Способ выявления HER2 положительного молекулярного подтипа рака молочной железы Российский патент 2025 года по МПК G01N33/68 G01N33/574 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для выявления HER2 положительного подтипа еще до проведения операционного вмешательства при раке молочной железы.

Известно, что при раке молочной железы (РМЖ) существуют пять молекулярно-биологических подтипов: люминальный А, люминальный В HER2-отрицательный, люминальный В HER2-положительный, HER2 положительный и базальноподобный, которые отличаются различным исходом РМЖ [Тюляндин С.А., Артамонова Е.В., Жигулев А.Н., Королева И.А., Пароконная А.А., Семиглазова Т.Ю., Стенина М.Б., Фролова М.А. Рак молочной железы. Злокачественные опухоли. 2023. Т. 13. №.3s2-1. С. 157-200]. Одним из наименее благополучных подтипов считается HER2 положительный, который выявляется с помощью иммуногистохимического исследования биоптатов [Тюляндин С.А., Артамонова Е.В., Жигулев А.Н., Королева И.А., Пароконная А.А., Семиглазова Т.Ю., Стенина М.Б., Фролова М.А. Рак молочной железы. Злокачественные опухоли. 2023. Т. 13. №.3s2-l. С.157-200].

Известны методы диагностики рака молочной железы. Например, методы диагностики с использованием наборов реагентов [патент РФ №2523899/ 27.07.2014; CN №102798724А / 28.11.2012; CN №20161403492 / 09.11.2016], обладающих повышенной чувствительностью и специфичностью для иммуногистохимической диагностики. Эти технологии позволяют одновременно выявлять рецепторы эстрогена, прогестерона и HER2-рецепторы. Из перечисленных методов наиболее чувствительным к HER2 положительному раку молочной железы является метод диагностики с использованием реагентов, описанных в патенте CN 20161403492. Однако, несмотря на высокую точность, данный метод имеет ряд недостатков. Для диагностики используются образцы опухоли, что требует инвазивного вмешательства. Кроме того, данный метод осуществляется с использованием трудоемкого процесса, включающего иммуногистохимическое окрашивание, флуоресцентную гибридизацию in situ и двухцветную гибридизацию in situ с окрашиванием серебром.

Известны методы, основанные на определении присутствия и/или количества белка HER2 в образцах рака молочной железы с использованием специфических зондов, которые могут связываться с геномной ДНК [патенты №US 201462009057 / 25.07.2019 и № CN 2016198463 / 04.05.2016]. Несомненным преимуществом таких методов является высокая точность и способность не только выявления HER2 положительного рака, но и прогнозирования ответа на терапию, направленную на HER2. При этом для этих методов также требуются образцы опухоли молочной железы.

Наравне с иммуногистохимическим выявлением пациентов с HER2 положительным раком молочной железы предлагают использовать методы, основанные на радионуклидной диагностике рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu [№2700109/ 18.01.2019; №2762317/ 24.02.2021; №2720801/ 11.02.2019; №2766248/ 11.01.2021; №2800818/ 07.02.2022]. Эти методы основаны на введении пациенту радиофармацевтических препаратов таких, как меченные технецием-99 т адресные молекулы ADAPT6 [№2762317), DARPinG3 (№2720801 и №2800818), DARPin9_29 (№2766248 и №2700109], за которыми следует однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) для оценки накопления радиофармацевтических препаратов в опухоли и расчета вероятности HER2-позитивного статуса рецептора эпидермального фактора роста в опухоли. Несмотря на их эффективность, такие подходы требуют высокоточного, дорогостоящего оборудования и специализированного обученного персонала, что затрудняет их использование в большинстве медицинских учреждений.

Известен способ по патенту № CN 20191420781 / 20.05.2019, использующий комбинацию белков FGF21, SENP2 и CD36 в сыворотке крови пациентов с раком молочной железы для обнаружения пациентов с люминальными и HER2 положительным подтипами, а также эту комбинацию используют для лечения и прогноза рака молочной железы у пациента. В данном способе одновременно выявляется как люминальный, так и НЕР2 положительный подтипы, т.к. недостаточная специфичности к HER2 положительному подтипу РМЖ не дает возможность дифференцировать конкретный подтип и соответственно применить необходимый для каждого подтипа протокол лечения.

