МЕТОД ПЕРВИЧНОЙ ИЗОЛЯЦИИ ШТАММОВ ВИРУСА РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ШТАММ ВИРУСА BOVINE RESPIRATORY SYNCITIAL VIRUS ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2012 года по МПК C12N7/00 A61K39/155 C12R1/93 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к проблеме диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, и предназначено для разработки диагностических препаратов. Известно относительно немного штаммов вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. Количество штаммов возбудителя в нашей стране ограничено, что может сдерживать разработку вакцин и диагностических препаратов. Описана первичная изоляция вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в первично-трипсинизированной культуре клеток почки эмбриона коровы (см. Z.Pospisil, J.Mensik, L.V.Alicek Isolation and identification of a bovine respiratory syncytial virus in Czechoslovakia // Acta Vet. Brno, Vol.47, 1978, P.79-86). Цитопатическое действие вируса при использовании этой культуры для первичного выделения вируса из проб биоматериала наблюдали через 5-7 пассажей. Идентификацию выделенного вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота осуществляли методом иммунофлуоресценции, а также в реакции нейтрализации и электронной микроскопией. Применение этого метода связано со сложностями получения первично-трипсинизированной культуры клеток, а идентификация выделенного изолята возможна только при использовании нескольких методов: реакции нейтрализации, метода иммунофлуоресценции и электронной микроскопии. Это является достаточно трудоемкой, дорогостоящей процедурой, трудно применимой в повседневной работе диагностической ветеринарной лаборатории. Нужны новые, современные, более быстрые и специфичные методы.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту является штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции, выделенный в перевиваемой культуре клеток почки теленка (MDBK) из проб носовых и фарингеальных выделений на 10 пассаже (см. C.W.Arns, J.Campalans, S.C.Costa et al. Characterization of bovine respiratory syncytial virus isolated in Brazil // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. - 2003. - Vol.36 (2). - P.213-218).

Однако предложенный способ первичной изоляции вируса респираторно-синцитиальной инфекции трудоемок и длителен.

Задачей изобретения является расширение арсенала способов первичной изоляции штаммов вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и штаммов вируса Bovine Respiratory Syncitial Virus для изготовления диагностических препаратов.

Сущность изобретения заключается в том, что предложен способ первичной изоляции вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, включающий заражение культур клеток биологическим материалом, зараженным или подозрительным на заражение вирусом, согласно изобретению первичная изоляция вируса происходит путем заражения первично-трипсинизированной культуры клеток тестикул бычка.

Сущность изобретения заключается также в том, что проводят адсорбцию зараженного материала в культуре клеток, предварительно обработанной диметилсульфоксидом (DMSO).

Сущность изобретения заключается в том, что получен штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, выделенный предложенным методом, характеризующийся высокой способностью продуцироваться в культуре клеток тестикул эмбрионов бычка (ТЭБ), депонированный в Коллекцию культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером V-406, пригоден для получения диагностических, профилактических препаратов.

Штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота К18 (V-406) выделен в период вспышки массовых респираторных болезней среди телят в Республике Казахстан Североказахстанской области (Кызылжарский район) из гомогената легких теленка, положительного на РНК вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, по данным полимеразной цепной реакции (ОТ ПЦР).

Для изоляции вируса использовали свежеприготовленную суспензию культуры клеток тестикул бычка. Суспензия содержала 5×10⁶ клеток в 1 мл питательной среды Игла MEM с добавлением антибиотиков и ферментов. Подготовленную суспензию первично-трипсинизированных клеток разливали в 24-луночные планшеты по 200 мкл на лунку, культивировали в условиях СО₂ - инкубатора в атмосфере с 5% СО₂ в течение 48 часов. После чего удаляли питательную среду и вносили по 2 мкл диметилсульфоксида (DMSO) и 20 мкл каждого из подготовленных гомогенатов проб биоматериала от телят. На каждую пробу использовали по 3 лунки с монослоем клеток. Часть лунок с монослоем клеток оставляли в качестве контролей. Планшеты в течение 60 мин оставляли при комнатной температуре для адсорбции вируса. По истечении этого времени в лунки с монослоем клеток добавляли по 0,4 мл среды Игла MEM и инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. Проводили 8 последовательных пассажей в первично-трипсинизированной культуре клеток, с адсорбцией зараженного материала в культуре клеток, предварительно обработанной диметилсульфоксидом (DMSO). Вирус респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота выделен на 8 пассаже.

Полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) использовали для определения генома вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в образцах проб, отобранных из зараженных первично-трипсинизированных культур клеток тестикул бычка и перевиваемых культур клеток ТЭБ.

Таким образом, использование первично-трипсинизированных культур клеток тестикул бычка, предварительно обработанных диметилсульфоксидом, для первичной изоляции вируса позволило выделить инфекционный вирус респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота К18.

Идентификация штамма К18

Идентификация штамма была проведена методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров на ген гликопротеина F вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, обладающего высокой консервативностью. Подбор праймеров и расчет условий и кинетики диагностической ОТ-ПЦР осуществляли с помощью компьютерной программы «Vektor NTI Suite» и опытным путем. ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе марки «Терцик».

Штамм К18 депонирован в Коллекцию культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, регистрационный номер V-406.

Физико-химические признаки

Вирус высоко чувствителен к эфиру, хлороформу, дезоксихолату натрия, трипсину. Полностью разрушается при температуре 56°С в течение 30 мин. При фильтрации вируссодержащей суспензии через фильтры размером 150 нм снижения инфекционного титра не наблюдали. Это свидетельствует о том, что штамм вируса имеет размеры до 150 нм.

На основании анализа первичной структуры РНК, антигенных признаков выделенный штамм вируса отнесен к семейству Paramyxoviridae.

