ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ Российский патент 2012 года по МПК C07K16/18 A61P9/10 A61K39/00 A61K39/395 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к иммунотерапевтическим способам терапии сердечно-сосудистого заболевания.

Уровень техники

Атеросклероз является заболеванием, зависящим от многих факторов, развивающимся преимущественно у субъектов, демонстрирующих биохимические факторы риска, которые включают среди прочих курение, гипертонию, сахарный панкреатический диабет, гиперхолестеринемию, повышенное содержание в плазме липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) и триглицеридов, гиперфибриногенемию и гипергликемию. Атеросклероз является хроническим заболеванием, которое вызывает утолщение глубинного слоя (интимы) артерий большого и среднего размера. Это уменьшает кровоток и может вызвать ишемию и разрушение тканей в органах, питание которых осуществляется поврежденными сосудами. Атеросклеротические поражения развиваются у людей в течение нескольких десятилетий, приводя к осложнениям, таким как коронарные и церебральные ишемические и тромбоэмболические заболевания, и инфарктам миокарда и церебральным инфарктам.

Атеросклероз является главной причиной сердечно-сосудистых заболеваний, включая инфаркт миокарда, инсульт и заболевание периферических артерий. Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной заболеваемости и смертности в промышленно развитых странах и непрерывно прогрессируют в развивающихся странах, главной патологией, лежащей в основе заболеваний, является коронарный атеросклероз. Современная терапия атеросклероза не является полностью эффективной в предотвращении развития заболевания и осложнений.

Заболевание возникает при накоплении липопротеидов, главным образом ЛПНП, во внеклеточном матриксе сосуда. Данные частицы ЛПНП агрегируют и претерпевают окислительную модификацию. Окисленные ЛПНП токсичны и вызывают повреждение сосудов. Атеросклероз представляет во многих аспектах реакцию (включая воспаление и фиброз) на данное повреждение.

Высокие уровни холестерина в плазме, и особенно высокие уровни ЛПНП, обычно признаются движущими силами развития атеросклероза, в то время как высокие уровни липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) препятствуют развитию атеросклероза. Соответственно, ЛПВП были названы хорошим холестерином, в то время как ЛПНП был названы плохим холестерином. Упрощенно, ЛПВП транспортируют холестерин в ткани, в то время как ЛПНП абсорбируют холестерин из тканей и переносят их в печень, где происходит их деградация. Терапевтические стратегии уменьшения ЛПНП и увеличения ЛПВП для лечения атеросклероза находятся в процессе разработки. Одна особенно интересная и перспективная стратегия включает мутированный вариант ЛПВП, так называемый АроА-1_Milano. Данный вариант ЛПВП крайне эффективен в транспортировке холестерина из тканей и в экспериментах на животных (Shah et al., 1998), кроме того, результаты клинических испытаний (Nissen et al., 2003) продемонстрировали, что он может вызывать значительное уменьшение отложений атеросклеротических бляшек.

Как было описано в разделе «Уровень техники» патентной заявки WO 02/080954, Palinski и соавторы (1989) обнаружили у людей циркулирующие антитела к окисленным ЛПНП. Данное наблюдение означало, что атеросклероз может быть аутоиммунным заболеванием, которое вызвано иммунными реакциями на окисленные липопротеины. В настоящее время несколько лабораторий начали поиск взаимосвязи между титром антител к окисленным ЛПНП и сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Было обнаружено, что антитела к окисленным ЛПНП присутствуют как у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, так и у здоровых контрольных участников исследования. Это привело исследователей к изучению того, действительно ли аутоиммунные реакции на окисленные ЛПНП в стенке сосудов играют некоторую роль в развитии атеросклероза, путем иммунизации животных к их собственным окисленным ЛПНП. Идея, лежащая в основе данного подхода, заключалась в том, что, если аутоиммунные реакции на окисленные ЛПНП при использовании классических методик иммунизации будут усилены, результатом этого будет увеличение сосудистого воспаления и прогрессирование атеросклероза. Для проверки этой гипотезы кроликов иммунизировали аутологичными окисленными ЛПНП и затем индуцировали атеросклероз путем кормления животных диетой с высоким содержанием холестерина в течение 16 недель (Ameli et al., 1996; Freigang et al., 1998). Однако в противоположность исходной гипотезе иммунизация окисленными ЛПНП оказывала защитный эффект, уменьшая развитие атеросклероза примерно на 50%. Аналогичные результаты были также получены в последующем исследовании, в котором диету с высоким содержанием холестерина комбинировали с повреждением сосудов при помощи вводимого внутрь баллона для индукции более активного образования бляшек (Nissen et al., 1997). В совокупности доступные данные означают, что существуют иммунные реакции, которые защищают от развития атеросклероза, и что эти реакции включают аутоиммунные реакции против окисленных ЛПНП.