В настоящее время для выявления РМЖ определяют концентрации раково-эмбрионального антигена (РЭА, carcinoembryonic antigen, СЕА) в крови. РЭА - гликопротеин, участвующий в клеточной адгезии, его уровни в крови повышаются при многих видах рака. Предполагается, что опухоли продуцируют РЭА для усиления пролиферации и миграции клеток [Hall С, Clarke L., Pal A., Buchwald P., Eglinton Т., Wakeman С, Frizelle F. A review of the role of carcinoembryonic antigen in clinical practice. Ann Coloproctol. 2019. Vol. 35. N. 6. P. 294-305; Wirth Т., Soeth E., Czubayko F., Juhl H. Inhibition of endogenous carcinoembryonic antigen (CEA) increases the apoptotic rate of colon cancer cells and inhibits metastatic tumor growth. Clin Exp Metastasis. 2002. Vol. 19. N. 2. P. 155-160]. РЭА примененяют в качестве критерия эффективности лечения при колоректальном раке [Mahmoud N.N. Colorectal Cancer: Preoperative Evaluation and Staging. Surgical oncology clinics of North America. 2022. Vol. 31. N. 2. P. 127-141], медуллярной карциноме щитовидной железы [Chen Н., Sippel R. S., O'Dorisio M. S., Vinik A. I., Lloyd R. V., Pacak K., & North American Neuroendocrine Tumor Society (NANETS). The North American Neuroendocrine Tumor Society consensus guideline for the diagnosis and management of neuroendocrine tumors: pheochromocytoma, paraganglioma, and medullary thyroid cancer. Pancreas. 2010. Vol. 39. N. 6. P. 775-783], раке легкого [Lei J., Wu L., Zhang N., Liu X., Zhang J., Kuang L., Chen J., Chen Y., Li D., Li Y. Carcinoembryonic antigen potentiates non-small cell lung cancer progression via PKA-PGC-1α axis. Molecular biomedicine. 2024. Vol. 5. N. 1. P. 19] и раке молочной железы [Li X., Dai D., Chen В., Tang H., Xie X., Wei W. Clinicopathological and Prognostic Significance of Cancer Antigen 15-3 and Carcinoembryonic Antigen in Breast Cancer: A Meta-Analysis including 12,993 Patients. Disease markers. 2018. P. 9863092; Seale K. N., Tkaczuk К. H. R. Circulating Biomarkers in Breast Cancer. Clinical breast cancer. 2022. Vol. 22. N. 3.Р.е319-е331].

Известен метод оценки состояния пациенток, раннего выявления прогрессирования опухоли и выбора терапевтических методов при РМЖ основанный на определении в крови РЭА, рекомендованный Европейской группой по онкомаркерам [Molina R., Barak V., van Dalen A., Duffy M.J., Einarsson R., Gion M., Goike H., Lamerz R., Nap M., Soletormos G., Stieber P. Tumor markers in breast cancer-European group on tumor markers recommendations. Tumour Biol. 2005. Vol. 26. N. 2. P. 281-293]. Однако определение концентраций РЭА в крови не позволяет диффенцировать молекулярные подтипы РМЖ. Следовательно, недостатком этого метода является отсутствие данных, которые не позволяют выделять группы больных с HER2 положительным подтипом, который является одним из наиболее злокачественных подтипов.

