СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ КОМПЕНСАЦИИ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА С ПОМОЩЬЮ ОЦЕНКИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии и иммунологии, клинической лабораторной диагностике нарушений компенсации обмена веществ и прогнозированию риска развития осложнений у больных сахарным диабетом 2 типа (СД 2 типа).

СД 2 типа - одна из ведущих медико-социальных проблем, которая касается значительной части населения не только России, но и всего мира. В настоящий момент СД рассматривают как заболевание, при котором отмечена преимущественная инсулинорезистентность с относительным дефицитом инсулина [5]. Эта форма диабета часто остается вовремя не диагностированной на протяжении многих лет, так как гипергликемия может быть не достаточно выраженной для развития явных симптомов диабета. Большинство пациентов с СД 2 типа страдают ожирением, которое вызывает или усиливает инсулинорезистентность, при этом наблюдается преимущественно абдоминальное распределение жировой ткани. Диабет опасен на любом этапе своего течения внезапными, быстро развивающимися осложнениями в виде нефропатии, ретинопатии, атеросклероза коронарных и периферических артерий, в виде диабетической стопы, периферической и вегетативной нейропатии, часто приводящих к инвалидизации и летальным исходам.

При постановке диагноза СД 2 типа учитывают фазу нарушений углеводного обмена: компенсации, субкомпенсации, декомпенсации. Под компенсацией понимают сохранение нормогликемии в течение суток (натощак 4,4÷6,1 ммоль/л, после еды - 5,5÷8 ммоль/л) и отсутствие глюкозы в моче. При субкомпенсации уровень глюкозы в крови натощак колеблется в пределах 6,2÷7,8 ммоль/л, после еды не превышает 10 ммоль/л, концентрация глюкозы в моче не выше 0,5%. В период декомпенсации у больных отмечается увеличение содержания глюкозы в крови натощак более 7,8 ммоль/л, после еды - свыше 10 ммоль/л; наблюдается усиливающаяся глюкозурия (более 0,5%). Нередко увеличивается печень, что обусловлено ее жировой инфильтрацией; функциональные пробы печени при этом обычно не нарушены. Кроме того, наблюдается преходящее повышение функций ряда желез внутренней секреции: увеличение секреции гормона роста, катехоламинов, глюкокортикоидов. При длительно декомпенсированном СД повышение процессов распада и снижение синтеза белка приводят к атрофическим изменениям в мышцах. Наблюдается уменьшение их массы, дряблость при пальпации, мышечная слабость и повышенная утомляемость [3].

Заявленный способ диагностики нарушений компенсации обмена веществ и прогнозирования риска развития осложнений у больных СД 2 типа путем оценки уровня апоптоза лимфоцитов позволит повысить точность прогнозирования, объективизировать тактику лечебных мероприятий, снизить риск развития хронической патологии, предупредить инвалидизацию пациентов.

На данный момент также известны способы диагностики диабета и его компенсации по содержанию гликолизированного гемоглобина (HbA_1c), исследованию спектра липидов (общий холестерин, триглицериды) [2]. Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ длительного мониторинга за состоянием больных сахарным диабетом и развитием неврологических и сосудистых его осложнений, который заключается в том, что многократно определяют иммунореактивность сыворотки крови по отношению к инсулину, к антиинсулиновым антителам или их антигенсвязывающим фрагментам [12]. Кроме длительности и многократности обследования, этот способ не может рассчитывать на долговременность прогнозирования, так как период активности антителообразования и полураспада является коротким.

Предлагаемое изобретение характеризует системное изменение проницаемости клеточных мембран, в том числе ядерных, что проявляется долговременными и отдаленными последствиями. Продукты генов-регуляторов апоптоза (р53, bc1-2, bc1-x1, mc1-1, bak, bax и др.) являются весьма консервативными и одинаковыми для представителей различных млекопитающих, что позволяет ограничиться одним исследуемым параметром. Изменение экспрессии белков-регуляторов апоптоза имеет долговременный эффект, поэтому прогнозирование риска развития осложнений осуществляется на более длительный период. Это облегчает пробоподготовку, повышает точность и достоверность результатов, снижает риск лабораторных отклонений.