Антигенные свойства

Антигенные свойства штамма К18 (V406) изучены в реакции нейтрализации (РН) и реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Реакцию нейтрализации ставили с разведениями сывороток 1:10 и с десятикратными разведениями вируссодержащего материала. Реакцию нейтрализации учитывали по индексу нейтрализации.

Иммуногенные свойства

Высокие антигенные свойства штамма К18 (V406) позволяют использовать его для получения иммуногенных сывороток. Показано, что однократное заражение телят инактивированным ультрафиолетом вируссодержащим материалом позволяет выявлять на 14-16 сутки антитела к вирусу респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в сыворотке крови, активно реагирующие в РНГА (титры антител 1:16-1:32).

Диагностический препарат - антиген из штамма К18 (V406) получают путем роллерного культивирования вируса в культурах клеток ТЭБ с последующим осветлением культуральной жидкости и концентрированием полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 дальтон в концентрации 7%. Очистка вируса равна 90,5%, а потеря 6,5%. Переосаждение осадка проводили ультрацентрифугированием при 90000g в течение 5 часов и осаждением полученного материала на градиентную интерфазу сахарозы.

Пример 1

Метод изоляции вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. С этой целью используют монослой первично-трипсинизированной культуры клеток тестикул бычка, выращенный на среде Игла MEM с добавлением 100 ЕД пенициллина и стрептомицина, для выделения вируса респираторно-синцитиальной инфекции проводят инфицирование монослоя клеток в объеме 1-2 мл пробами биоматериала в объеме до 0,2-0,4 мл в 25 см³ флаконах с последующей 60-минутной адсорбцией вируса. Перед внесением проб биоматериала во флакон 25 см³ с монослоем культуры клеток вносят 0,05-0,1 мл диметилсульфоксида (ДМСО). По окончании периода адсорбции вируса объем вируссодержащей суспензии во флаконе доводят средой Игла MEM с добавлением антибиотиков и инкубируют в термостате при 37°С до проявления цитопатического действия вируса. Проводят 8 слепых пассажей.

Пример 2

Получение вируссодержащей культуральной жидкости, необходимой для производства диагностических препаратов на основе предлагаемого высокопродуктивного вируса респираторно-синцитиальной инфекции. В качестве материала для исследований за отсутствием аналога предлагаем штамм К18 (V406), которым заражали монослой культур клеток ТЭБ, выращенный роллерным способом. Для заражения используют 1-2 ТЦД₅₀ на клетку и после часового контакта клетки трижды отмывают от не адсорбированного вируса, после чего вносят ростовую среду Игла MEM с 2% сыворотки эмбриона телят и инкубируют на роллерной установке при 37°С в течение 24-48 часов, когда в культурах будут отмечены отчетливые явления цитодеструктивного действия вируса.

Пример 3

Получение специфических гипериммунных сывороток к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота на баранах и кроликах. Для получения гипериммунных сывороток использовали штамм К18 вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. Вирус культивировали в перевиваемой культуре клеток ТЭБ. Для культивирования вируса в культурах клеток использовали питательную среду Игла МЭМ с добавлением 2% эмбриональной сыворотки крови и антибиотиков по 100 ЕД/мл. Применяли вирус с инфекционной активностью 3,0-4,0 lg ТЦД 50/мл (тканевая цитопатическая 50% доза). Инфекционную активность вируса определяли титрованием в чувствительных культурах клеток по цитопатическому действию (ЦПД). Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча. Кролику вирус вводили трижды с интервалом в 14 дней по 2 мл, предварительно обработанного ультразвуком с адъювантом Фрейнда 1/1 внутримышечно. Через две недели брали кровь из вены уха, получали из нее сыворотку крови, которую исследовали в РНГА. Активность полученных гипериммунных сывороток определяли в РНГА. Постановку реакции осуществляли по общепринятой методике в соответствии с наставлением. Титр антител к штамму вируса респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота К18 в сыворотке крови барана составил 1:2048, в сыворотке крови кролика составил 1:1024.

Таким образом, высокопродуктивный штамм РСИ может быть использован для производства диагностических препаратов.

Таким образом, предлагаемый способ первичной изоляции позволяет выделять вирусы респираторно-синцитиальной инфекции. Штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции К18 (V406), первичную изоляцию которого провели с помощью этого способа путем заражения первично-трипсинизированной культуры клеток тестикул бычка, предварительно обработанной диметилсульфоксидом, характеризуется высокой способностью репродуцироваться в этой культуре клеток, а также - в перевиваемой культуре клеток ТЭБ, способностью индуцировать вируснейтрализующие антитела. Высокая антигенная активность этого штамма позволяет его использовать для получения иммуногенных сывороток. Штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции К18 (V406) пригоден для получения диагностических, профилактических препаратов.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Первичная изоляция штамма вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота происходит путем заражения первично-трипсинизированной культуры клеток тестикул бычка. Для инкубации зараженной культуры используют поддерживающую среду Игла MEM с добавлением пенициллина и стрептомицина. Также получен штамм K18 V406, выделенный описанным выше методом. Штамм характеризуется высокой антигенной активностью, а также способностью индуцировать вируснейтрализующие антитела. Штамм может быть использован для приготовления диагностических препаратов. 2 н.п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ первичной изоляции штамма вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, включающий заражение культур клеток биологическим материалом, зараженным или подозрительным на заражение вирусом, отличающийся тем, что первичная изоляция вируса происходит путем заражения первично-трипсинизированной культуры клеток тестикул бычка, предварительно обработанной диметилсульфоксидом (DMSO).

2. Штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, выделенный методом по п.1, характеризующийся высокой способностью продуцироваться в культуре клеток тестикул эмбрионов бычка (ТЭБ), депонированный в Коллекцию культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером V-406, пригодный для получения диагностических и профилактических препаратов.