ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus. musculus - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ИВЕРМЕКТИНУ И МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ИВЕРМЕКТИНУ Российский патент 2011 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к гибридомной технологии, и касается получения моноклональных антител к ивермектину с помощью нового штамма гибридных культивируемых клеток (гибридомы) животных. Изобретение может быть использовано при создании диагностикумов и иммунохимических тест-систем для количественного определения соединений авермектинового семейства в биологических жидкостях и тканях животных, санитарно-гигиенической оценки пищевых продуктов и продовольственного сырья.

Авермектины представляют собой семейство структурно родственных соединений, обладающих широким спектром действия и высокой акарицидной, инсектицидной и антигельминтной активностями. Препараты этого класса антибиотиков широко используются в ветеринарной практике и агрономии в качестве антипаразитарного и антигельминтного средства (Putter I., MacConnel J.D., Preiser F.A. et al. Avermectins: novel insecticides, acaricides and nematocides from a soil microorganism // Experientia, 1981; v.37, p.963-964).

Природные авермектины синтезируются микроорганизмами из рода Streptomyces avermitilis при культивировании в глубинных условиях в виде комплекса из восьми близких по строению индивидуальных соединений (патент GB 1573955, 1980). Производные авермектинов получают также традиционными методами химического синтеза. Все авермектины по химическому строению являются 16-членными макроциклическими лактонами (сложными эфирами гидроксиловой кислоты) и отличаются между собой радикалами-заместителями у 5 и 26 атомов углеродного кольца. Индивидуальные соединения, входящие в авермектиновый комплекс, обозначаются символами A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a и B2b. Соединения, обозначаемые как "А" и "В", содержат соответственно метоксильный радикал и группу ОН в положении 5. К сериям "а" и "b" относятся соединения, в которых заместитель R₁ (в положении 25) является соответственно втор-бутильным радикалом и изопропильным радикалом. Цифра 1 в названии указанных соединений показывает, что атомы 22 и 23 связаны двойными связями; цифра 2 показывают, что указанные атомы связаны простой связью и к атому углерода 23 присоединена группа ОН.

В ветеринарной практике нашли применение как авермектиновый комплекс в целом (аверсектин), так и индивидуальные авермектины, содержащиеся в препаративной форме в определенных сочетаниях (абамектин, ивермектин и др.). Наиболее активными являются авермектины группы В1, особенно 22,23-дигидроавермектин В1, получивший название ивермектин. Ивермектин состоит из основного компонента - 22,23-дигидроавермектина B1a и минорного компонента - 22,23-дигидроавермектина B1b, содержащегося в смеси в количестве не более 20%.

Помимо высокой антипаразитарной активности авермектины отличаются токсичностью и способностью аккумулироваться в молоке, органах и тканях животных, что создает угрозу попадания авермектинов в пищу человека и вызывает необходимость создания точных и чувствительных тест-систем для контроля уровня авермектинов в пищевых продуктах и продовольственном сырье.

Одним из перспективных методов определения авермектинов является иммуноферментный анализ (ИФА). Преимущества ИФА заключаются в высокой специфичности, скорости и простоте постановки реакции, сравнительно невысокой стоимости и универсальности применяемого оборудования, возможности автоматизации процедуры анализа. В связи с этим, получение специфических моноклональных антител (МКА) к авермектинам, как основных детектирующих компонентов ИФА, является важнейшей задачей для конструирования иммунохимических тест-систем.

В зарубежной литературе описано получение МКА к конъюгатам ивермектина с тремя различными белками (Douglas J.Schmidt, Carolyn E.Clarkson, Todd A. Swanson, Marie L.Egger, Robert E.Carlson, Jeanette M.Van Emon, and Alexander E.Karu. Monoclonal antibodies for immunoassay of avermectins // Journal of agricultural and food chemistry, 1990, v.38 (8), p.1763-1770).

Однако известные МКА обладают специфичностью только к ивермектину и не распознают другие соединения авермектиновой группы.

Известен штамм гибридных клеток 2F2 животных, депонированный под номером CGMCC NO.1413, продуцирующий МКА к авермектину, но эффективность взаимодействия этих антител с соединениями авермектиного комплекса не известна (Патент CN №1733910, C12N 5/18, опубл. 15.02.2006).

