СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 1999 года по МПК G01N33/543 A61K39/385 G01N33/531 G01N33/551 G01N33/569 C12N11/14 

Изобретение относится к иммунохимии, микробиологии и может быть использовано в производстве иммуносорбентов для выявления специфической реакции антиген-антитело.

Известен способ получения иммуносорбента на основе целлюлозы, включающий ковалентное связывание белкового лиганда с носителем. Недостатком способа является низкий уровень специфичности сорбента, кроме того, органический носитель непрочен, подвержен разрушению при воздействии микроорганизмов (К.Л. Шаханина и соавт. Приготовление различных иммуносорбентов и их использование для выделения антигенов и антител. Ж. Вопросы мед.химии, N 6, 1976. - С. 127-136).

Перспективными для применения в методах иммуноанализа являются твердофазные носители, в том числе различные гранулированные сорбенты, а в последнее время сорбенты с магнитными свойствами.

Основными требованиями к таким сорбентам являются их инертность по отношению к биологическим препаратам, стабильность свойств, механическая прочность, достаточная сорбционная емкость при иммобилизации лигандов. Наиболее прочное присоединение лигандов к поверхности соpбентов обеспечивается ковалентной связью, которая осуществляется предварительной активацией поверхности сорбентов, например глутаровым альдегидом (В.И.Ефременко, В.Г.Пушкарь и др. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов. ЖМЭИ, N 12, 1989, c. 100-104).

Известен способ получения иммуносорбента, включающий активацию аминопропилсилохрома глутаровым альдегидом в концентрации 12,0-13,0% в течение 2 ч при комнатной температуре и pH 8.0 с последующим ковалентным связыванием белка A из Staphylococcus aureus и промывкой (a.с. СССР N 1517545, G 01 N 33/53, 15.12.93, Бюл. N 45-46).

Используемый в качестве носителя аминопропилсилохром (производства Олайненского завода химреактивов) является дефицитным, активирующий агент недостаточно прочно закрепляется на поверхности носителя, так как глутаровый альдегид гидролизуется в водной среде, что приводит к неспецифической сорбции и снижению стабильности в биоспецифических процессах.

Кроме того, полученный по этому способу иммуносорбент имеет недостаточную специфическую емкость и чувствительность в иммуноанализе. Способ не предусматривает получение иммуносорбента с магнитными свойствами.

Известны способы получения иммуносорбентов с магнитными свойствами.

Способ эмульсионной полимеризации, по которому в реакционную смесь сомономеров полиакриламида и катализатора включают магнитный порошок и лиганд (иммуноглобулины). При этом происходит механическое включение биологически активных веществ в ячеистую структуру полиакриламидного геля (Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций. Тезисы докладов Всесоюзной научно-практической конференции, Ставрополь, 1986, c. 50-53).

Недостатком способа является большой расход иммуноглобулинов концентрацией 40 мг/мл по белку, что повышает себестоимость препарата и ограничивает возможность организации промышленного производства.

По другому способу сначала получают магносорбент путем предварительной обработки магнитного порошка с приданием ему коррозийной стойкости и гидрофильности, затем проводят эмульсионную полимеризацию смеси сомономеров полиакриламида и катализатора с обработанным магнитным порошком. Подготовленный магносорбент активируют 5%-ным глутаровым альдегидом в течение 18-20 ч и иммобилизуют специфичными иммуноглобулинами в растворе ФСБ при инкубации в течение 18-20 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп магноиммуносорбенты дополнительно обрабатывают раствором альбумина в течение 1-3 ч (пат. РФ N 2068703, A 61 K 39/385, C 12 N 11/00 // G 01 N 33/53, оп. 10.11.96; Бюл. N 31).

Недостатками способа являются длительность и многостадийность процесса его получения, использование дорогостоящих импортных токсичных реактивов, что ограничивает организацию промышленного производства и ухудшает экологические условия процесса.

Полученные по этому способу иммуносорбенты имеют недостаточную специфическую емкость и чувствительность в иммуноанализах.

Известен способ получения иммобилизованной аминоацилазы, включающий ковалентное связывание фермента с активированным силохромом (а. с. СССР N 1060676, C 12 N 11/14; C 12 N 9/78; оп. 15.12.83, Бюл. N 46).

