СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПО УРОВНЮ РНК ИНТЕРЛЕЙКИНОВ IL-8 И/ИЛИ IL-18 В ПЛАЗМЕ КРОВИ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/50 C12Q1/68 

1. Область техники.

Изобретение относится к области медицины, онкологии и молекулярной биологии и может быть использовано для малоинвазивной диагностики рака молочной железы.

Уровень техники

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием у женщин: он поражает каждую десятую жительницу развитых стран и занимает лидирующие позиции по смертности вследствие несовершенства ранней диагностики.

Циркулирующие в плазме крови внеклеточные РНК (внРНК) представляют собой информативный и легкодоступный источник генетического материала для медицинской диагностики. Особый интерес вызывает тот факт, что в составе внРНК обнаруживаются тканеспецифичные транскрипты [1, 2], указывая на возможность использования внРНК плазмы крови не только в качестве маркера опухолеобразования, но и как индикатора патологического процесса непосредственно в зоне пролиферации клеток.

В качестве генов, уровень представленности РНК которых в плазме крови мог бы адекватно отражать функциональное состояние организма и динамику развития патологии, могут быть выбраны гены некоторых цитокинов [3]. Цитокины являются медиаторами сложных взаимодействий между иммунной системой организма и растущей опухолью. С одной стороны, цитокины принимают участие в активации противоопухолевого иммунитета, направленного на уничтожение раковых клеток, с другой стороны, цитокины синтезируются самими опухолевыми клетками и участвуют в прогрессии и метастазировании опухолей [4].

При нормальном физиологическом состоянии организма в плазме крови существует определенный профиль представленности РНК цитокинов, отличающийся от цитокинового профиля клеточной фракции [6].

Из литературы известно, что интерлейкины IL-8 и IL-18 непосредственно вовлечены в патогенез РМЖ [18]. IL-18 - один из основных иммунорегуляторных цитокинов, принимающий участие в местном ответе организма на процессы опухолеобразования [7]. Провоспалительный цитокин IL-8 в больших количествах синтезируется клетками самой опухоли и привлеченными в зону роста опухоли клетками иммунной системы [81.

Цитокины, регулируя развитие местных реакций в тканях, характеризуются индуцируемым характером синтеза и локальной продукцией. Это означает, что для определения цитокинового профиля в плазме крови методы белковой химии практически неприменимы. В свою очередь, профиль представленности РНК питокинов в клетках крови не в состоянии отразить состояние этого параметра непосредственно в очаге опухолеобразования. Исследование же тканей опухоли, во-первых, является высокоинвазивным диагностическим методом, а во-вторых, не может быть использовано ни для выявления ранних стадий развития болезни, ни для мониторинга рецидивов.

Наиболее близким аналогом является способ выявления опухоли молочной железы и дифференцировки злокачественных и доброкачественных образований путем измерения 18S рРНК, RASSF8 и Ki-67 методом метилспецифичной ПЦР (Рытова Е.Ю. Циркулирующие внеклеточные ДНК и РНК крови в диагностике опухолей молочной железы. // Биоорганическая химия. 2008, т.54, №1, С.94-103).

Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок не известно использование измерения уровня РНК интерлейкинов IL-8 и IL-18 в плазме крови для диагностики рака молочной железы.

Отличительным признаком изобретения является использование соотношения уровня РНК интерлейкинов IL-8 и/или IL-18 в сравнении с уровнем референсного транскрипта в плазме крови для диагностики рака молочной железы. Диагностическим маркером является соотношение представленности в плазме крови пациента РНК IL-8 и/или РНК IL-18 и любого другого транскрипта (или группы транскриптов), не меняющих уровень представленности в плазме крови при опухолеобразовании, например ABL, HPRT или IL 1b.

3. Описание изобретения

Предложен способ диагностики опухолей человека путем оценки уровня представленности отдельных РНК в плазме крови (внеклеточной фракции).

Техническим результатом изобретения является ранняя диагностика рака молочной железы на основе оценки и сопоставления уровня представленности РНК IL-8 и IL-18 с уровнем РНК ABL, и/или HPRT, и/или IL 1b в плазме периферической крови.

В плазме крови больных РМЖ (даже на ранних стадиях заболевания, например на стадии T1N0M0) существенно возрастает относительное количество РНК IL-8 и IL-18. Так, относительное количество РНК IL-8 и IL-18 существенно превышает относительное количество РНК этих питокинов в плазме крови здоровых индивидов при нормировке по уровню РНК стабильно представленных транскриптов (Рисунок 1). Кроме того, у больных с метастазирующим раком уровень РНК IL-8 в плазме периферической крови выше, чем у больных с ранним раком молочной железы (стадия T1N0M0).

Уровень представленности внеклеточных РНК цитокинов при развитии РМЖ может служить дополнительно исследуемым параметром при диагностике и оценке степени прогрессии заболевания. В частности, уровень РНК интерлейкинов IL-8 и IL-18 позволяет проводить раннюю диагностику РМЖ, делая ее малоинвазивной, а также позволяет осуществлять мониторинг течения заболевания.

Для оценки уровня представленности исследуемых РНК в плазме периферической крови можно использовать биохимические, генетические, молекулярно-биологические и иные методы, а также их сочетания.

