СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к биологии, экологии и токсикологической химии, а именно к способам определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в биологическом материале (тканях трупных органов) путем измельчения биологической пробы, введения в нее электролита (хлорида натрия), трехкратного (по 8 часов) настаивания с порциями 1% раствора аммиака, масса каждой из которых приблизительно равна массе биоматериала, отдельные извлечения отделяют, биоматериал дважды промывают водой, извлечения объединяют с порциями промывной жидкости, подкисляют серной кислотой до рН 1, неоднократно экстрагируют хлороформом, хлороформные экстракты объединяют, хлороформ испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в диэтиловом эфире и хроматографируют на пластинах с тонким слоем оксида алюминия, используя подвижную фазу метанол-25% раствор аммиака в соотношении 25:1 (Крамаренко В.Ф., Туркевич Б.М. Анализ ядохимикатов. - М.: Химия, 1978. - Стр.90-91, 252).

Способ характеризуется длительностью выполнения и недостаточно высокой чувствительностью.

Известен способ определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в биологическом материале (мышечная ткань), заключающийся в том, что анализируемую пробу кипятят, используя обратный холодильник, с четырехкратным количеством 6 н. раствора хлороводородной кислоты в течение 1 часа, смесь охлаждают, обрабатывают концентрированным раствором фосфорно-молибденовой кислоты, выпавший осадок отфильтровывают, осадок на фильтре промывают 2 н. раствором хлороводородной кислоты, фильтрат и промывную жидкость объединяют и неоднократно экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирные экстракты объединяют, промывают водой, неоднократно экстрагируют 3% раствором гидрокарбоната натрия, экстракты объединяют, подкисляют концентрированной хлороводородной кислотой до рН 1, неоднократно экстрагируют диэтиловым эфиром, экстракты объединяют, сушат, упаривают до незначительного объема и хроматографируют в тонком слое силикагеля при использовании подвижной фазы гексан-диэтиловый эфир-муравьиная кислота в соотношении 25:25:1 (Клисенко М.А., Александрова Л.Г. Определение остаточных количеств пестицидов. - Киев: Здоров'я, 1983. - С.119-121).

Способ отличается недостаточно высокой чувствительностью определения.

Наиболее близким является способ определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в биологическом материале (мышечная ткань), заключающийся в том, что анализируемую пробу измельчают, вводят в нее раствор 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты, обрабатывают четырехкратным количеством изолирующего агента (6 н. раствора хлороводородной кислоты) в условиях кипячения с обратным холодильником в течение часа, полученную смесь охлаждают, обрабатывают 40% раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, разбавляют водой, фильтруют, остаток на фильтре промывают 2 н. раствором хлороводородной кислоты, фильтрат и промывную жидкость объединяют, неоднократно экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирные экстракты объединяют, экстрагируют водно-щелочным раствором, водно-щелочной экстракт промывают эфиром, подкисляют раствором хлороводородной кислоты до рН 3, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирные экстракты сушат над безводным сульфатом натрия в течение 15-30 минут при периодическом встряхивании, растворитель удаляют последовательно с помощью ротационного испарителя и в токе теплого воздуха до сухого остатка, остаток обрабатывают 5% раствором диметилсульфата в абсолютом метаноле в присутствии безводного сульфата натрия в условиях нагревания с обратным холодильником при 55°С в течение 10 минут, реакционную смесь охлаждают, обрабатывают насыщенным раствором хлорида натрия, экстрагируют гексаном и проводят определение методом газожидкостной хроматографии, применяя детектор постоянной скорости рекомбинации, колонку размерами 2000×3 мм, заполненную хроматоном N (размер частиц 0,16-0,20 мм), силанированным DMCS, с 5% неподвижной фазы SE-30, и используя в качестве подвижной фазы азот особой чистоты (Лабораторные исследования в ветеринарии: химико-токсикологические методы / под ред. Б.И.Антонова. - М.: Агропромиздат, 1989. - С.215-216, 212-213).

Способ характеризуется недостаточно высокой точностью.

Задачей настоящего изобретения является повышение точности определения.

Поставленная цель достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают порциями изолирующего агента (этилацетата), масса каждой из которых в два раза превышает массу биологического материала, этилацетатные извлечения объединяют, растворитель испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, ацетон испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в хлороформе, экстрагируют буферным раствором с рН 10-11, экстракт отделяют, подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают хлоридом натрия, экстрагируют этилацетатом, этилацетатное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему, хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием подвижной фазы гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия в соотношении 1:1 по объему и хроматографируют методом ВЭЖХ с применением обращеннофазового сорбента «Symmetry С-18», подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия в соотношении 1:1 по объему и детектора на основе фотодиодной матрицы.

Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, двукратно по 30 минут настаивают при перемешивании с порциями изолирующего агента (этилацетата), масса каждой из которых в два раза превышает массу биологического объекта, отдельные извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, растворитель испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, ацетон испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, остаток растворяют в хлороформе, экстрагируют буферным раствором с рН 10-11, экстракт отделяют, подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают хлоридом натрия, экстрагируют этилацетатом, этилацетатное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему, хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием подвижной фазы гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия в соотношении 1:1 по объему и хроматографируют методом ВЭЖХ с применением обращеннофазового сорбента «Symmetry С-18», подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия в соотношении 1:1 по объему и детектора на основе фотодиодной матрицы.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в мышечной ткани

К 10 г мелкоизмельченной мышечной ткани прибавляют 10 мг 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 г изолирующего агента (этилацетата) и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Отдельные извлечения объединяют, растворитель испаряют в токе воздуха. Остаток обрабатывают 10 мл ацетона при энергичном перемешивании в течение 3 минут. Ацетоновое извлечение отделяют, а процесс обработки остатка повторяют по вышеописанной схеме еще дважды. Отдельные ацетоновые извлечения объединяют в выпарительной чашке и испаряют растворитель в токе воздуха при температуре 18-22°С. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с рН 10-11 по 10 мл каждая. Отдельные водно-щелочные экстракты отделяют от органической фазы, объединяют, подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают хлоридом натрия и экстрагируют дважды порциями этилацетата по 20 мл каждая. Этилацетатные извлечения отделяют от водно-щелочной фазы, объединяют, пропускают через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 20 мл этилацетата. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему и вносят в хроматографическую колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100µ. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 11 включительно объединяют, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до полного испарения растворителя. Остаток растворяют в 6-8 мл ацетонитрила, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят ацетонитрилом до метки (раствор А). 1,0 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки ацетонитрилом (раствор Б). 5,0 мл раствора Б вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, туда же прибавляют 7,5 мл ацетонитрила и доводят до метки 0,025 М раствором дигидрофосфата калия. 20 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Alliance» фирмы «Waters».

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм с предколонкой размером 3,9×20 мм, заполненными обращеннофазовым сорбентом «Symmetry С-18», с применением подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия в соотношении 1:1 по объему и детектора на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны, равной 239 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 3,721 мин (объемом удерживания 3721 мкл) соответствует 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте.

Количественное содержание 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению градуировочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в мышечную ткань.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 100 мл вносят 1,0; 2,5; 5,0; 12,5; 25,0; 37,5; 50,0 мл 0,002% раствора 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в ацетонитриле, добавляют соответственно 49,0; 47,5; 45; 37,5; 25,0; 12,5; 0,0 мл ацетонитрила и доводят до метки 0,025 М раствором дигидрофосфата калия. 20 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм с предколонкой размером 3,9×20 мм, заполненными обращеннофазовым сорбентом «Symmetry С-18», используя подвижную фазу ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия в соотношении 1:1 по объему и детектор на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны, равной 239 нм.

По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади хроматографического пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,004-0,2 мкг.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=38301232·C+114016,

где S - площадь хроматографического пика,

С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в мышечной ткани представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 10 мг 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18 - 22°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 г изолирующего агента (этилацетата) и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Отдельные извлечения объединяют, растворитель испаряют в токе воздуха. Остаток обрабатывают 10 мл ацетона при энергичном перемешивании в течение 3 минут. Ацетоновое извлечение отделяют, а процесс обработки остатка повторяют по вышеописанной схеме еще дважды. Отдельные ацетоновые извлечения объединяют в выпарительной чашке и испаряют растворитель в токе воздуха при температуре 18-22°С. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с рН 10-11 по 10 мл каждая. Отдельные водно-щелочные экстракты отделяют от органической фазы, объединяют, подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают хлоридом натрия и экстрагируют дважды порциями этилацетата по 20 мл каждая. Этилацетатные извлечения отделяют от водно-щелочной фазы, объединяют, пропускают через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 20 мл этилацетата. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему и вносят в хроматографическую колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100µ. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 11 включительно объединяют, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до полного испарения растворителя. Остаток растворяют в 6-8 мл ацетонитрила, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят ацетонитрилом до метки (раствор А). 1,0 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки ацетонитрилом (раствор Б). 5,0 мл раствора Б вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, туда же прибавляют 7,5 мл ацетонитрила и доводят до метки 0,025 М раствором дигидрофосфата калия. 20 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Alliance» фирмы «Waters».

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм с предколонкой размером 3,9×20 мм, заполненными обращеннофазовым сорбентом «Symmetry C-18», с применением подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия в соотношении 1:1 по объему и детектора на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны, равной 239 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 3,721 мин (объемом удерживания 3721 мкл) соответствует 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте.