Наиболее близким аналогом является гибридома АТСС № НВ-10294, продуцирующая в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных МКА 3А6-1 Mab, обладающие специфичностью к эпитопу авермектина В1а, В2а и ивермектина (Патент СА №2039541, А61К 39/00, опубл. 06.10.1991).

Недостатком ближайшего аналога является невысокая продуктивность штамма и низкая аффинность МКА по отношению к главным компонентам авермектинового комплекса.

Задачей изобретения является получение высокоактивного и продуктивного штамма гибридных клеток, продуцирующего МКА к соединениям авермектинового комплекса и их производным, для последующего конструирования на их основе высокоспецифичных и стандартных отечественных тест-систем для количественного определения авермектинов в биологических жидкостях и тканях животных, пищевых продуктах и продовольственном сырье.

Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала штаммов гибридом, продуцирующих МКА к авермектинам, а также в расширении спектра группой реактивности полученных МКА к соединениям, входящим в авермектиный комплекс и их производных, и повышении аффинности МКА.

Отечественный штамм гибридомы, продуцирующий МКА для количественного определения различных индивидуальных соединений авермектинового семейства, получен нами впервые.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L. 4C6, депонированный в Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 05/09 является продуцентом моноклональных антител к ивермектину. Моноклональные антитела к ивермектину, продуцируемые штаммом, обладают специфичностью и сродством к основным компонентам авермектинового комплекса, что, в свою очередь, дает возможность определять авермектины в биологических жидкостях и тканях животных, пищевых продуктах и продовольственном сырье животного и растительного происхождения.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L. 4C6 (авторское название) депонирован в Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 05/09 и характеризуется следующими свойствами.

Видовая принадлежность:

Mus musculus

Способ получения штамма:

Штамм получен путем слияния клеток мышиной миеломы SP2/0 с клетками селезенки мышей линии Balb/c, иммунизированных введением внутрибрюшинно очищенного конъюгата ивермектина с белковым носителем - бычьим сывороточным альбумином (ивермектин-БСА). Селекцию гибридом проводят на среде HAT. Штамм синтезирует моноклональные антитела (МКА), специфически взаимодействующие в твердофазном иммуноферментном анализе с ивермектином в составе конъюгата ивермектин-БСА.

Культуральные свойства штамма:

Гибридные клетки растут в виде суспензии in vitro или в виде асцитной опухоли в перитонеальной полости после введения сингенным мышам Balb/c.

Культивирование штамма in vitro:

В качестве ростовой среды используют среду RPMI-1640 («Sigma», США), содержащую 20% фетальной сыворотки теленка (ФСТ), 4,5 г/л глюкозы, 3 мМ глутамина, 0,2 ед./мл инсулина, 60 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂. Для культивирования используют пластиковые планшеты или флаконы объемом 50 и 250 мл (фирма Greiner). Характер роста - стационарная суспензия. Частота пассирования 2-3 суток. Кратность рассева 1:2-1:4.

Культивирование штамма в организме животного in vivo:

За 14 дней до введения клеток штамма гибридомы мышей линии BALB/c предварительно обрабатывают внутрибрюшинно 2,6,10,14-тетраметилпентадеканом (Pristane) («Sigma», США) в дозе 0,3-0,5 мл/животное. Далее праймированным животным вводят в брюшную полость гибридные клетки штамма в дозе (5-10)·10⁶ клеток. Асцитные жидкости, содержащие МКА, получают через 7-15 дней после введения.

Биотехнологическая характеристика штамма (продуктивность):

- титр МКА в культуральной жидкости при выращивании in vitro - 1:500-1:1000 (в ИФА);

- титр МКА в асцитной жидкости при выращивании in vivo - 1:10⁶-1:10⁷ (в ИФА).

Условия хранения и поддержания жизнеспособности штамма:

Штамм сохраняют посредством криоконсервации в жидком азоте. За 24 часа до замораживания клетки гибридомы пассируют с кратностью рассева 1:2. Осажденные центрифугированием (2000 об/мин, 10 мин) клетки суспендируют в криозащитной среде (90% ФСТ, 10% DMSO) и разливают по ампулам в концентрации 3-5 млн/мл, по 1 мл. Выдерживают 24 часа при -70°С, затем переносят в жидкий азот (-196°С).