Ранее с помощью апоптоза осуществляли оценку повреждающего действия вирусных инфекций [1, 9], прогнозирование неонатальной смертности детей [11] и развития раннего рецидива основного заболевания после трансплантации стволовых клеток [13], производили диагностику метастазирования [8] и течения псориаза [6], хронической плацентарной недостаточности [7]. Известны различные способы и средства стимулирования апоптоза [10, 15], скрининга про- и антиапоптогенной активности терапевтических препаратов [4].

Отличительным признаком заявленного способа является установление диагностических критериев процентного содержания апоптотических лимфоцитов An+/PI- в периферической венозной крови у больных СД 2 типа. При значении исследуемого параметра ниже 3,5% диагностируется состояние компенсации углеводного обмена и прогнозируется благоприятное течение заболевания на ближайший год. При содержании лимфоцитов An+/PI- в пределах от 3,5 до 6% диагностируется состояние субкомпенсации и прогнозируется умеренный риск развития осложнений. Уровень лимфоцитов An+/PI- выше 6% характеризует состояние декомпенсации и высокий риск развития хронических осложнений сахарного диабета 2 типа.

Способ осуществляется стандартно следующим образом.

1. У больных СД 2 типа забирают 1 мл венозной крови в пробирку Vacutainer, содержащую стабилизатор - литиевую соль гепарина, путем пункции локтевой вены.

2. Выделить суспензию лимфоцитов путем градиентного центрифугирования в концентрации от 10⁵ до 10⁶ клеток на пробу.

3. Однократно отмыть клетки (7÷10 мин, 150 g) забуференным фосфатами 0,15 М раствором хлорида натрия, рН 7,2÷7,4 (PBS).

4. Ресуспендировать 500 мкл лимфовзвеси в 500 мкл 1% связывающего буфера (10% связывающий буфер довести до 1% добавлением дистиллированной воды 1:10, поставить на лед в холодильник).

5. В 100 мкл образца из п.4 внести 1 мкл аннексина V (AnV) и 5 мкл йодистого пропидия (250 мкг порошка PI развести добавлением 1 мл приготовленного связывающего буфера 1%, поставить на лед в холодильник). Смесь аккуратно перемешать.

6. Инкубировать 15 мин в темноте на льду.

7. Добавить к суспензии 400 мкл охлажденного 1% связывающего буфера, аккуратно перемешать.

8. Произвести анализ клеток на проточном цитофлуориметре, оценивая интенсивность зеленой флуоресценции FITC-аннексина-V (FL1, 530 нм) и красной флуоресценции йодистого пропидия (FL3, свыше 600 нм) [14].

Обследование проводили с письменного согласия респондентов. Указанным способом обследованы 32 больных СД 2 типа, диагноз поставлен врачами городского эндокринологического консультативного центра г.Архангельска: 6 человек в стадии компенсации, 7 - субкомпенсации, 17 - декомпенсации. В качестве группы сравнения обследованы 25 практически здоровых лиц г.Архангельска. Результаты обработаны с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6» («StatSoft», США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители севера европейской территории России. Границы нормального распределения количественных показателей определяли при помощи критерия Шапиро - Уилка. Распределение процентного содержания лимфоцитов An+/PI- отличалось от нормального, поэтому представлено в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия Уилкоксона. Статистическая достоверность присваивалась при значении р<0,05.

Установлено, что у обследуемых больных в стадии компенсации содержание лимфоцитов An+/PI- составляет 2,3 (0,8-3,4)%, при изменении углеводного баланса в стадии субкомпенсации - 4,8 (3,8-5,9)%, в состоянии декомпенсации содержание лимфоцитов, подвергшихся апоптозу, равняется 8,45 (5,95-11,6)%. В группе практически здоровых людей данный показатель составил 1,6 (0,8-5,42)%, что соответствует указанным значениям компенсации углеводного обмена. Данный факт подтверждается увеличением концентрации лимфоцитов с маркером готовности к апоптозу CD95+ с 0,53±0,05 до 0,65±0,06×10⁹ кл/л на фоне повышения содержания лимфоцитов CD10+ с 0,55±0,05 до 0,75±0,09×10⁹ кл/л у лиц с декомпенсированной стадией СД 2 типа по сравнению с практически здоровыми людьми.