Наиболее близким к заявленному изобретению в процессе поиска мало инвазивных способов диагностики РМЖ является использование различия в значениях индекса влияния раково-эмбрионального антигена (ИВ_РЭА) на цитокин-продуцирующую функцию иммунокомпетентных клеток крови для дифференциальной диагностики злокачественных, доброкачественных опухолей и предраковых состояний молочной железы. Способ включает забор крови, раздельную инкубацию крови в питательной среде в пробах с добавлением или без добавления РЭА, получение супернатанта в каждой из двух проб с РЭА и без РЭА, определение концентрации цитокина в каждой из проб, вычисление индекса влияния РЭА (ИВ_РЭА) на продукцию цитокина клетками крови по формуле: ИВ_РЭА=А/Б, где А - концентрация цитокина в пробе с добавлением РЭА, Б - концентрация цитокина в пробе без РЭА. Показано, что максимальные значения ИВ_РЭА по различным цитокинам характерны для доброкачественных опухолей молочной железы, минимальные - для предраковых состояний, средние - для РМЖ. При этом в супернатантах определяют концентрацию цитокинов: интерлейкинов (IL) IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, IL-1β IL-1Ra; TNFα, G-CSF (ГК-СФ), GM-CSF (ГМ-КСФ), VEGF и MCP-1 с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Концентрация цитокина в пробе без РЭА отражает спонтанную продукцию цитокина в крови, в пробе с РЭА - индуцированную продукцию цитокина [Аутеншлюс А.И., Кунц Т.А., Карпухина К.В., Михайлова Е.С., Вараксин Н.А., Маринкин И.О. Влияние раково-эмбрионального антигена на продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками крови у больных с опухолями молочной железы // Бюллетень сибирской медицины. 2018. Т. 17 №3. С. 5-12].

Недостатком способа является то, что при определении большого количества цитокинов и соответствующих им ИВ_РЭА, не представлено четких количественных различий по величине ИВ_РЭА для указанных типов опухолей, что затрудняет выявление подтипов РМЖ. Способ не позволяет выявить HER2 положительный подтип РМЖ.

Технологической проблемой является создание малоинвазивного способа, выявления HER2 положительного молекулярного подтипа РМЖ до проведения лечения.

Экспериментально установлено, что величина ИВ_РЭА на продукцию цитокина - гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) позволяет выявлять HER2 положительный молекулярный подтип РМЖ.

Решение технологической проблемы достигается тем, что для выявления HER2 положительного подтипа РМЖ определяют в крови концентрацию ГМ-КСФ; при величине ИВ_РЭА, равной или превышающей 10,4, диагностируют HER2 положительный подтип РМЖ.

Техническим результатом является выявление специфического для HER2 положительного подтипа РМЖ значения индекса влияния РЭА (ИВ_РЭА) на продукцию ГМ-КСФ клетками крови пациентки.

Предлагаемая совокупность существенных признаков обеспечивает высокую точность выявления HER2 положительного подтипа РМЖ при малой инвазивности способа. Использование образцов крови вместо биопсии (образцов опухоли молочной железы) уменьшает дискомфорт, испытываемый пациентами. Кроме того, согласно исследованиям, биопсия молочной железы может стимулировать более высокую частоту опухолевой прогрессии [Збицкая М.А., Важенин А.В. Влияние биопсий опухоли на прогрессирование опухолевого процесса у больных раком молочной железы. Онкология. 2007. Т. 2. С. 67-70], что вероятно связано с увеличением диссеминации раковых клеток, а также изменением опухолевого микроокружения после биопсии, в частности отмечается преобладание М2-подобных макрофагов, способных стимулировать переход раковых клеток из эпителия в мезенхиму и усиливать ангиогенез, что в конечном итоге приводит к усилению метастатического потенциала опухолевого очага из которого была взята биопсия [Kameyama Н., Dondapati P., Simmons R., Leslie М., Langenheim J. F., Sun Y., Yi M., Rottschaefer A., Pathak R., Nuguri S., Fung К. M., Tsaih S. W., Chervoneva I., Rui H., Tanaka, T. Needle biopsy accelerates pro-metastatic changes and systemic dissemination in breast cancer: Implications for mortality by surgery delay. Cell reports. Medicine. 2023. Vol. 4. N. 12. Р. 101330].

