СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК Российский патент 2007 года по МПК A61K31/41 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к способам подавления репродукции вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота с помощью противовирусного препарата в культуре клеток.

До настоящего времени основным способом подавления инфекционной активности вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота является способ в условиях in vitro при помощи препарата фоспренил (см. Ожерелков С.В. и др. Препарат фоспренил подавляет размножение вирусов диареи и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в чувствительных культурах клеток // Вопросы вирусологии. - 2001. - №5. - С.43-45).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что препарат фоспренил является более токсичным для культуры клеток и проявляет свою активность только в дозе 200 мкг/мл, оценку противовирусного действия препарата проводят в культуре клеток MDBK (почка теленка), которая является недостаточно чувствительной для вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ подавления инфекционной активности вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота при помощи препарата рибавирин в условиях in vitro в чувствительной культуре клеток ВТ (кишечник крупного рогатого скота) (см. Vanessa Escuret, Parviz Parvaz, Olivier Hantz, Marie-Anne Petit, Christian Trepo, Fabien Zoulim. Study of the antiviral mechanism of action of ribavirin in the bovine viral diarrhea virus model // Gastroenterologie Clinique & Biologique English. - 2002. - 26. - 6-7. - 0399-8320; Gastroenterologie Clinique & Biologique English. - 2002. - 26. - PP.584.590).

Способ основан на подавлении размножения вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота при помощи препарата рибавирин в нетоксичной для культуры клеток дозе. В опытах in vitro препарат в дозах 50 μM ингибировал репликацию вируса вирусной диареи - болезни слизистых в культуре клеток ВТ (кишечник теленка) при условии внесения препарата за 24 часа до внесения вируса.

К недостаткам данного прототипа можно отнести то, что препарат проявлял противовирусное действие при условии внесения его в культуру клеток за 24 часа до внесения вируса, использование препарата в дозе 50 μM, а также то, что опыты проводились в перевиваемой линии культуры клеток кишечника теленка (ВТ).

Технической задачей изобретения является применение новой культуры клеток для расширения диапазона используемых культур, расширение временного интервала эффективного действия препарата в отношении вируса, предотвращение токсического действия препарата в отношении вируса, предотвращение токсического действия препарата на клетки за счет снижения его дозы, обеспечение начала лечения в более ранние сроки.

Сущность изобретения заключается в том, что в известном способе подавления репродукции вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота в культуре клеток при помощи противовирусного препарата рибавирин, согласно изобретению в культуру клеток вносят вирус в дозе 1-10 ТЦД_50/кл, инкубируют клетки с вирусом в течение 1,5-2 часов, затем вносят противовирусный препарат рибавирин в нетоксичной дозе 50±1 мкг/мл.

Сущность изобретения заключается также в том, что смесь инкубируют в течение 48 часов при температуре 37±0,2°С в условиях атмосферы 5±0,2% СО₂, по окончании срока инкубации вируссодержащую суспензию титруют для определения противовирусного эффекта препарата.

Сущность изобретения заключается также в том, что исследования проводят в перевиваемой линии культуры клеток КСТ (коронарные сосуды плода коровы), выращенной микрометодом в 96-луночных культуральных планшетах.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выращивание перевиваемой линии культуры клеток КСТ микрометодом.

Культуру клеток КСТ, выращенную в пластиковых матрасах емкостью 25 см³, снимают со стекла при помощи смеси трипсина и версена в соотношении 1:9. Клетки ресуспендируют в питательной среде Игла MEM, содержащей 20 мг/мл канамицина, до концентрации 3,5×10⁵ клеток в 1 мл и добавляют сыворотку крови лошади в объеме 5% к объему суспензии клеток (конечная концентрация 2,5%). В каждую лунку 96-луночного микропланшета (Costar) вносят по 0,1 мл суспензии клеток. Микропланшеты закрывают крышкой и инкубируют в условиях CO₂ инкубатора в течение 2 дней до образования монослоя клеток. Для оценки токсичности противовирусного препарата используют сформированный монослой клеток КСТ, полностью покрывающий площадь лунки микропланшета.

Пример 2. Оценка цитотоксичности препарата рибавирин.

Цитотоксичность препарата оценивают путем добавления его разведений в среде Игла MEM к выращенному по примеру 1 монослою клеточной культуры КСТ в лунки 96-луночного планшета (Costar) до конечных концентраций 20-1000 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в СО₂-инкубаторе в течение 5 суток. Контролем служат клетки без добавления исследуемого соединения. В монослой культуры клеток вносят исследуемый препарат в концентрации 20-2000 мкг/мл. Инкубацию препарата с клетками проводят в течение 5 суток. По окончании этого срока оценивают жизнеспособность клеток визуально по состоянию монослоя в целом и после окрашивания 1% раствором трипанового синего, приготовленного на фосфатном буфере рН 7,2-7,3. Через 5 минут внесения краски подсчитывают количество живых (неокрашенных) и мертвых (окрашенных в голубой цвет) клеток в камере Горяева и по формуле определяют количество клеток в 1 мл, учитывая кратность разведения клеточной суспензии раствором краски. Токсичность различных доз рибавирина определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным результатам рассчитывают минимальную нетоксичную дозу препарата.

Таблица 1Концентрация препарата, мкг/млЦитотоксическое действие препарата (+;-)Количество жизнеспособных клеток, %2000+8,411000+17,81500+24,46200+46,38100+70,4550-97,4620-98,820-99,8Примечание: + - наличие цитотоксического действия;
- - отсутствие цитотоксического действия.

Из данных таблицы 1 видно, что минимальная нетоксичная доза рибавирина для культуры клеток КСТ составляет 50 мкг/мл.

Пример 3. Оценка противовирусного действия препарата рибавирин на вирус вирусной диареи-болезни слизистых КРС в культуре клеток.

Для оценки противовирусного действия препарата рибавирин культуру клеток КСТ заражают вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (штамм «ВК-1) с инфекционной активностью 6,33±0,07 lg ТЦД_50/мл. Через 1; 1,5; 3; 6; 9 часов после заражения в лунки с культурой клеток вносят рибавирин в дозе 50 мкг/мл. Через 48 часов вируссодержащую жидкость титруют для определения инфекционной активности вируса. Разница титра вируса в опытных и контрольных образцах не менее чем в 2 lg ТЦД_50/мл свидетельствует о противовирусной активности рибавирина.

Результаты представлены в таблице 2.

Титр вируса до внесения препарата (lg ТЦД_50/мл)Титр вируса (lg ТЦД _50/мл) после внесения препарата через (час)1,01,53696,33±0,076,33±0,073,67±0,124,67±0,125,41±0,076,00±0,12

Из данных таблицы 2 видно, что рибавирин в значительной степени (на 2,66 lg ТЦД_50/мл) подавляет инфекционную активность вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Снижение титра вируса было достоверным (более 2 lg ТЦД_50/мл) при внесении препарата через 1,5 часа после заражения культуры клеток.

Таким образом, заявляемый способ позволяет достоверно снижать репродукцию вируса ВД-БС КРС в чувствительной культуре клеток, что в дальнейшем может использоваться в ветеринарной практике при разработке методов профилактики и лечения инфекций крупного рогатого скота, вызванных вирусами семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, в частности вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.

Противовирусный эффект препарата рибавирин проявляется при условии внесения его в монослой культуры клеток через 1,5 часа после ее контакта с вирусом, опыты проводятся в более чувствительной культуре клеток КСТ, а препарат используется в дозе 50 мкг/мл, что в 244 раза ниже и, соответственно, менее токсично. Внедрение технических характеристик заявляемого способа позволит значительно снизить затраты труда на проведение исследований, а также количество используемого препарата.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Способ предусматривает выращивание перевиваемой линии культуры клеток КСТ (коронарные сосуды плода коровы) микрометодом в 96-луночных культуральных планшетах. В культуру клеток вносят вирус в дозе 1-10 ТЦД_50/кл, инкубируют клетки вирусом в течение 1,5-2 часов. Затем вносят противовирусный препарат в нетоксичной дозе 50±1 мкг/мл. Смесь инкубируют в течение 48 часов при температуре 37±0,2°С в условиях атмосферы 5±0,2% CO₂. Способ позволяет повысить эффективность подавления репродукции вируса при снижении концентрации противовирусного препарата. 2 табл.

Способ подавления репродукции вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота в культуре клеток, включающий внесение в культуру клеток вируса и препарата рибавирин, отличающийся тем, что вирус в культуру клеток вносят в дозе 1-10 ТЦД_50/кл, инкубируют клетки с вирусом в течение 1,5-2 ч, затем вносят рибавирин в нетоксичной дозе 50±1 мкг/мл, смесь инкубируют в течение 48 ч при температуре 37±0,2°С в условиях атмосферы 5±0,2% CO₂, а в качестве культуры клеток используют перевиваемую линию КСТ, выращенную микрометодом в 96-луночных культуральных планшетах.