Количественное содержание 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению градуировочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в ткань печени.

Процесс построения градуировочного графика и его уравнение приведены выше в примере 1.

Результаты количественного определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в ткани печени представлены в таблице 2.

Пример 3

Определение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в зерне ячменя

К 10 г мелкоизмельченной ткани зерен ячменя прибавляют 10 мг 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 г изолирующего агента (этилацетата) и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Отдельные извлечения объединяют, растворитель испаряют в токе воздуха. Остаток обрабатывают 10 мл ацетона при энергичном перемешивании в течение 3 минут. Ацетоновое извлечение отделяют, а процесс обработки остатка повторяют по вышеописанной схеме еще дважды. Отдельные ацетоновые извлечения объединяют в выпарительной чашке и испаряют растворитель в токе воздуха при температуре 18-22°С. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с рН 10-11 по 10 мл каждая. Отдельные водно-щелочные экстракты отделяют от органической фазы, объединяют, подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают хлоридом натрия и экстрагируют дважды порциями этилацетата по 20 мл каждая. Этилацетатные извлечения отделяют от водно-щелочной фазы, объединяют, пропускают через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 20 мл этилацетата. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему и вносят в хроматографическую колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100µ. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 11 включительно объединяют, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до полного испарения растворителя. Остаток растворяют в 6-8 мл ацетонитрила, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят ацетонитрилом до метки (раствор А). 1,0 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки ацетонитрилом (раствор Б). 5,0 мл раствора Б вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, туда же прибавляют 7,5 мл ацетонитрила и доводят до метки 0,025 М раствором дигидрофосфата калия. 20 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Alliance» фирмы «Waters».

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм с предколонкой размером 3,9×20 мм, заполненными обращеннофазовым сорбентом «Symmetry С-18», с применением подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия в соотношении 1:1 по объему и детектора на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны, равной 239 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 3,721 мин (объемом удерживания 3721 мкл) соответствует 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте.

Количественное содержание 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению градуировочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в зерно ячменя.

Процесс построения градуировочного графика и его уравнение приведены выше в примере 1.

Результаты количественного определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в зерне ячменя представлены в таблице 3.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 2,5 раза повышает точность определения (полуширина доверительного интервала снижается с 10,25% до 4,04% при n=5; Р=0,95).

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 4.

Таблица 4 Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере исследования мышечной ткани, содержащей 10 мг анализируемого вещества в 10 г биологического объекта) Показатели Предлагаемый способ Известный способ 1. Полуширина доверительного интервала Δx(%) (показатель точности) при n=5; Р=0,95 4,04 10,25

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии. Биологический материал, содержащий 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, двукратно по 30 минут настаивают при перемешивании с порциями этилацетата, масса каждой из которых в два раза превышает массу биологического объекта. Отдельные извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют. Растворитель испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют. Ацетон испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С до сухого остатка. Остаток растворяют в хлороформе, экстрагируют буферным раствором с рН 10-11. Экстракт отделяют, подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают хлоридом натрия. Экстрагируют этилацетатом, этилацетатное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему, хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием подвижной фазы гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему. Фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С. Остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия в соотношении 1:1 по объему и хроматографируют методом ВЭЖХ с применением обращеннофазового сорбента «Symmetry С-18», подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия в соотношении 1:1 по объему и детектора на основе фотодиодной матрицы. Изобретение позволяет повысить точность определения. 4 табл., 3 пр.

Способ определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в биологическом материале, который заключается в том, что биологический объект измельчают, обрабатывают изолирующим агентом, извлечение отделяют от частиц биологического материала, анализируемое вещество очищают жидкость-жидкостной экстракцией и определяют хроматографическим методом, отличающийся тем, что в качестве изолирующего агента используют этилацетат, обработку биологического объекта осуществляют двукратно по 30 мин порциями этилацетата, масса каждой из которых в два раза превышает массу биологического объекта, этилацетатные извлечения объединяют, растворитель испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до сухого остатка, остаток при проведении очистки жидкость-жидкостной экстракцией растворяют в хлороформе, экстрагируют буферным раствором с рН 10-11, экстракт отделяют, подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают хлоридом натрия, экстрагируют этилацетатом, этилацетатное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают при 18-22°С в токе воздуха до сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему, хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием подвижной фазы гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия в соотношении 1:1 по объему и проводят определение методом ВЭЖХ с применением обращеннофазового сорбента «Symmetry С-18», подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия в соотношении 1:1 по объему и детектора на основе фотодиодной матрицы.