Раскрытие сущности изобретения

Способ определения подтипа рака молочной железы (РМЖ), включает забор крови, раздельную инкубацию крови в питательной среде в пробах с добавлением и без добавления раково-эмбрионального антигена (РЭА), получение супернатанта в каждой из двух проб с РЭА и без РЭА, определение концентрации цитокина ГМ-КСФ в каждой из проб, вычисление индекса влияния РЭА (ИВ_РЭА) на продукцию цитокина клетками крови по формуле: ИВ_РЭА=А/Б, где А - концентрация цитокина в пробе с добавлением РЭА, Б - концентрация этого цитокина в пробе без РЭА. При величине ИВ_РЭА, равной или превышающей 10,4, диагностируют HER2 положительный подтип РМЖ.

Инкубацию крови осуществляют в питательной среде DMEM при 37°С в течение 24 часов.

Супернатант получают после завершения инкубации крови путем центрифугирования крови при 3000 об/мин в течение 10 минут и его последующего отбора после осаждения клеток крови.

Определение концентрации ГМ-КСФ осуществляют методом твердофазного иммуноферментного анализа.

Осуществление изобретения

Цельную кровь, взятую из вены пациента в количестве 1 мл, помещают в стерильный флакон с 4 мл среды (стерильная питательная среда DMEM), содержащей гепарин 2,5 МЕ/мл и гентамицин 100 мкг/мл. Аккуратно перемешивают содержимое флакона, затем из него в стерильных условиях забирают 0,980 мл разбавленной крови и помещают ее в стерильный флакон, содержащий 0,020 мл РЭА (Canceroembryonic Antigen Human Colon Adenocarcinoma Cell Line) производства Calbiochem, Германия; концентрация РЭА в разбавленной крови составляет 2 мкг/м. Содержимое флакона аккуратно перемешивают и помещают в термостат при 37°С на 24 часа. Параллельно в тех же условиях инкубируют клетки крови в той же питательной среде без РЭА. В течение первого часа инкубации содержимое флаконов аккуратно перемешивают 1 раз. После инкубации путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 минут осаждают клетки крови и отбирают супернатант из пробы клеток, инкубированных с РЭА, и из пробы клеток, инкубированных без РЭА, в которых с помощью набора реагентов для иммуноферментного анализа, например, производства АО «Вектор-Бест», Россия, определяют концентрацию ГМ-КСФ. Индекс влияния РЭА на продукцию GM-CSF клетками крови высчитывают по формуле: ИВ_РЭА=А/Б, где А - концентрация ГМ-КСФ под влиянием РЭА, Б -концентрация ГМ-КСФ без РЭА. ИВ_РЭА выражают в условных единицах. При величине ИВ_СЕА, равной или превышающей 10,4, диагностируют HER2 положительный рак молочной железы.

Наличие HER2 положительного подтипа рака молочной железы контролировали путем иммуногистохимической диагностики биоптатов опухоли.

Промышленная применимость предлагаемого способа подтверждается клиническими примерами.

Клинический пример 1.

Б-ная Р-а, 65 лет, диагноз - инвазивный протоковый рак правой молочной железы. В соответствии с предлагаемым способом определяли концентрацию цитокина ГМ-КСФ в супернатанте пробы клеток крови, инкубированной с РЭА и без РЭА, после чего вычисляли ИВ_РЭА по ГМ-КСФ. ИВ_РЭА составил 15,4 условных единиц, что позволило установить диагноз -HER2 положительный подтип РМЖ. Назначено лечение по протоколу.

После проведения оперативного лечения взят образец опухоли, результаты иммуногистохимической диагностики опухоли подтвердили диагноз: инвазивный протоковый рак, T1N0M0, ER - 0, PR - 0, HER2 - 3, Ki67 - 9, HER2 положительный подтип.

Клинический пример 2.

Б-ная К-а, 58 лет, диагноз - инвазивный протоковый рак правой молочной железы. В соответствии с заявляемым способом определяли ИВ_РЭА по ГМ-КСФ - 21,0 условных единиц. Установлен диагноз HER2 положительный подтип РМЖ.

Результаты иммуногистохимической диагностики опухоли: инвазивный протоковый рак, T1N1M0, ER - 0, PR - 0, HER2 - 3, Ki67 - 25, HER2 положительный подтип.

Клинический пример 3.