Восстановление после размораживания:

Быстрое размораживание штамма проводят при 37-39°С. Гибридомные клетки разводят в 10 раз ростовой средой без сыворотки сывороткой эмбрионов коров, осаждают центрифугированием при 1500 об/мин 10 мин и ресуспендируют в ростовой среде, содержащей 20% эмбриональной сыворотки коров в концентрации 3-4×10⁵ клеток/см³. Жизнеспособность восстановленных клеток составляет 70-80% и устанавливается по дифференциальной окраске клеток с использованием 0,4% раствора трипанового синего, рН=7,2-7,3.

Стабильность штамма:

Стабильность продуцирования антител гибридными клетками сохраняется на протяжении 70 пассажей в культуре клеток и 5 пассажей на мышах линии BALB/c.

Контаминация:

Бактерии и грибы в культурах не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на стандартные питательные среды (МПА - для выявления бактерий и агар Сабуро - для грибов). Заражение микоплазмой не выявлено (тест-система Mycoplasma Stain Kit, фирмы Flow Lab.).

Кариотип гибридных клеток штамма мышиный, модальное число хромосом не определялось.

Характеристика продуцируемых МКА к ивермектину:

- мишень - соединения авермектинового ряда;

- специфичность связывания с ивермектином - 100% в конкурентном ИФА;

- перекрестная иммунореактивность к абамектину, авермектину, аверсектину составляет соответственно 50%, 95% и 44% по сравнению с ивермектином в аналогичной концентрации;

- изотип продуцируемых иммуноглобулинов - IgG1 (ИФА, тест-система «Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit» («Sigma», США).

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Получение штамма гибридомы.

Мышей линии BALB/c 3-4 недельного возраста массой 18-20 г, 5-кратно иммунизируют ивермектином, конъюгированным с бычьим сывороточным альбумином (ивермектин-БСА).

Между 1, 2 и 3-ей иммунизациями интервал составляет 2 недели. Четвертую иммунизацию проводят через 3 недели, а 5-ю - через 4 недели после предыдущего введения антигена. Животным вводят внутрибрюшинно конъюгат ивермектин-БСА в концентрации 200 мкг/мышь в смеси с ПАФ («Difco», США) при первой и в смеси с НАФ («Difco», США) при последующих иммунизациях. Бустерная доза (200 мкг/мышь) вводится без адъюванта внутрибрюшинно за 3 дня до выделения селезенки.

Через три дня после введения бустерной дозы антигена получают суспензию клеток селезенки мыши стандартным методом в охлажденной ростовой среде без сыворотки.

Для слияния используют перевиваемую клеточную линию мышиной миеломы Sp2/0, дефектную по гену ГГФРТ, не продуцирующую собственные иммуноглобулины. Гибридизацию проводят по методу [Kohler G., Milstain С., 1979]. Суспензию клеток селезенки и миеломные клетки смешивают в соотношении 5:1 соответственно. После слияния клетки ресуспендируют в селективной среде HAT с 20% кондиционированной среды, вносят в 96-луночные панели в концентрации 1,5×10⁵ клеток в лунку в объеме 0,2 мл. Панели с клетками инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂.

Замену среды в лунках с гибридомными клонами проводят каждые 2-3 дня, используя в течение 14 дней после слияния среду с HAT. Для селекции гибридом, продуцирующих МКА заданной специфичности, из лунок с растущими колониями отбирают культуральные жидкости и тестируют на наличие антител к ивермектину в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА), когда клоны гибридных клеток занимают не менее 50% поверхности лунки. Клоны, обнаружившие специфическую активность, реклонируют методом лимитирующих разведений в 96-луночных панелях с фидерным слоем из перитонеальных макрофагов мышей (5×10⁶ кл/мл, по 50 мкл/лун). Супернатанты из лунок, содержащих реклонированные гибридомы, снова тестируют на наличие антител и их специфичность.