Данные наблюдения свидетельствуют о возможности разработки иммунной терапии или «вакцины» для лечения у людей сердечно-сосудистых заболеваний, возникших на основе атеросклероза. Одним из способов осуществления такой терапии могла бы стать иммунизация особи собственным ЛПНП после его окисления, например, при его контакте с медью.

Palinski и соавторы (1995) и George и соавторы (1998) показали, что иммунизация против окисленных ЛПНП уменьшает развитие атеросклероза. Аналогично этому Zhoiu и соавторы (2001) продемонстрировали, что антитела, реагирующие с эпитопами, обнаруженными на окисленной форме ЛПНП, на животных моделях защищают от развития атеросклероза.

В заявке WO 02/080954 сообщается, что вакцинация животных, склонных к развитию атеросклероза, окисленными формами определенных пептидов, полученных из аполипопротеина В-100 (АроВ-100), защищает их от развития атеросклероза. Предыдущие эксперименты продемонстрировали, что антитела, которые связываются с окисленными эпитопами, присутствующими в частицах ЛПНП (Schpou et al., 2004), в животных моделях оказывают защитное действие против развития атеросклеротических бляшек. Более того, меченные радиоактивным изотопом формы антител, которые связываются с окисленными ЛПНП, также могут быть использованы для радиоиммуноанализа атеросклеротических повреждений сосудов у экспериментальных животных (Tsimikas et al., 2000). Для детектирования бляшек у мышей и кроликов было использовано меченное I¹²⁵ антитело к лизиновому эпитопу MDA, и было обнаружено, что введенные антитела локализуются в бляшках в аорте. Это указывает на то, что иммунные реакции против окисленных ЛПНП могут оказывать защитный эффект.

Также было показано, что рекомбинантные человеческие антитела, выработанные против MDA-модифицированных пептидов, полученных из АроВ-100 человека, в соответствующих животных моделях существенно ингибируют образование бляшек (Schpou et al., (2004); заявка WO 2004/030607). Механизмы, лежащие в основе действия на разрастание бляшки, не известны, однако предполагается влияние на активацию макрофагов и воспаление (Schiopu et al., 2004). Известно, что окисленные ЛПНП активируют макрофаги, что приводит к увеличенному воспалительному ответу, который, в свою очередь, индуцирует развитие атеросклероза (Smith et al., 1995). Однако не было ни теоретических, ни экспериментальных данных, которые говорили бы о том, что иммунный ответ против окисленных ЛПНП или введение заранее полученных антител к окисленным ЛПНП может в результате дать обратное развитие уже существующих атеросклеротических повреждений.

В предыдущей работе также было продемонстрировано, что антитела к окисленным пептидам, полученным из АроВ-100, так же как и антитела к другим окисленным эпитопам ЛПНП, включая фосфатидилхолин, могут предотвращать развитие атеросклеротических бляшек у экспериментальных животных (2004/030607; US 6716410). Инъекция человеческих иммуноглобулинов, содержащих природные антитела к окисленным ЛПНП, уменьшало атеросклероз у мышей с врожденным отсутствием АроЕ (Nicoletti et al., 1998).