Б-ная Л-а, 57 лет, диагноз - инвазивный протоковый рак правой молочной железы. В соответствии с заявляемым способом определяли ИВ_РЭА по ГМ-КСФ - 10,4 условных единиц. Установлен диагноз HER2 положительный подтип РМЖ.

Результаты иммуногистохимической диагностики опухоли: инвазивный протоковый рак, T1N0M0, ER - 0, PR - 0, HER2 - 3, Ki67 - 55, HER2 положительный подтип.

Клинический пример 4.

Б-ная Ф-н, 41 год, диагноз - инвазивный протоковый рак правой молочной железы. ИВ_РЭА по ГМ-КСФ, определенный по предлагаемому способу, составил 0,4 условных единиц, что указывает на отсутствие HER2 положительного подтипа РМЖ.

Результаты иммуногистохимической диагностики опухоли: инвазивный протоковый рак, T1N0M0, ER - 8, PR - 7, HER2 - 0, Ki67 - 10, люминальный А подтип.

Клинический пример 5.

Б-ная Д-о, 70 лет, диагноз - инвазивный протоковый рак правой молочной железы. ИВ_РЭА по ГМ-КСФ составил 5,3 условных единиц, что указывает на отсутствие HER2 положительного подтипа РМЖ.

Результаты иммуногистохимической диагностики опухоли: инвазивный протоковый рак, T2N1M0, ER - 8, PR - 0, HER2 - 0, Ki67 - 40, люминальнй В HER2-отрицательный подтип.

Клинический пример 6.

Б-ная С-а, 66 лет, диагноз - инвазивный протоковый рак левой молочной железы. ИВ_РЭА по ГМ-КСФ - 2,4 условных единиц.

Результаты иммуногистохимической диагностики опухоли: инвазивный протоковый рак, T1N0M0, ER - 0, PR - 0, HER2 - 0, Ki67 - 75, базальноподобный подтип.

Приведенные клинические примеры показывают, что предлагаемый способ обеспечивает скорость и доступность диагностики HER2 положительного подтипа РМЖ. Изобретение может быть использовано в большинстве медицинских учреждений без необходимости сложного оборудования, в том числе в учреждениях с ограниченными ресурсами, что позволяет расширить доступ к высокоточной диагностике HER2-положительного рака молочной железы на ранних стадиях заболевания и существенно улучшить прогноз и своевременно начать адекватное лечение.

Таким образом, настоящее изобретение представляет собой способ диагностики HER2-положительного рака молочной железы, обеспечивая более безопасную, доступную и эффективную альтернативу существующим методам, что позволяет улучшить результаты лечения и качество жизни пациентов.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для выявления HER2 положительного подтипа рака молочной железы (РМЖ). Осуществляют раздельную инкубацию крови в питательной среде в пробах с добавлением и без добавления раково-эмбрионального антигена (РЭА), получение супернатанта в каждой из двух проб с РЭА и без РЭА и определение концентрации гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) в каждой из проб. Вычисляют индекс влияния РЭА (ИВ_РЭА) на продукцию ГМ-КСФ клетками крови. При величине ИВ_РЭА, равной или превышающей 10,4, диагностируют HER2 положительный подтип РМЖ. Способ обеспечивает высокую точность выявления HER2 положительного подтипа РМЖ при малой инвазивности способа за счет определения индекса влияния РЭА на продукцию ГМ-КСФ клетками крови пациентки. 6 пр.

Способ выявления HER2 положительного молекулярного подтипа рака молочной железы (РМЖ), включающий забор крови, раздельную инкубацию крови в питательной среде в пробах с добавлением и без добавления раково-эмбрионального антигена (РЭА), получение супернатанта в каждой из двух проб с РЭА и без РЭА, определение концентрации цитокина - гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) в каждой из проб, вычисление индекса влияния РЭА (ИВ_РЭА) на продукцию ГМ-КСФ клетками крови по формуле ИВ_РЭА=А/Б, где А - концентрация ГМ-КСФ в пробе с добавлением РЭА, Б - концентрация ГМ-КСФ в пробе без РЭА, при величине ИВ_РЭА, равной или превышающей 10,4, диагностируют HER2 положительный подтип РМЖ.