Силохром обрабатывают аминопропилтриэтоксисиланом и активируют n-бензохиноном. После включения лиганда готовый продукт дополнительно обрабатывают водным раствором глиоксаля с целью предотвращения диссоциации ацилазы и повышения стабильности иммуносорбента.

Недостатком способа является использование дефицитных дорогостоящих препаратов, что затрудняет организацию промышленного производства. Способ не предусматривает получения иммуносорбента с магнитными свойствами.

Целью изобретения является организация промышленного производства иммуносорбентов, в том числе и с магнитными свойствами, с повышенной специфической емкостью и чувствительностью за счет упрощения процесса, использование доступных и недорогих препаратов.

Поставленная цель достигается по двум вариантам.

По первому варианту способ получения иммуносорбентов включает модифицирование носителя, в качестве которого используют алюмосиликат, 0,3-0,4%-ным раствором полиглюкина, высушивание сорбента, активацию его вторичным алкилсульфатом натрия с последующим ковалентным связыванием с лигандом белковой природы.

По второму варианту способ получения иммуносорбентов включает модифицирование носителя, в качестве которого используют смесь алюмосиликата и магнитного порошка, 0,3-0,4%-ным раствором полиглюкина, высушивание сорбента, активацию его вторичным алкилсульфатом натрия с последующим ковалентным связыванием с лигандом белковой природы.

По отношению к прототипу, в качестве которого выбран способ получения иммуносорбента по а. с. СССР N 1517545, G 01 N 33/53, 15.12.93, Бюл. N 45-46, заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Использование в качестве носителя алюмосиликата, который является доступным мелкодисперсным наполнителем, представляющим собой комплексные анионы алюминия и кремния с избыточным отрицательным зарядом, который компенсирован щелочноземельными металлами. Носитель обладает повышенными адгезионными свойствами по сравнению с полиакриламидом и силохромами, что позволяет смешивать его с магнитным порошком без предварительной подготовки последнего.

Модифицирование носителя полиглюкином, который представляет собой полисахарид - линейный полимер на основе циклической формы глюкозы, где звенья связаны 1,6 - гликозидной связью. При обработке носителя на его поверхности образуется полимерная пленка, обеспечивающая повышение интенсивности последующей активации носителя и увеличение специфической емкости сорбента, а соответственно, и его чувствительность в иммуноанализах.

Активация вторичным алкилсульфатом натрия, представляющим собой анионное поверхностно-активное вещество создает на модифицированной поверхности сорбента активные группы, способные к химическому взаимодействию с остатками различных аминокислот белкового лиганда, что способствует повышению специфической емкости и чувствительности иммуносорбента.

Выбор заявляемых пределов концентрации полиглюкина является оптимальным, так, уменьшение его концентрации ниже 0,3% приводит к снижению специфической емкости и чувствительности иммуносорбента, а увеличение выше 0,4% уже нецелесообразно.

Все используемые по заявляемому способу препараты доступны и недороги, способ обеспечивает простую и достаточно экологически безопасную технологию получения иммуносорбентов, в том числе и с магнитными свойствами.

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием полной совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. (вариант 1). 2,5 г алюмосиликатного носителя суспендируют в 40 мл 0,4%-ного водного раствора полиглюкина и выдерживают при температуре 24^oC 1 ч. Полученный сорбент высушивают при 100-110^oC в течение 30 мин. К 1 г полученного препарата добавляют 12 мл 24%-ного раствора хлорида натрия и 1 мл вторичного алкилсульфата натрия, инкубируют смесь 1-2 ч при температуре (37±1)^oC. К 1 мл активированного сорбента приливают 1 мл чумных иммуноглобулинов с концентрацией белка 3,5 мг/мл. Смесь оставляют при (37±1)^oC в течение 1-2 ч, далее надосадочную жидкость удаляют, а иммуносорбент промывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия до "0" экстинции на спектрофотометре. Длительность получения иммуносорбента составляет 3-4 ч.

