₉ CH₂CH₂N⁺); 64.24 (2C, CH₃(CH₂)₁₀ CH₂N⁺); 50.81 и 51.03 (6C, ⁺N(CH₂ CH₂)_зN⁺; 64.71 (2C, CH₂ ⁺N(CH₂CH₂)₃N⁺).

Пример 2.

Получение 1,5-бис-(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан дихлорида дибромида.

Хлорид 1-додецил-4-аза-1-азониабицикло[2.2.2]октана (19,0 г, 60 ммоль) растворяют при кипячении с обратным холодильником в 20 мл метанола. К раствору при кипячении и перемешивании на магнитной мешалке добавляют двумя порциями с интервалом 10 ч 1,5-дибромпентан (4,0 мл, 30 ммоль). После добавления последней порции реакционную смесь перемешивают 10 ч при кипячении. После охлаждения к реакционной смеси добавляют 20 мл ацетонитрила, выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме (15,5 г, 60%). Маточный раствор упаривают на ротационном испарителе, к вязкому сиропообразному остатку добавляют 40 мл ацетонитрила, перемешивают на магнитной мешалке при кипении с обратным холодильником 2 ч. После охлаждения выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме (5,3 г, 20,4%). Полученные осадки объединяют. Выход 20,8 г (80,4%).

Полученному поликатионному соединению присвоено рабочее название Абакавир.

Пример 3. Определение влияния условий и сроков хранения Абакавира на стабильность его химического состава.

Абакавир хранили в условиях бытового холодильника при - 4±2°C и при комнатной температуре 20±2°C в течение трех лет (срок наблюдения). Проводили ЯМР и элементный анализ Абакавира с периодичностью один раз в шесть месяцев. В результате проведенных исследований не было отмечено отклонений в его составе.

Таким образом, полученное соединение стабильно (срок наблюдения 3 года), допускает хранение при комнатной температуре.

Пример 4. Оценка цитотоксичности Абакавира

Цитотоксичность Абакавира оценивали путем добавления его разведении в среде Игла MEM к выращенному монослою перевиваемой клеточной культуры КСТ (коронарные сосуды теленка) в лунки 96-луночного планшета (Costar), до конечных концентраций 39,06-5000,0 мкг/мл (по четыре лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°C в CO₂-инкубаторе в течение 3 суток.

Токсичность Абакавира оценивали по четырехкрестовой системе, анализируя морфологию клеток и целостность монослоя при микроскопировании в инвертированном микроскопе.

Таблица 1 Доза соединения Цитотоксическое действие (ЦТД) 10 мг/мл -++- 5 мг/мл ---- 2,5 мг/мл ---- 1,25 мг/мл ---- 625,0 мкг/мл ---- 312,5 мкг/мл ---- 156,25 мкг/мл ---- 78,125 мкг/мл ---- 39,06 мкг/мл ----

Из данных таблицы 1 видно, что в исследованных концентрациях заявляемое соединение не проявляет токсичности, минимальная нетоксичная доза Абакавира для культуры клеток КСТ составляет более 5 мг/мл.

Учитывая результаты определения нетоксичной дозы, рассчитали максимально переносимую концентрацию (МПК) Абакавира для культуры клеток КСТ, которая составила 2,5 мг/мл. За МПК принимали 1/2 дозы, при которой отсутствовало цитопатическое действие вещества.

Пример 5. Оценка противовирусной активности Абакавира в отношении вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) в условиях in vitro в культуре клеток.

Для оценки противовирусного действия Абакавира культуру клеток КСТ заражали вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (штамм «ВК-1») в дозе не менее 1-10 ТЦД/кл (тканевая цитопатическая доза). Через 1,5 часа после заражения в лунки с культурой клеток вносили Абакавир в дозе 2,5±0,1 мг/мл (опыт) или разводящую питательную среду (контроль). Культивировали при 37°С в течение 72 часов, после чего вируссодержащую суспензию титровали для определения инфекционной активности вируса ВД-БС КРС.

Противовирусный эффект Абакавира рассчитывали по разнице инфекционных активностей вируса в контрольных и опытных образцах (Вирусология. Методы. Под ред. Б.Мейхи. М: Мир, 1988) и выражали в lg снижения титров вируса (Н.Д.Львов и соавт. Вопросы вирусологии, 1986, №2). В каждом опыте проводили дополнительный контроль на токсичность испытуемой дозы Абакавира.

Определение инфекционного титра вируса ВД-БС КРС проводили микрометодом (Вирусология. Методы. Под ред. Б.Мейхи. М: Мир, 1988) в 96-луночных культуральных планшетах с культурой клеток КСТ с использованием не менее 4 параллельных рядов. Инфекционный титр вируса выражали в ТЦД_{50/0,1 мл} (50%-ная тканевая цитопатическая доза).

Разница титра вируса в опытных и контрольных образцах более чем в 3 lgТЦД₅₀/_мл свидетельствует о высокой противовирусной активности Абакавира.

