СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ГОРТАНИ ПЛОДОВ СВИНЬИ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИИ Российский патент 2024 года по МПК C12N5/71 

Область применения

Изобретение относится к вирусологии, в частности к области культивирования клеток и тканей с целью наработки и изучения вирусов, и может быть использовано для изучения биологии вирусов, в диагностических исследованиях и в качестве тест-объектов для оценки безопасности и эффективности новых лекарственных препаратов. Штамм культивируется на смеси питательных сред: 0,5% ГЛА и Игла МЕМ (1:1) с 10% заменителем сыворотки NuSera, свободен от вирусной и бактериальной контаминации.

Уровень техники

Диплоидные клетки имеют более стабильные свойства и более постоянную фенотипическую характеристику, что обеспечивают более предсказуемые результаты в исследованиях и экспериментах. При этом использование сывороток крупного рогатого скота может быть токсична для клеток, может служить источником контаминации клеток агентами вирусной этиологии и микоплазмами, 80-90% серии сывороток содержат неспецифические ингибиторы противовирусной активности [2]. В связи с этим получение новых диплоидных клеточных штаммов, свободных от контаминантов и чувствительных к возбудителям вирусных болезней, является актуальным.

Известен штамм диплоидных клеток легкого плода крупного рогатого скота (ЛЭК) для репродукции вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ), вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота (ПГ-3), вируса диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС). Штамм представлен клетками клетки фибробластоподобного типа, поддерживается на среде, состоящей из ГЛА и Игла MEM (1: 1) с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. [3].

Недостаток этой культуры состоит в отсутствии чувствительности к вирусам человека.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является диплоидная линия клеток легких эмбриона человека (ЛЭЧ-4(81). Штамм представлен фибробластоподобными клетками, среда роста МЕМ и гидролизат лактальбумина (1:1) с 10% сывороткой крупного рогатого скота. Штамм (ЛЭЧ-4(81). Отличается выраженной чувствительностью к вирусам респираторной группы аденовирусу типа 7 и респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ). Максимальный титр накопления аденовируса в культуре составлял 6,0-6,5 Lg ТЦД через 96 ч после заражения, а РСВ - 5,0-5,5 Lg ТЦЦ о/цдл этот же срок.

Данная линия клеток имеет существенный недостаток, такой как получение и использование клеток эмбриона человека и культивирование с сывороткой крупного рогатого скота [4].

Задача изобретения: получение нового штамма диплоидной клеточной культуры животного происхождения чувствительной к наиболее актуальным в настоящий период вирусам гриппа A, гриппа В, респираторно-синцитиальному вирусу (hRSv), аденовирусу (hAdv).

Технический результат: получение штамма монослойной диплоидной культуры клеток гортани плодов свиньи, чувствительных к вирусу гриппа A, гриппа В, респираторно-синцитиальному вирусу (hRSv), аденовирусу (hAdv), адаптированного к использованию для культивирования клеток заменителем сыворотки NuSera.

Штамм является новым, свободным от контаминации вирусами, микоплазмами, бактериями, грибами, клетками других видов животных. Он представляет собой биобезопасный субстрат для культивирования вирусов человека, обеспечивающий высокий уровень их репродукции. Культура клеток штамма ГПС пригодна для диагностики вирусных инфекций, в частности выделения вирусов из патологического материала.

Сущность изобретения состоит в том, что за основу взяты хорошо сформированные плоды свиньи II-го триместра развития, из которых в стерильных условиях извлекают гортань трипсинизируют и помещают в смесь питательных сред 0,5% ГЛА и игла МЕМ (1:1). В результате получают монослой клеток органа животного происхождения, чувствительный к вирусам гриппа A, гриппа В, респираторно-синцитиальному вирусу (hRSv), аденовирусу (hAdv), что позволяет решить ряд этических и экономических проблем, связанных с использованием эмбрионов человека, и увеличивает выход биологического материала в 4 раза благодаря использованию плодов свиньи вместо эмбрионов.