Инициация апоптозного сигнала при взаимодействии лиганда апоптоза с рецептором приводит к формированию комплекса сигнальных белков, активирующего каспазный каскад реакций, который приводит к характерной конденсации хроматина, ядерной фрагментации, сморщиванию ядра, пузырчатости плазматических мембран и другим ультраструктурным изменениям клетки [16]. В норме апоптоз клетки ингибируется после присоединения инсулина к своему рецептору. В результате рецептор аутофосфорилируется при участии тирозинкиназы, активизируется фосфатидилинозитол-3-киназа, стимулирующая переход ГЛЮТ-4 через мембрану клетки, чем обеспечивается транспорт глюкозы и синтез ДНК [2]. Усугубление течения заболевания СД 2 типа можно характеризовать сначала повышением уровня инсулина в плазме (при уменьшении чувствительности к нему со стороны клеток), а затем снижением содержания инсулина вследствие секреторной дисфункции β-клеток поджелудочной железы. Именно этим можно объяснить увеличение в крови уровня апоптотических лимфоцитов An+/PI-.

Частные примеры использования способа.

1. Больная С., 53 года. Диагноз: сахарный диабет 2 типа, легкое течение на фоне ожирения VI степени смешанного генеза, абдоминальный вариант. Больна в течение 4 лет. При лабораторном обследовании установлено, что содержание в периферической венозной крови лимфоцитов An+/PI-, находящихся на стадии апоптоза, составляет 1,3%. На основании полученных данных сделан вывод о компенсации углеводного обмена и благоприятном течении заболевания в ближайшем году, что подтверждает эффективность диетотерапии.

2. Больная Ф., 55 лет. Диагноз: сахарный диабет 2 типа, средней тяжести, ожирение III степени, абдоминальный вариант. Больна в течение 6 лет. При проведении дифференциальной диагностики установлено, что содержание в крови апоптотирующих лимфоцитов An+/PI- составляет 4,2%. Сделан вывод о субкомпенсации состояния углеводного обмена, что подтверждено дальнейшим течением заболевания и выявлением через год микроангиопатий сосудов шеи, нижних конечностей, коронарных артерий.

3. Больная Б., 57 лет. Диагноз: сахарный диабет 2 типа, среднетяжелое течение, отягощенная наследственность со стороны матери (СД 2 типа, ожирение). Больна в течение 4 лет. При лабораторном обследовании установлено, что содержание в крови лимфоцитов An+/PI- соответствует 11,9%. Сделан вывод о декомпенсации состояния углеводного обмена и высоком риске развития осложнений сахарного диабета, что подтверждено недостаточно выраженными результатами лечебных мероприятий и возникновением диабетической ретинопатии.

4. Больная К., 59 лет. Диагноз: сахарный диабет 2 типа, диабетическая нефропатия, выраженные отеки на стопах и голени, сухость во рту. Больна в течение 14 лет. При лабораторном обследовании установлено, что содержание в крови апоптотических лимфоцитов An+/PI- соответствует 10,9%. Сделан вывод о декомпенсации состояния углеводного обмена, что в дальнейшем подтверждено прогрессированием заболевания и развитием диабетической сенсорной полинейропатии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Берлим А.А. Способ прогнозирования предраковых заболеваний шейки матки у женщин с папиллома-вирусной инфекцией / А.А.Берлим, В.И.Орлов, С.Н.Панченко и др. // Патент №2310197 РФ, опубл. 10.11.2007.

2. Бокарев И.Н. Сахарный диабет: руководство для врачей / И.Н.Бокарев, В.К.Беликов, О.И.Шубина. - М.: ООО «Медицинское информационное агенство». - 2006. - 400 с.

3. Большая медицинская энциклопедия / Под ред. Б.В.Петровского, изд-е 3, Т.7. - М.: Советская энциклопедия, 1977. - С.227-232.

4. Дыгало Н.Н. Способ скрининга про- или антиапоптогенной активности терапевтических препаратов / Н.Н.Дыгало, Т.С.Калинина, Г.Т.Шишкина // Патент №2388065 РФ, опубл. 27.04.2010.

5. Зыкова Т.А. Диагностика и классификация сахарного диабета / Т.А.Зыкова, Б.А.Савенко // Пособие для врачей. - Архангельск, 2001. - 30 с.