В частности, для оценки уровня представленности исследуемых РНК в плазме периферической крови можно использовать методы обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. В том числе метод полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции в режиме «реального времени».

Для клинической диагностики можно использовать определение уровня представленности в плазме крови пациента РНК IL-8 и/или РНК IL-18 относительно любого другого транскрипта (или группы транскриптов), не меняющих уровень представленности в плазме крови при опухолеобразовании.

В частности, можно использовать определение уровня представленности в плазме крови пациента РНК IL-8 и/или РНК IL-18 относительно уровня представленности РНК одного из белков «домашнего хозяйства» (например, ABL или HPRT) и/или РНК цитокина, для которого никаких изменений в случае развития заболевания показано не было (например, IL-lb).

В частности, при сравнении уровня представленности в плазме крови пациента РНК IL-8 относительно уровня представленности РНК HPRT результат исследования считают отрицательным (развитие опухоли не зарегистрировано) при разнице уровней представленности РНК IL-8 и HPRT менее пяти раз. Результат исследования считают положительным (развитие опухоли зарегистрировано) при разнице уровней представленности РНК IL-8 и HPRT более десяти раз. Результат исследования считают недостоверным при разнице уровней представленности РНК IL-8 и HPRT в диапазоне от пяти до десяти раз. Конкретные показатели разницы полученных значений для исследуемых РНК (например, IL-8 и HPRT) могут отличаться от приведенных в примере вследствие различий в методиках и для каждой конкретной методики должны быть подобраны экспериментально.

4. Реализация изобретения

Образцы венозной крови желательно забирать в пробирки с ЭДТА. Процедуру экстракции нуклеиновых кислот желательно начинать не позднее, чем через 2 часа с момента забора крови. Для получения плазмы пробирки с кровью центрифугируют (например, при 400g в течение 20 мин или сопоставимо). После центрифугирования верхнюю фракцию желательно перенести в новую пробирку и вновь центрифугировать при тех же условиях. Выделение РНК проводят методом фенольной экстракции или аналогичным. Полученные препараты РНК желательно сразу использовать для постановки реакции обратной транскрипции.

Для определения уровня представленности исследуемых РНК (например, IL-8 и HPRT) используют метод ПЦР «в реальном времени» в стандартных условиях с праймерами, специфичными к последовательности определяемых РНК. Для исключения коамплификации геномной ДНК желательно расположить праймеры на стыках зкзонов. Желательно, чтобы длины продуктов амплификации всех анализируемых генов отличались друг от друга незначительно и находились в диапазоне 100-300 п.н. Проявку накопления продуктов реакции можно вести как с помощью интеркалирующих красителей, так и с использованием флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов (зондов). Нормированные значения, соответствующие уровню представленности транскриптов каждого гена, можно рассчитывать с помощью метода ΔΔCt или аналогичного.

ЛИТЕРАТУРА

1. Silva JM, Rodriguez R, Garcia JM, Muñoz C, Silva J, Dominguez G, Provencio M, España P, Bonilla F. // Gut. 2002. V.50. P.530-534.

2. Wong SC, Lo SF, Cheung MT, Ng КО, Tse CW, Lai BS, Lee КС, Lo YM. //Clin. Cancer Res. 2004. V.10. P.1613-1617.

3. Dranoff G. // Nat. Rev. Cancer. 2004. V.4. P.11-21.

4. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. Санкт-Петербург: Фолиант, 2008.

5. Турчанинова М.А., Ребриков Д.В. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2009. Т.2. С.22-24.

6. Kurebayashi 1 // Breast Cancer. 2000. V.7. P. 24-129.

7. Merendino RA, Gangemi S, Ruello A, Bene A, Losi E, Lonbardo G, Purello-Dambrosio F. // Int. t Biol. Markers. 2001. V.16. P.126-129.

8. Kozlowski L, Zakrzewska I, Tokajuk P, Wojtukiewicz M. Z. // Rocz. Akad. Med. Bialymst. 2003. V.48. P.82-84.

Изобретение относится к области медицины, онкологии и молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики рака молочной железы. Способ основан на измерении в плазме крови уровня РНК интерлейкинов IL-8 и/или IL-18 и сравнении уровня представленности РНК IL-8 и/или IL-18 с уровнем представленности референсных транскриптов. Для осуществления способа используют обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию в «реальном времени». В качестве референсных транскриптов используют РНК ABL, и/или HPRT, и/или IL 1b. Результат исследования считают положительным при разнице уровней представленности РНК IL-8 и HPRT более десяти раз. Использование заявленного способа позволяет провести раннюю диагностику рака молочной железы. 3 з.п. ф-лы, 1 пр., 1 ил.

1. Способ диагностики рака молочной железы, основанный на измерении в плазме крови уровня РНК интерлейкинов IL-8 и/или IL-18 и сравнении уровня представленности РНК IL-8 и/или IL-18 с уровнем представленности референсных транскриптов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве метода определения уровня РНК интерлейкинов IL-8 и/или IL-18 и РНК референсных транскриптов используют обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию в «реальном времени».

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве референсных транскриптов используют РНК ABL, и/или HPRT, и/или IL lb.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что результат исследования считают положительным (развитие опухоли зарегистрировано) при разнице уровней представленности РНК IL-8 и HPRT более десяти раз.