Результаты определения специфической емкости иммуносорбента проводят методом количественной иммунофлуоресценции (Владимцева И.В., Ефременко В.И., Климова И.М. и др. Лабораторное дело N 7, 1988, с.53-55). К 0,1 мл 10%-ного раствора иммуносорбента приливают 0,2 мл чумного микроба в концентрации 10⁹-10² м. к./мл и инкубируют смесь 1 ч при 24^oC. Далее иммуносорбент отмывают 50 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Вносят 0,2 мл иммуноглобулинов чумных люминесцирующих в рабочем разведении и инкубируют 30 мин. Отмывают сорбент 0,9%-ным раствором хлорида натрия и проводят регистрацию результатов в люминесцентном микроскопе Люмам Р-2 по общепринятой DASS-системе. Параллельно с опытной пробой измеряют люминесценцию контрольной пробы (иммуносорбент без контакта с чумным микробом). Специфическая емкость иммуносорбента выражается в условных единицах (у.е.), которые определяются отношением показателей интенсивности свечений опытной и контрольной проб. Измеренная таким образом емкость иммуносорбента составляет 10 у.е. Чувствительность метода составляет 10² м.к./мл чумного микроба.

Пример 2 (вариант 2). Смесь, состоящую из 2,5 г алюмосиликатного наполнителя и 0,5 г магнитного порошка, суспендируют в 40 мл 0,4%-ного водного раствора полиглюкина и далее выдерживают при температуре 24^oC 1 ч. Полученный сорбент высушивают при 100-110^oC в течение 30 мин. К 1 г полученного препарата добавляют 12 мл 24%-ного раствора хлорида натрия и 1 мл вторичного алкилсульфата натрия, инкубируют смесь 1-2 ч при температуре (37±1)^oC. К 1 мл активированного сорбента приливают 1 мл чумных иммуноглобулинов с концентрацией белка 3,5 мг/мл. Смесь оставляют при (37±1)^oC в течение 1-2 ч, далее надосадочную жидкость удаляют, а иммуносорбент промывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия до "0" экстинции на спектрофотометре. Длительность получения иммуносорбента составляет 3-4 ч.

Специфическая емкость иммуносорбента, измеренная методом иммунофлуоресценции, составляет 10 у.е. Чувствительность метода составляет 10² м.к./мл чумного микроба.

Пример 3. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования сорбента используют 0,4%-ный раствор полиглюкина. Специфическая емкость составляет 10 у. е. Чувствительность метода составляет 10² м.к./мл чумного микроба.

Пример 4. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования сорбента используют 0,3%-ный раствор полиглюкина. Специфическая емкость составляет 9 у.е. Чувствительность метода составляет 10³ м.к./мл чумного микроба.

Пример 5. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но на последнем этапе синтеза к 1 мл активированного носителя приливают 1 мл туляремийных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 3,5 мг/мл. Специфическая емкость иммуносорбента составляет 10 у.е. Чувствительность метода составляет 10² м.к./мл туляремийного микроба.

Пример 6. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 2, но на последнем этапе синтеза к 1 мл активированного носителя приливают 1 мл холерных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 3,5 мг/мл. Специфическая емкость иммуносорбента составляет 10 у.е. Чувствительность метода составляет 10² м.к./мл холерного вибриона.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволит организовать простую, экологически безопасную технологию производства иммуносорбентов, в том числе и с магнитными свойствами, которые по специфической емкости в 3 раза и чувствительности в 100 раз превосходят аналогичные препараты, полученные по известным способам.

Изобретение предназначено для производства иммуносорбентов для выявления специфической реакции антиген-антитело. Изобретение включает модифицирование носителя 0,3-0,4%-ным раствором полиглюкина. Сорбент высушивают и активируют вторичным алкилсульфатом натрия. Активированный сорбент ковалентно связывают с лигандом белковой природы. По первому варианту в качестве носителя используют алюмосиликат, по второму - смесь магнитного порошка и алюмосиликата. Из лигандов белковой природы могут быть использованы, например, иммуноглобулины против возбудителей чумы, холеры или туляремии. Изобретение повышает специфическую емкость и чувствительность иммуносорбента. 2 с.п. ф-лы.

1. Способ получения иммуносорбента, включающий активацию носителя и ковалентное связывание с ним лиганда белковой природы, отличающийся тем, что в качестве носителя используют алюмосиликат, который модифицируют 0,3-0,4%-ным раствором полиглюкина и после высушивания активируют вторичным алкилсульфатом натрия. 2. Способ получения иммуносорбента, включающий активацию носителя и ковалентное связывание с ним лиганда белковой природы, отличающийся тем, что в качестве носителя используют смесь алюмосиликата с магнитным порошком, который модифицируют 0,3-0,4%-ным раствором полиглюкина и после высушивания активируют вторичным алкилсульфатом натрия.