6. Корсунская И.М. Способ оценки состояния апоптотической системы в коже у больных псориазом / И.М.Корсунская, И.В.Голденкова, С.А.Брускин и др. // Патент №2311643 РФ, опубл. 27.11.2007.

7. Липатов И.С. Способ диагностики хронической плацентарной недостаточности / И.С.Липатов, Мельников В.А., Тезиков Ю.В. и др. // Патент №2313795 РФ, опубл. 27.12.2007.

8. Лихванцева В.Г. Способ прогнозирования метастазирования увеальной меланомы на основе маркеров апоптоза Вах и BCL-2 / В.Г.Лихванцева, М.Р.Личиницер, М.Е.Абрамов и др. // Патент №2244934 РФ, опубл. 10.09.2004.

9. Луценко М.Т. Способ оценки повреждающего действия герпес-вирусной инфекции на развитие апоптоза в ядрах симпласта ворсинок плаценты у беременных / М.Т.Луценко, Андриевская И.А. // Патент №2370772, РФ, опубл. 20.10.2009.

10. Македонов Г.П. Способ стимулирования апоптоза / Г.П.Македонов, Цховребова Л.В. // Патент №2340349 РФ, опубл. 20.02.2008.

11. Плеханов Л.А. Способ прогнозирования неонатальной смертности у детей с перинатальным поражением центральной нервной системы / Л.А.Плеханов, Г.Н.Бельская // Патент №2287162 РФ, опубл. 10.01.2006.

12. Полетаев А.Б. Способ мониторинга за состоянием больных сахарным диабетом и развитием неврологических и сосудистых его осложнений / А.Б.Полетаев, А.А.Абросимова, М.А.Соколов // Патент №2291437, РФ, опубл. 10.04.2006.

13. Пронкина Н.В. Способ прогноза развития раннего рецидива основного заболевания после аутологичной трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток у больных гемобластозами / Н.В.Пронкина, B.C.Кожевников, И.А.Лисуков и др. // Патент №2337712 РФ, опубл. 10.11.2008.

14. Сибиряк С.В. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях: краткое методическое руководство / С.В.Сибиряк, С.В.Хайдуков, А.В.Зурочка и др. - Екатеринбург: УрО РАН, 2008. - 59 с.

15. Федоров С.Н. Средство, стимулирующее апоптоз клеток лейкемии человека / С.Н.Федоров, Л.К.Шубина, И.И.Капустина // Патент №2360692 РФ, опубл. 10.07.2009.

16. Цыган В.Н. Актуальные проблемы иммунологии. - СПб., 2004. - С.12-16.

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для диагностики нарушений компенсации обмена веществ и прогнозирования риска развития осложнений у больных сахарным диабетом 2 типа (СД 2 типа). Для этого в периферической венозной крови определяют процентное содержание апоптотических лимфоцитов An+/PI-. При значении содержания лимфоцитов An+/PI- ниже 3,5% диагностируется состояние компенсации углеводного обмена и прогнозируется благоприятное течение заболевания на ближайший год. При содержании лимфоцитов An+/PI- в пределах от 3,5 до 6% диагностируется состояние субкомпенсации и умеренный риск развития осложнений. Уровень лимфоцитов An+/PI- выше 6% характеризует состояние декомпенсации и высокий риск развития хронических осложнений сахарного диабета 2 типа. Применение данного способа позволяет повысить точность прогнозирования и снизить риск развития осложнений у больных сахарным диабетом. 4 пр.

Способ диагностики нарушений компенсации обмена веществ и прогнозирования риска развития осложнений у больных сахарным диабетом 2 типа с помощью апоптоза, включающий иммунологическое обследование крови, отличающийся тем, что в периферической венозной крови методом проточной цитофлуориметрии определяют процентное содержание апоптотических лимфоцитов An+/PI-, при значении содержания лимфоцитов An+/PI- ниже 3,5% диагностируется состояние компенсации углеводного обмена и прогнозируется благоприятное течение заболевания на ближайший год, при содержании лимфоцитов An+/PI- в пределах от 3,5 до 6% диагностируется состояние субкомпенсации и прогнозируется умеренный риск развития осложнений, уровень лимфоцитов An+/PI- выше 6% характеризует состояние декомпенсации и высокий риск развития хронических осложнений сахарного диабета.