Насколько мы знаем, никто из авторов любой из данных публикаций не оценил по достоинству то, что антитела к окисленным эпитопам ЛПНП могут вызывать уменьшение атеросклеротических бляшек, они не предполагали, что подобные антитела могут быть использованы у больных людей для уменьшения отложений атеросклеротических бляшек.

Раскрытие изобретения

Удивительным и неожиданным было то, что мы теперь обнаружили, что антитела к окисленным эпитопам ЛПНП не только действительно препятствуют образованию бляшек, они также индуцируют уменьшение уже образовавшихся атеросклеротических бляшек. Такие антитела могут применяться для терапии запущенного атеросклероза для интенсивного образного развития болезни, что приведет к уменьшению отложений бляшек.

Аналогично этому, поскольку у млекопитающих титры специфичных антител могут быть получены как пассивной, так и активной иммунизацией, уменьшение уже существующих бляшек может быть достигнуто при помощи любого из этих двух подходов.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению иммунотерапии против окисленных ЛПНП для индуцирования уменьшения уже существующих атеросклеротических бляшек у человека.

Иммунотерапия может представлять собой либо активную иммунизацию при введении окисленных эпитопов ЛПНП, либо пассивную иммунизацию при введении антител, индуцированных против окисленных эпитопов ЛПНП.

В понятие «обратное развитие атеросклеротических бляшек» мы включаем значение уменьшения размера, и/или количества, и/или распространенности атеросклеротических бляшек. В основном, обратное развитие атеросклеротических бляшек ведет к уменьшению площади внутренней поверхности артерии, покрытой бляшками. Поэтому в понятие «обратное развитие атеросклеротических бляшек» мы включаем уменьшение суммарного отложения бляшек у особи, а также уменьшение размера некоторых или всех атеросклеротических бляшек особи. Обратное развитие атеросклеротических бляшек также ведет к увеличению просвета сосудов, что способствует усилению кровотока.

Способы измерения размера, и/или количества, и/или распространенности атеросклеротических бляшек у человека хорошо известны специалистам в данной области техники и включают рентгенографию кровеносных сосудов, ультразвуковое исследование сосудов, компьютерную томографию и магнитную резонансную томографию.

В понятие «уменьшения размера, и/или количества, и/или распространенности» мы включаем уменьшение приблизительно на 1-25%, например уменьшение приблизительно на 1, или 2, или 3, или 4, или 5%, или более значительное уменьшение приблизительно на 6, или 7, или 8, или 9, или 10%, или уменьшение на 10-25%. Более предпочтительным является большее уменьшение на 25-50% или на 50-75% или еще большее уменьшение.

Под уменьшением площади внутренней поверхности артерии, покрытой атеросклеротическими бляшками, мы имеем в виду уменьшение приблизительно на 1-25%, например уменьшение приблизительно на 1, или 2, или 3, или 4, или 5%, или более значительное уменьшение приблизительно на 6, или 7, или 8, или 9, или 10%, или уменьшение на 10-25%. Более предпочтительным является большее уменьшение на 25-50% или на 50-75% или еще большее уменьшение.

В понятие эффективного поперечного сечения артериального сосуда мы включаем увеличение на 1-25%, например увеличение приблизительно на 1, или 2, или 3, или 4, или 5%, или более значительное увеличение приблизительно на 6, или 7, или 8, или 9, или 10%, или увеличение на 10-25%. Более предпочтительным является большее увеличение на 25-50%, или на 50-75%, или на 75-100%. Более предпочтительным является увеличение эффективного поперечного сечения артериального сосуда в 2, или 3, или 4, или 5, или в 10 раз или еще большее увеличение. Очевидно, что степень увеличения поперечного сечения артериального сосуда зависит от уровня закупорки артерии, вызванного атеросклеротическими повреждениями до терапии.