Заявляется способ получения штамма диплоидной культуры клеток гортани плодов свиньи (ГПС), чувствительной вирусам гриппа A, гриппа В, респираторно-синцитиальному вирусу (hRSv), аденовирусу (hAdv) заключающийся в том, что в результате субкультивирования первично-трипсинизированных клеток ГПС получен новый штамм клеток гортани животного происхождения. Экспланты гортани плодов свиньи отмывали раствором Хенкса и проводили дезагрегацию ткани. Полученные клетки выращивали на смеси питательных сред: 0,5% ГЛА и Игла МЕМ (1:1) с 10% заменителем сыворотки NuSera, образование сплошного монослоя происходило на 4-5 сутки с плотностью кл/, предел культивирования клеточной линии составил 26 пассажей; для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:3 при температуре +37°С, для криоконсервирования при температуре - 196°С используют 95% заменитель сыворотки NuSera,с добавлением 5% DMSO, при концентрации клеток 2-3 х10⁶ в мл.

В результате получают диплоидный штамм культуры клеток ГПС, чувствительный к вирусам гриппа A, гриппа В, респираторно-синцитиальному вирусу (hRSv), аденовирусу (hAdv).

Реализация изобретения:

Диплоидный штамм клеток ГПС получают методом «щадящей» трипсинизации из гортани плодов свиньи II-триместра супоросности [5]. Изъятие и транспортировку матки с плодами проводят при соблюдении принципов этического кодекса «Международных рекомендаций по проведению биомедицинских исследований с использованием животных» (CIOMS).

Штамм выращивается на смеси питательных сред: 0,5% ГЛА и Игла МЕМ (1:1) с 10% заменителем сыворотки NuSera. Предел культивирования ГПС составляет 26 пассажа. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:3 при температуре +37°С. Для криоконсервирования при температуре - 196°С используют 95% заменитель сыворотки NuSera, с добавлением 5% DMSO, при концентрации клеток 2-3 х10⁶ в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения в жидком азоте составляет 88%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течений 2-3 пассажей.

Культура ГПС заложена на хранение в Главный банк культур на 5 пассаже в количестве 71 криопробирок и в Рабочий банк культур на 10 пассаже в количестве 58 криопробирок.

Предложенный штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Клеточный пласт состоит из тесно прилегающих друг к другу полигональных клеток с четко выраженными границами. В популяции преобладают клетки фибробластоподобного типа, ядра овальной или округлой формы, находятся в центре клетки, содержат по 1-2, реже 3 ядрышка. Цитоплазма гомогенная, базофильная. Аномальных форм митоза до 23,3%. Число 2-3-ядерных клеток до 2,2%.

Кариологические признаки. Модальный класс с числом хромосом (2n = 38) составил 86% исследованных метафаз с разбросом числа хромосом в пределах 36-80.

Видовая принадлежность. Свинья, подтверждена кариологически.

Контроль контаминации. При обследовании клеток ГПС на стерильность (бактерии, грибы, микоплазма) - отрицательно.

Чувствительность к вирусам: гриппа A, гриппа В, респираторно-синцитиальному вирусу (hRSv), аденовирусу (hAdv).

Получение штамма. Предложенный штамм ГПС получали следующим образом.

Гортань плода свиньи отделяют от глотки и трахеи. Освобождают от хрящей. Далее дезагрегацию ткани проводят 0,25% раствором трипсина длительностью 10 мин., чередованием с 0,5% ГЛА на магнитной мешалке при 37°С 6-8 раз. Центрифугирование клеток проводят при 1500 при об/мин в течений 10 минут, супернатант сливают, а клеточный осадок ресуспендируют. Клетки высевают на пластиковые флаконы объемом 175 см3 с плотностью посева 500-800тыс. клеток/мл. в ростовой среде 0,5% ГЛА и Игла МЕМ в равном соотношении (1:1) с добавлением 10% заменителем сыворотки NuSera. Матрасы помещают в CO2-инкубатор с автоматическим регулированием и контролем температуры +37,0°С, повышенным до 5% содержанием СО₂ и относительной влажностью 90%. Изначально большой объем клеток предполагает пассивную стратегию культивирования. В дальнейшем используют культуры клеток с конфлюэнтным монослоем, снимают раствором трипсин/Версена (1:3) и рассевают в новые флаконы (матрасы). Кратность рассева 1:2-1:3. Срок формирования монослоя 4-5 сут.

Пример №1. Культивирование вируса гриппа А/Brisbane/02/2018 H1N1pdm09.