Пример 2. Получение МКА.

Скрининг МКА заданной специфичности и иммунологической активности проводят методом непрямого ИФА. Для этого в лунки иммунологических микропланшетов («Greiner», Германия) вносят 0,1 мл антигена (конъюгат ивермектин-БСА или БСА) в рабочем разведении в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,5. Микропланшеты инкубируют 18 часов при +4°С. Свободные участки пластика блокируют 1% Top Block («Yuro», Швейцария) в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Инкубируют в течение 30 минут при +37°С и вносят в лунки 0,1 мл культуральной жидкости МКА в различных разведениях (с 1:2 до 1:512). Микропланшеты инкубируют 1 час при +37°С и добавляют пероксидазный конъюгат антител к IgG мыши («Sigma», США) в рабочем разведении. Инкубируют 1 час при +37°С. После каждого этапа несвязавшиеся реагенты отмывают ФСБ с добавлением 0,1% Tween-20 (ФСБТ). В качестве хромогена используют тетраметилбензидин (ТМБ). Интенсивность окраски в лунках определяют после остановки реакции 1М H₂SO₄ на спектрофотометре Multiscan MCC («Flow», Англия) при длине волны 450 нм.

Клоны, обнаружившие специфическую активность к конъюгату ивермектин-БСА, но не к чистому БСА, тестируют на специфичность к ивермектину методом конкурентного ИФА.

Для постановки конкурентного ИФА в лунки 96-луночной микропанели, предварительно сенсибилизированные конъюгатом ивермектин-БСА в концентрации 1 мкг/мл, вносят неконъюгированный ивермектин в серийных разведениях (с 2 мкг/мл до 0,031 мкг/мл) и разведенный спирт (в качестве отрицательного контроля) по 50 мкл в лунку. Перед этим навеску (3,4 мг) ивермектина растворяют в 1 мл спирта, а затем разводят ФСБТ до нужной концентрации. Затем сразу вносят по 50 мкл МКА в рабочем разведении на ФСБТ. Содержимое лунок перемешивают. Микропанели инкубируют 1 час при +37°С и добавляют пероксидазный конъюгат антител к IgG мыши («Sigma», США) в рабочем разведении. Инкубируют 1 час при +37°С. В качестве хромогена используют тетраметилбензидин (ТМБ). Интенсивность окраски в лунках определяют после остановки реакции 1М H₂SO₄ на спектрофотометре Multiscan MCC («Flow», Англия) при длине волны 450 нм.

Ингибирование связывания антител с иммобилизованным ивермектином (в составе комплекса ивермектин-БСА) свободным ивермектином (К_инг) вычисляют по формуле

К_инг=100-(А₄₅₀ОП/А₄₅₀К-)×100,

где А₄₅₀ОП - оптическая плотность пробы, содержащей свободный ивермектин.

А₄₅₀К- - оптическая плотность пробы без свободного ивермектина.

Клоны, положительные в данном тесте реклонируют методом лимитирующих разведений в 96-луночных панелях с фидерным слоем из перитонеальных макрофагов мышей (5×106 кл/мл, по 50 мкл/лун). Супернатанты из лунок, содержащих реклонированные гибридомы, снова тестируют на наличие антител и их специфичность. Позитивные реклонированные гибридомы наращивают в культуральных флаконах увеличивающихся размеров (25 см³, 75 см³) («Greiner», Германия).

Пример 3. Оценка возможности использования МКА для детекции ивермектина методом конкурентного ИФА.

В лунки иммунологических планшетов с пресорбированным конъюгатом ивермектин-БСА (10 мкг/мл в 0,1М карбонатном буфере, рН=9,5) вносят по 50 мкл раствора ивермектина с концентрациями 0-1-5-10-20-50-100 нг/мл в ФСБТ-БСА и по 50 мкл на лунку рабочего разведения конъюгата МКА к ивермектину штамма 4С6, конъюгированных с пероксидазой хрена периодатным методом. Планшет встряхивают на шейкере в течение 1 минуты и инкубируют 1 час при +37°С. Планшет промывают 4 раза ФСБТ и добавляют 100 мкл приготовленного хромоген-субстратного раствора с ТМБ. Инкубируют 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляют 100 мкл стоп-раствора для остановки реакции. Оптическую плотность при 450 нм (А₄₅₀) измеряют на спектрофотометре с вертикальным лучом.