Атеросклеротические бляшки, которые будут регрессировать, обычно находятся в аорте больного, хотя также могут быть обнаружены в других артериях больного, таких как бедренная, сонная и коронарная артерии.

Более предпочтительно, если иммунотерапия направлена против окисленных эпитопов, присутствующих в окисленных ЛПНП, но не в нативных ЛПНП. Подобные эпитопы могут быть определены при помощи методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, и описанных в патенте WO 02/080954.

Еще более предпочтительно, если иммунотерапия направлена против окисленных эпитопов, присутствующих у АроВ-100 в окисленных ЛПНП.

Окисленные ЛПНП содержат несколько различных эпитопов, которые могут распознаваться антителами. ЛПНП могут подвергаться окислению и деградации в широком спектре различных химических реакций, которые включают реакции, вызванные различными видами модификаций, вызываемых активностью кислорода, ферментов (например, миелопероксидазы), ионов металла (например, Fe²⁺ и Сu²⁺), свободных радикалов и других видов химического стресса.

Некоторые из окисленных эпитопов обнаружены в белковой части ЛПНП (Yang et al., 2001), однако другие эпитопы представляют собой модификации липидов, присутствующих в частице ЛПНП. Может происходить образование множества модифицированных окислением и биологически активных фосфолипидов (Нееrу et al., 1995; Friedman et al., 2002; Watson et al., 1999). Полиненасыщенные жирные кислоты превращаются в гидроперекиси жирных кислот, которые быстро образуют продукты с высокой реакционной способностью, такие как малоновый диальдегид и 4-гидроксиноненаль (Smiley et al., 1991). Этот вид промежуточных продуктов может продолжать превращение в ковалентное основание Шиффа и продукты реакции Майкла с лизином в белке в АроВ-100 из ЛПНП. Реакционноспособные альдегиды также могут быть обнаружены в жирных кислотах, присоединенных через эфирные связи в области фосатидилхолинового остатка (Witzum & Berliner, 1998). Часто встречаемый фосфолипид - 1-пальмитоил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфорилхолин (ПАФХ) - близкий к конечному продукт окисления, который дает альдегид на sn-2 атоме углерода окисленной арахидоновой кислоты, в результате чего получается ПОВФХ (1-пальмитоил-2-(5-оксо)валероил-sn-глицеро-3-фосфорилхолин). ПОВФХ может реагировать с лизином и также с фосфолипидами, содержащими амины, такими как фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин. Конечный результат представляет собой множество окисленных аддуктов липид-белок и окисленных аддуктов липид-липид. Некоторые из этих окислений катализируются ферментами, такими как секреторная фосфолипаза (Leitinger et al., 1999). Другие изменения, катализируемые ферментами, такие как нитрование и добавление HOCL, катализирует миелопероксидаза (Саrr et al., 2000). Считается, что все новые эпитопы являются иммуногенными и биологически активными (McIntire et al., 1999; Esterbauer et al., 1991). Также критические эпитопы, которые представляют собой результат окислительной модификации частицы ЛПНП, которые сами не окислены, как фосфорилхолин и фрагменты белков, являются отличительным признаком окисленных ЛПНП, и подобные эпитопы представляют выгодную мишень для иммунотерапии.

За последнее время авторы настоящего изобретения из библиотеки рекомбинантных фрагментов создали человеческие антитела, названные n-CoDer^®, которые направлены против окисленных пептидов, полученных из человеческого АроВ-100 (WO 02/080954). Данные пептидные эпитопы АроВ-100, взятые из Таблицы 1 патентной заявки WO 02/080954, перечислены ниже в Таблице 1. Разработанные антитела в животных моделях защищали от развития атеросклеротических поражений (Schiopu et al., 2004; патентная заявка WO 2004/030607). Последовательности антител против окисленного АроВ-100, раскрытых в патентной заявке WO 2004/030607, в особенности IEI-A8, IEI-D8, IEI-E3, IEIG8, KТТ-В8 и KTT-D6, включены в данный документ посредством отсылки. Во избежание недоразумений, каждое из антител, описанных в заявке WO 2004/030607 и в работе Schiopu et al. (2004), являются примерами антител, которые могут быть применены в контексте данного изобретения.