В культуру клеток ГПС со сформированным монослоем вносили по 200 мкл. вируссодержащей культуральной жидкости (вирус гриппа А/Brisbane/02/2018 H1N1pdm09, гриппа В/Washington/02/2019 в инфекционном титре 10² TCID50/мл.). Для адсорбции вируса пробирки убрали в инкубатор CO2 на 30 мин. В инфицированную культуру вносили поддерживающую среду и культивировали при температуре +37°C в течение 3-5 сут. Первые признаки ЦПД - формирование округлых пикнотических клеток наблюдали через 48 часов, максимальное ЦПД - через 72 часа после заражения. Инфекционный титр Influenza virus А- 10⁶ TCID50/мл.

Репликация РНК вируса гриппа А/Brisbane/02/2018 H1N1pdm09 была подтверждена методом ПЦР, пороговый цикл Ct составил 11,02 [6].

Уровень репродукции вируса гриппа А/Brisbane/02/2018 H1N1pdm09 свидетельствовал о высокой чувствительности культуры клеток ГПС.

Пример №2. Культивирование вируса гриппа В/Washington/02/2019.

В культуру клеток ГПС со сформированным монослоем вносили по 200 мкл. вируссодержащей культуральной жидкости (вирус гриппа В/Washington/02/2019) в инфекционном титре 10² TCID50/мл.). Для адсорбции вируса пробирки убрали в инкубатор CO2 на 30 мин. В инфицированную культуру вносили поддерживающую среду и культивировали при температуре +37°C в течение 3-5 сут. Первые признаки ЦПД - формирование округлых пикнотических клеток наблюдали через 48 часов, максимальное ЦПД - через 72 часа после заражения. Инфекционный титр вируса гриппа В/Washington/02/2019 достигал максимальных значений - 10⁷ TCID50/мл.

Репликация РНК штамма вируса гриппа В/Washington/02/2019 подтверждена методом ПЦР, значение порогового цикла составило 21,07 [6].

Уровень репродукции вируса гриппа В/Washington/02/2019 свидетельствовал о высокой чувствительности культуры клеток ГПС

Пример №3. Культивирование респираторно-синцитиального вируса (hRSv).

В культуру клеток ГПС со сформированным монослоем вносили hRSv, полученный из клинического материала больного ОРВИ на культуре клеток HeLa, в количестве 200 мкл., инфекционный титр 10² TCID50/мл. Адсорбцию вируса проводили в течение 30 минут. Далее в инфицированную культуру вносили поддерживающую среду и культивировали при температуре +37°C в течение 3-5 сут. Индикация вируса в культуральной жидкости оценивалась под микроскопом по наличию специфического цитопатического эффекта, заключающегося в образовании клеточного синцития. Первые признаки ЦПД наблюдали через 48 часов после заражения. Выраженное ЦПД регистрировали через 72-96 часов после заражения. Инфекционный титр вируса hRSv составлял 5-5,5 lgTCID50/мл на 6 сутки после заражения.

Репликация РНК штамма вируса hRSv подтверждена методом ПЦР [7].

Величина порогового цикла амплификации РНК (Ct) в пробах третьего пассажа клинического изолята респираторно-синцитиального вируса (hRSv) на ГПС составила 7,9, таким образом, уровень репродукции вируса hRSv свидетельствовал о высокой чувствительности культуры клеток ГПС.

Пример №4. Культивирование аденовируса (hAdv).

В культуру клеток ГПС со сформированным монослоем вносили hAdv, полученный на культуре клеток HeLa при культивировании клинического материала от больного ОРВИ ребенка. Вируссодержащую жидкость вносили в объеме 200 мкл., инфекционный титр при заражении составлял 10² TCID50/мл. Адсорбцию вируса проводили в течение 30 мин. В инфицированную культуру вносили поддерживающую среду и культивировали при температуре +37°C в течение 3-5 сут. Первые признаки ЦПД - скопления округлых клеток, образование пустот - наблюдали через 48 часов после заражения. Выраженное ЦПД (большинство клеток монослоя представлено гроздьевидными скоплениями) регистрировали через 72-96 часов после заражения. Инфекционный титр вируса составлял 4,0-4,5 lg TCID 50/мл на 5-6 сутки после заражения.

Репликация РНК штамма вируса hAdv на культуре клеток ГПС подтверждена методом ПЦР [7]. Величина порогового цикла амплификации РНК (Ct) в пробах третьего пассажа клинического изолята аденовируса (hAdv) на ГПС составила 11,39.

Уровень репродукции вируса hAdv свидетельствовал о высокой чувствительности культуры клеток ГПС.