В таблице 2 представлены показатели снижения инфекционной активности вируса (выраженной в lg) в контроле, где вирус репродуцировался без Абакавира, и в опыте, где репродукция осуществлялась в присутствии Абакавира.

Таблица 2 Титр вируса (lg ТЦД_50/мл) контроль Титр вируса (lg ТЦЦ_50/мл) опыт 4,83±0,07 1,75±0,12

Из данных таблицы 2 видно, что Абакавир в значительной степени (на 3,08 lg ТЦД_50/мл) подавляет инфекционную активность вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Снижение титра вируса было достоверным (более 3 lg ТЦД_50/мл.) при внесении препарата через 1,5 часа после заражения культуры клеток.

Пример 6. Оценка антибактериальной активности Абакавира на патогенные тест-штаммы: Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa.

Растворы Абакавира вносили в питательную среду одновременно с посевной концентрацией тест-штамма, инкубировали стационарно в пробирках (по 1 мл) при 37°С в течение 24 часов.

Результаты учитывали методом биологического титрования, определяя количество микроорганизмов (титр) до и после инкубации (в колонии образующие единицы на 1 мл, KOE/мл). В качестве контроля использовали среду с тест-штаммом без внесения Абакавира.

Бактерицидную активность (БА) оценивали условно:

+ наличие бактерицидной активности (резкое уменьшение количества микроорганизмов);

+\- наличие бактериостатической активности (отсутствие увеличения или незначительное увеличение количества микроорганизмов);

- отсутствие активности (увеличение количества микроорганизмов, сравнимое с контролем).

В таблице 3 представлены показатели активности различных концентраций Абакавира на патогенные штаммы бактерий и штамм дрожжей Candida albicans. Значение <10² показывает, что на чашках Петри не выросло ни одной колонии патогенных микроорганизмов.

Из таблицы 3 видно, что Абакавир обладает выраженным антимикробным действием по отношению к патогенным штаммам микроорганизмов. При концентрации препарата 1 мг/мл происходит полная инактивация всех исследуемых микроорганизмов. При снижении концентрации до 10 мкг/мл препарат полностью инактивирует штаммы бактерий Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Candida albicans и уменьшает титр Pseudomonas aeruginosa в 10 тысяч раз по отношению к контролю.

Таким образом, заявляемое средство обладает следующими преимуществами перед известными:

- позволяет достоверно снижать репродукцию вируса ВД-БС КРС в чувствительной культуре клеток, т.е. обладает противовирусной активностью;

- обладает выраженным антибактериальным действием по отношению к патогенным штаммам микроорганизмов;

- обладает низкой токсичностью;

- имеет стабильный химический состав на протяжении трех лет хранения (срок наблюдения) при режиме его хранения -4±2°С и +20±4°С.

Абакавир может использоваться в ветеринарной практике при разработке методов профилактики и лечения инфекций крупного рогатого скота, вызванных вирусами семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, в частности вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота, сопровождающихся бактериальными инфекциями.

Таблица 3 Средство, обладающее антибактериальной и противовирусной активностями С мкг/мл Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus Candida albicans Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa исх. титр - 9,0×10⁵ исх.титр - 1,3×10⁶ исх. титр - 1,5×10⁵ исх. титр - 3,2×10⁶ исх. титр - 1×10⁶ титр БА титр БА титр БА титр БА титр БА 1000 <10² + <10² + <10² + <10² + <10² + 100 <10² + <10² + <10² + 1,6×10⁴ + <10² + 10 <10² + <10² + <10² + 1,6×10⁸ - 2,9×10⁵ +/- 1 3,1×10⁸ - 1,3×10² + 6,5×10⁵ +/- >10⁸ - 1,3×10⁹ - 0,1 5,8×10⁸ - 6,7×10⁸ - 6,5×10⁷ - >10⁸ - ~10⁹ - 0 (контроль) 8,6×10⁸   1,2×10⁹   3,6×10⁷   7,7×10⁸   1,3×10⁹  

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и бактериологии. Заявлено средство, представляющее собой 1,5-бис-(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан дихлорид дибромид со структурной формулой, представленной на фиг.1, которое может быть использовано для лечения вирусных заболеваний животных (например, вирусной диареи слизистых крупного рогатого скота), сопровождающихся бактериальными инфекциями. Синтез заявленного соединения осуществляют в метаноле как растворителе в течение 20-24 ч при мольном соотношении следующих компонентов: хлорида 1-додецил-4-аза-1-азониабицикло[2.2.2]октана и 1,5-дибромпентана, равном 1:(2,0-2,16), с выходом целевого соединения 80,4-83,7%. Заявляемое средство обладает низкой токсичностью, стабильно при хранении при комнатной температуре в течение 3-х лет, обладает выраженным антибактериальным действием по отношению к патогенным штаммам микроорганизмов. 3 табл., 2 ил.

Средство, обладающее антибактериальной активностью, представляющее собой 1,5-бис-(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан дихлорид дибромид со следующей структурной формулой: