ВОДОРАСТВОРИМОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, НА ОСНОВЕ СОЕДИНЕНИЯ СЕРЕБРА С ЦИСТИНОМ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2006 года по МПК A61K31/197 

Изобретение относится к водорастворимым противовирусным лекарственным средствам, к области фармацевтической химии и медицины. Изобретение относится также к области получения этих средств. Изобретение может быть использовано для создания готовых лекарственных форм для лечения вирусных, бактериальных и других инфекций.

Цель - создание высокоэффективных противовирусных лекарственных препаратов, в особенности для лечения вирусных гепатитов, антибиотикоустойчивых инфекций, включая ВИЧ инфекцию.

Сущность изобретения. Предложено новое противовирусное средство на основе соединения серебра и природной аминокислоты L-цистина, отвечающее составу C₆H₁₉N₄O₆S₂LiAg₂ (табл. 1).

Известны препарат под названием Аргохром фирмы Мерк (производившийся в Германии примерно с 1916 по 1945 годы и поступавший по импорту в бывший СССР в довоенный период), состав которого подпадает под действовавший с 1914 года Патент Австрии N69476 и называвшийся до 1920 г. по-немецки Silber methylen blau, а также препарат Гегонон, выпускавшийся по патенту Германии N268968, изданному 7 января 1914, класс 12р, группа 16 - прототип. (См. справочник Вотчал Б.Е. и др. "Фармацевтические препараты", М.-Л.: ОНТИ, 1934 г.)

Указанные препараты содержат серебро в ионной форме, прочно связанное с органическими молекулами - лигандами. Недостатком указанных препаратов является малая биодоступность содержащегося в них серебра, так как в случае Аргохрома лигандом является синтетический краситель - метиленовая синь, а в случае Гегонона - это высокомолекулярный носитель - альбумоза.

Задачей изобретения явилось повышение эффективности проникновения ионов серебра через биологические мембраны, начиная от проникновения в кровяное русло в случае перорального или ректального способов введения препарата, а также эффективная доставка ионов серебра к больным клеткам и проникновение через клеточную мембрану с целью прекращения жизнедеятельности инфекционных агентов.

Задача решается тем, что получен водорастворимый фотостойкий в растворах препарат серебра, представляющий собой прочный металлокомплекс серебра с природной аминокислотой L-цистином, при этом одна молекула цистина прочно связывает два иона серебра.

Предложен также способ получения нового водорастворимого противовирусного лекарственного средства (субстанции), заключающийся в том, что синтез осуществляют при комнатной температуре и мольном соотношении следующих компонентов: цистин - гидроокись лития - нитрат серебра - аммиак 1:2:2:8, при этом в воде вначале растворяют цистин, который переводят в литиевую соль добавлением гидроокиси лития, к полученному раствору добавляют предварительно полученный аммиачный комплекс нитрата серебра [Ag(NH₃)₂]NO₃, полученный смешением рассчитанных количеств раствора нитрата серебра и 25% водного раствора аммиака, реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 6 ч, упаривают в вакууме до 1/4 первоначального объема при температуре 40-50°С, при котором происходит интенсивное выпадение целевого соединения в виде мелкодисперсного осадка желтого цвета, полученную суспензию перемешивают с эквивалентным объемом этилового спирта, который добавляют четырьмя равными порциями, суспензию охлаждают до +4÷+6°С и выдерживают 12 ч, образовавшийся желтый осадок отфильтровывают, промывают этиловым спиртом и сушат в вакууме при комнатной температуре до постоянного веса.

Предлагаемая структурная формула, отвечающая составу C₆H₁₉N₄O₆S₂LiAg₂.

Пример осуществления способа.

В круглодонную колбу вместимостью 1 л загружают 24,00 г цистина, 8,40 г моногидрата гидроокиси лития и 100 мл дистиллированной воды. Реакционную смесь перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре до полного растворения исходных компонентов.

В стеклянный стакан вместимостью 300 мл загружают 33,97 г азотнокислого серебра и 50 мл дистиллированной воды. После растворения соли, при энергичном перемешивании, приливают 54,4 мл 25% водного раствора аммиака.

К гомогенному раствору дилитиевой соли цистина при комнатной температуре, при перемешивании на магнитной мешалке приливают раствор аммиачного комплекса серебра. Реакционная смесь постепенно приобретает желтую окраску, которая усиливается в течение 1-2 часов. Через 6 часов реакционную смесь упаривают на ротационном испарителе при температуре 40-50°С до объема 50 мл. При этом происходит интенсивное выпадение мелкодисперсного осадка желтого цвета. Суспензию переносят в стеклянный стакан емкостью 500 мл и при интенсивном перемешивании механической мешалкой добавляют 200 мл этилового спирта порциями по 50 мл в течение 30 минут. Суспензию перемешивают 30 минут и помещают в холодильник (+4÷+6°С) на 12 часов. Образовавшийся желтый осадок отфильтровывают, осадок тщательно промывают 300 мл этилового спирта и сушат в вакууме при комнатной температуре до постоянного веса.

Данные элементного анализа, представленные в таблице 1 получены с использованием автоматического анализатора элементного состава. Содержание металлов определялось атомно-адсорбционным методом.

Таблица 1Данные элементного анализа.Найдено (%)СHNLiAg13.363.4210.571.1840.1613.743.5010.701.2540.6813.333.5410.711.3240.46Вычислено (%) для C₆H₁₉N₄O₆S₂LiAg₂СНNLiAg13.603.6110.571.3140.70

Результаты лабораторных исследований на биологическую активность. В результате проведенных экспериментов в лабораторных условиях была изучена цитотоксичность и противовирусная активность заявляемого комплекса серебра с цистином с условным названием Аргобиоцин-2S.

Определение цитотоксичности препаратов проводили в соответствии с "Методическими рекомендациями по использованию культур клеток МДВК и КСТ для оценки цитотоксического действия лекарственных средств" (С.Г. Колесникова и соавт., 2002).

Все опыты проводили в трехкратной повторности. Статистическую обработку проводили общепринятыми методами (И.П. Ашмарин и соавт., 1974).

Определение цитотоксичности препаратов для культуры клеток.

Для определения цитотоксичности препаратов для культуры клеток испытуемые препараты вносили в двухсуточный монослой культуры клеток КСТ, выращенной микрометодом в 96-луночных планшетах в следующих дозах: 10 мг/мл; 1 мг/мл; 100 мгк/мл; 10 мкг/мл; 1 мкг/мл; 0,1 мкг/мл; 0,01 мкг/мл; 0,001 мкг/мл. На одно разведение каждого препарата использовали 4 лунки с монослоем культуры клеток. Цитотоксическое действие препарата на клетки учитывали по степени изменения монослоя и контролировали в течение 3 суток. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2Цитотоксическое действие препарата в культуре клеток КСТДоза препаратаЦитотоксическое действие (ЦТД)"Аргобиоцин 2S"10 мг/мл+1 мг/мл-100 мкг/мл-10 мкг/мл-1 мкг/мл-0,1 мкг/мл-0,01 мкг/мл-0,001 мкг/мл-

Токсическая доза препарата "Аргобиоцин 2S" составила 10 мг/мл. В результате исследований установили, что цитотоксическая доза препарата "Аргобиоцин 2S" для культуры клеток КСТ составила 10 мг/мл. Нетоксичная для культуры клеток КСТ доза препарата "Аргобиоцин 2S" составила 1 мг/мл.

Для определения минимальной цитотоксической дозы испытуемый препарат вносили в двухсуточный монослой культуры клеток КСТ, выращенной микрометодом в 96-луночных планшетах в следующих дозах: 10; 5; 2,5; 1,25 мг/мл. На одно разведение каждого препарата использовали 4 лунки с монослоем культуры клеток. Цитотоксическое действие препаратов на клетки учитывали по степени изменения монослоя и контролировали в течение 3 суток. Исследования проводили в трех повторностях. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3Определение минимальной цитотоксической и максимальной нетоксичной дозы препарата "Аргобиоцин 2S"Доза препарата "Аргобиоцин 2S",
мг/млЦитотоксическое действие (ЦТД)1 исследование2 исследование3 исследование10+++5++-2,5---1,25---

Минимальная цитотоксическая для культуры клеток КСТ доза препарата "Аргобиоцин 2S" составила: 6,67±1,36 мг/мл, а максимальная нетоксичная - 3,33±0,68 мг/мл.

Таким образом, максимальная цитотоксическая доза препарата "Аргобиоцин 2S" для культуры клеток КСТ составила 10 мг/мл, а минимальная - 6,67±1,36 мг/мл. Максимальная нетоксичная для культуры клеток КСТ доза препарата "Аргобиоцин 2S" составила 3,33±0,68 мг/мл.

Определение противовирусной активности препаратов в отношении вируса ВД-БС КРС осуществлялось следующим образом. Монослой используемой культуры клеток заражали вирусом ВД-БС КРС в дозе не менее 1-10 ТЦД/кл, через 1,5 часа после этого их отмывали питательной средой без сыворотки и вносили препараты в максимальных нетоксичных для культуры клеток КСТ дозах (опыт) или разводящую питательную среду (контроль). Через 72 часа культивирования вируса в таких биосистемах культуральную жидкость титровали. Противовирусный эффект препаратов рассчитывали по разнице инфекционных активностей вирусов в контрольных и опытных образцах (Вирусология. Методы, под ред. Б. Мейхи, М.: Мир, 1988). Противовирусный эффект препаратов выражали в lg ТЦД_{50/0,1 мл} снижения титров вируса (Н.Д. Львов и соавт., Вопросы вирусологии, 1986, №2). Препарат считали эффективным при снижении инфекционного тира вируса не менее чем на 2 lg ТЦД_{50/0,1 мл} (в 100 раз) по сравнению с контрольными (не обработанными препаратами культурами клеток). В каждом опыте проводили дополнительный контроль на токсичность испытуемой дозы препаратов.

Титрование вирусов осуществлялось следующим образом. Определение инфекционного титра вируса ВД-БС КРС проводили микрометодом (Вирусология. Методы, под ред. Б. Мейхи, М.: Мир, 1988) в 96-луночных культуральных планшетах с культурой клеток КСТ с использованием не менее 4 параллельных рядов. Инфекционный титр вируса выражали в ТЦД_{50/0,1 мл} (50%-я тканевая цитопатическая доза).

Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4Накопление вируса ВД-БС КРС в культуральной жидкости в присутствии препарата.Название препаратаИспользованная доза препаратаКонцентрация вируса ВД-БС (M±m), lg ТЦД_{50/0,1 мл}ОпытКонтроль"Аргобиоцин 2S"1 мг/мл4,07±0,076,08±0,07

В результате проведенных исследований установлено, что препарат "Аргобиоцин 2S" оказывает противовирусное действие, снижая инфекционную активность вируса ВД-БС КРС на 2,01 lg ТЦД_{50/0,1 мл} по сравнению с контролем.

В результате проведенной работы найдена нетоксичная доза препарата для культуры клеток КСТ (коронарные сосуды теленка), на которых культивировался вирус (вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВД-БС КРС)) in vitro. Данная доза проявила выраженные противовирусные свойства, снизив инфекционную активность вируса в сто раз. Таким образом, применение данного препарата в качестве основы противовирусных лекарственных средств позволит получить новые эффективные лекарственные средства с иным механизмом действия по сравнению с ныне применяемыми лекарственными препаратами, не содержащими ионов металлов в своей структуре.

Изобретение относится к области фармацевтической химии и медицины. Изобретение относится к новому водорастворимому противовирусному средству на основе соединения серебра с цистином, отвечающее составу C₆H₁₉N₄O₆S₂LiAg₂, а также к способу его получения. Синтез заявленного средства осуществляют при комнатной температуре смешением следующих компонентов: цистин - гидроокись лития - нитрат серебра - аммиак в мольном соотношении 1:2:2:8. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 6 часов, после чего упаривают в вакууме до 1/4 первоначального объема при температуре 40-50°С. К полученной суспензии прибавляют эквивалентное количество этилового спирта, охлаждают до +4÷+6°С и выдерживают 12 часов. Образовавшийся целевой продукт в виде желтого мелкодисперсного осадка отфильтровывают, промывают этиловым спиртом, и сушат в вакууме при комнатной температуре. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.

1. Водорастворимое средство, обладающее противовирусной активностью, на основе соединения серебра с цистином и отвечающее составу C₆H₁₉N₄O₆S₂LiAg₂.2. Способ получения водорастворимого средства, обладающего противовирусной активностью по п.1, заключающийся в том, что синтез осуществляют при комнатной температуре смешением следующих компонентов: цистин - гидроокись лития - нитрат серебра - аммиак в мольном соотношении 1:2:2:8, при этом в воде вначале растворяют цистин, который переводят в литиевую соль добавлением гидроокиси лития, к полученному раствору добавляют предварительно полученный аммиачный комплекс нитрата серебра, полученный смешением рассчитанных количеств раствора нитрата серебра и 25%-ного водного раствора аммиака, реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 6 ч, упаривают в вакууме до 1/4 первоначального объема при температуре 40-50°С, при котором происходит интенсивное выпадение целевого соединения в виде мелкодисперсного осадка желтого цвета, полученную суспензию перемешивают с эквивалентным объемом этилового спирта, который добавляют четырьмя равными порциями, суспензию охлаждают до 4-6°С и выдерживают 12 ч, образовавшийся желтый осадок отфильтровывают, промывают этиловым спиртом и сушат в вакууме при комнатной температуре до постоянного веса.