Культура ГПС является пригодной для вирусовыделения.

Как видно из приведенных примеров, штамм является новым, свободным от

контаминации вирусами, микоплазмами, бактериями, грибами, клетками других видов

животных. Он представляет собой биобезопасный субстрат для культивирования

вирусов человека, обеспечивающий высокий уровень их репродукции. Культура клеток штамма ГПС пригодна для диагностики вирусных инфекций, в частности выделения вирусов из патологического материала.

Охарактеризованный штамм выделен из гортани плода свиньи и депонирован в криохранилище банка-музея клеточных культур ФБУН ФНИИВИ «Виром» Роспотребнадзора г. Екатеринбург, входящего в состав «Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных медицинского назначения» Российской коллекции клеточных культур (РККК) [1], идентификатор «20180716».

Штамм хранится в специализированной «Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных медицинского назначения», идентификатор «20180716». Предложенный штамм клеток гортани плодов свиньи найдет применение в научно-исследовательских учреждениях, диагностических лабораториях, биологической промышленности.

Источники информации

1.Российская коллекция клеточных культур ФГБУН Институт цитологии Российской академии наук, URL: https://incras.ru/rossijskaya-kollektsiya-kletochnyh-kultur/?ysclid=lnjqheafh3716362248

2 Анализ контаминации клеточных культур пестивирусом BVDV и микоплазмами/ Урываев Л.В., Ионова К.С., Дедова А.В. и др.// Вопросы вирусологии. - 2012. - № 57(5). - С.15-21

3. Авторское свидетельство № 2 515915 . Опубликовано 20.05.2014г.

Гальнбек Т.В. Шуляк А. Ф., Кулешов К. В. Щукина И. В. Штамм диплоидных клеток легкого плода крупного рогатого скота для репродукции вирусов https://yandex.ru/patents/doc/RU2515915C1_20140520.

4. Авторское свидетельство №1147748, опубликовано: 30.03.1985 г. Глинских Н.П., Колесникова Г.Г., Устьянцев В.П. Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека лэч-4(81), используемый для диагностики вирусных инфекций.

https://findpatent.ru/patent/114/1147748.html

5. Момот Ю.А. К развитию эмбрионов свиньи крупной белой породы // Аграрный вестник Урала. - № 11-2(77). - 2010 г. - С. 36.6. https://www.amplisens.ru/upload/iblock/51b/Influenza%20virus%20A-B-FL.pdf?ysclid=lnll4vuzfp901082682

7. https://www.amplisens.ru/upload/iblock/dd0/oqo8bpquxascrs4ex30o3m77alyzk4i7/ORVI-skrin-FL(1).pdf

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу культивирования штамма диплоидной культуры клеток гортани плодов свиньи, чувствительной к вирусам гриппа A, гриппа В, респираторно-синцитиальному вирусу (hRSv), аденовирусу (hAdv). Указанный способ заключается в том, что экспланты гортани плодов свиньи отмывают раствором Хенкса и проводят дезагрегацию ткани, полученные клетки выращивают на смеси питательных сред с 10% заменителем сыворотки NuSera, образование сплошного монослоя получают на 4-5 сутки, предел культивирования клеточной линии составляет 26 пассажей. Изобретение обеспечивает культивирование штамма, свободного от контаминации вирусами, микоплазмами, бактериями, грибами, клетками других видов животных, представляющего собой биобезопасный субстрат для культивирования вирусов человека и обеспечивающего высокий уровень их репродукции. 4 пр.

Способ культивирования штамма диплоидной культуры клеток гортани плодов свиньи, чувствительной к вирусам гриппа A, гриппа В, респираторно-синцитиальному вирусу (hRSv), аденовирусу (hAdv), заключающийся в том, что экспланты гортани плодов свиньи отмывают раствором Хенкса и проводят дезагрегацию ткани, полученные клетки выращивают на смеси питательных сред: 0,5% ГЛА и Игла МЕМ 1:1 с 10% заменителем сыворотки NuSera, образование сплошного монослоя получают на 4-5 сутки с плотностью 2,3×10⁵ кл/см², предел культивирования клеточной линии - 26 пассажей; для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:3 при температуре +37°С, для криоконсервирования при температуре –196°С используют 95% заменитель сыворотки NuSera с добавлением 5% DMSO при концентрации клеток 2-3×10⁶ в 1 миллилитре.