Ингибирование связывания антител с иммобилизованным ивермектином (в составе комплекса ивермектин-БСА) свободным ивермектином (К_инг) вычисляют по формуле

К_инг=100-(А₄₅₀ОП/А₄₅₀К-)×100,

где А₄₅₀ОП - оптическая плотность пробы, содержащей свободный ивермектин;

А₄₅₀К- - оптическая плотность пробы без свободного ивермектина.

Результаты представлены на чертеже.

Таким образом, МКА, продуцируемые штаммом 4С6, могут использоваться для количественного определения ивермектина методом конкурентного ИФА с чувствительностью 1 нг/мл.

Пример 4. Оценка перекрестной иммунореактивности с соединениями авермектинового семейства.

Оценку перекрестной иммунореактивности продуцируемых МКА к соединениям авермектиновой группы проводят на основе ИФА с использованием нескольких маркеров специфичности: ивермектина, абамектина, авермектина и аверсектина, используемых в концентрации 50 нг/мл.

Постановку ИФА и определение К_инг проводят так, как описано в Примере 2. Результаты представлены в табл.1.

Табл.1 Иммунореактивность МКА, продуцируемых штаммом 4С6, к соединениям авермектинового семейства. Соединение % специфичности по отношению к ивермектину Ивермектин 100% Абамектин 50% Авермектин 95% Аверсектин 44%

Таким образом МКА, продуцируемые штаммом 4С6, помимо ивермектина, детектируют авермектин, абамектин и аверсектин и могут быть использованы для количественного определения этих соединений методом конкурентного ИФА.

Пример 5. Использование МКА, продуцируемых штаммом 4С6, для количественного определения авермектинов в пробах молока.

Для анализа используют молоко от животных, обработанных и не обработанных (контроль) авермектинсодержащими препаратами. Перед анализом проводят экстракцию авермектинов из молока.

Постановку ИФА и определение К_инг проводят так, как описано в Примере 2. В качестве стандарта используют ивермектин в концентрациях 0-1-5-10-20-50-100 нг/мл. По калибровочной кривой определяют концентрацию авермектинов в экстрактах молока. Результаты представлены в табл.2.

Табл.2 Определение концентрации ивермектина в молоке коров после обработки ивермектином в дозе в дозе 200 мкг/кг Номер животного Концентрация ивермектина С, нг/мл   1 сутки 3 сутки 5 сутки 7 сутки 10 сутки №1 2,9 5,5 5,3 3,8 2,9 №2 3,2 6,1 5,4 3,7 3 №3 2,7 5,4 5,2 3,2 2,5 №4 (контроль) 0 0 0 0 0

Таким образом МКА, продуцируемые штаммом 4С6, могут быть использованы для количественного определения авермектинов в пробах молока методом конкурентного ИФА.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм 4С6 получен путем слияния клеток мышиной миеломы линии SP2/0 с спленоцитами мышей линии Balb/c, иммунизированных введением внутрибрюшинно очищенного конъюгата ивермектин-БСА и депонирован в Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 05/09. Штамм гибридомы 4С6 синтезирует моноклональные антитела (МКА) класса IgG1, специфически взаимодействующие в твердофазном конкурентном иммуноферментном анализе (ИФА) с группой соединений, относящихся к группе авермектинов: ивермектином, авермектином, абамектином, аверсектином. Использование МКА 4С6 в качестве иммунного детектора позволяет проводить количественное определение авермектинов в биологических жидкостях и тканях с высокой чувствительностью (1 нг/мл) и специфичностью. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L., депонированный в Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 05/09 - продуцент моноклональных антител к ивермектину.

2. Моноклональное антитело к ивермектину, характеризующееся следующими признаками: продуцируется штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L., депонированным в Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 05/09, относится к изотипу IgG1, способно распознавать эпитоп соединений авермектинового ряда с перекрестной иммунореактивностью к абамектину, авермектину, аверсектину соответственно 50%, 95% и 44%.