Как показано выше в таблице 1, пептиды могут быть разделены по группам на 6 категорий с общими характеристиками:

Категория А: Фрагменты, которые вызывают высокие титры антител IgG к пептидам, модифицированным MDA (малоновым диальдегидом) (n=3).

Категория В: Фрагменты, которые вызывают высокие титры антител IgM, но отсутствует различие между нативными пептидами и пептидами, модифицированным MDA (n=9).

Категория С: Фрагменты, которые вызывают высокие титры антител IgG, но отсутствует различие между нативными пептидами и пептидами, модифицированным MDA (n=2).

Категория D: Фрагменты, которые вызывают высокие титры антител IgG к пептидам, модифицированным MDA, и титры антител в пуле NНР, которые были, по меньшей мере, в два раза выше, чем титры антител в пуле АНР (n=5).

Категория Е: Фрагменты, которые вызывают высокие титры антител IgM, к пептидам, модифицированным MDA, и титры антител в пуле NHP, которые были, по меньшей мере, в два раза выше по сравнению с титрами антител в пуле АНР (n=11).

Категория F: Фрагменты, которые вызывают высокие титры антител IgG, но отсутствует различие между нативными пептидами и пептидами, модифицированными MDA, и титры антител в пуле АНР, которые были, по меньшей мере, в два раза выше по сравнению с титрами антител в пуле NHP (n=7).

Известно, что пептидные фрагменты АроВ-100 могут быть приготовлены при использовании методик белковой химии, например при использовании частичного протеолиза (как экзогенного, так и эндогенного), или посредством синтеза de novo. Как альтернативный вариант варианты могут быть созданы при помощи технологии на основе рекомбинантной ДНК. Соответствующие методики для клонирования, работы, модификации и экспрессии нуклеиновых кислот, а также очистки экспрессированных белков хорошо известны в этой области техники и описаны, например, в Sambrook et al. (2001) "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 3-е издание, Sambrook et al. (eds). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, включено в данный документ посредством отсылки.

Понятие «пептид» включает в себя не только молекулы, в которых аминокислотные остатки соединены пептидными связями (-CO-NH-), но и молекулы с обращенной пептидной связью. Подобные копирующие пептиды молекулы с обращенной связью (ретроэнантиомеры) могут быть созданы с помощью методов, известных в этой области техники, например методов, описанных в Meziere et al., 1997. Данный подход включает создание псевдопептидов, содержащих изменения в остове молекулы, но не в ориентации боковых цепей. Было показано, что данные псевдопептиды эффективны, по меньшей мере, в случае ответов ГКГС класса II и Т-хелперных клеток. Пептиды-ретроэнантиомеры, которые содержат связи «-NH-CO-» вместо пептидный связей «-CO-NH-», более устойчивы к протеолизу. Аналогично, пептидная связь может совсем отсутствовать при том условии, что используется соответствующий линкерный участок, который фиксирует пространство между CI атомами аминокислотных остатков; особенно предпочтительно, если линкерный участок обладает в основном тем же распределением заряда и в основном такой же планарностью, как и пептидная связь. Также известно, что пептид может быть блокирован на N- или С-конце для того, чтобы уменьшить подверженность экзопротеолитическому расщеплению.

Таким образом, настоящее изобретение включает использование окисленных пептидных эпигонов АроВ-100, перечисленных в Таблице 1, или использование активного фрагмента одного или более из этих пептидов для иммунотерапии против окисленных ЛПНП для индуцирования обратного развития уже существующих атеросклеротических бляшек посредством активной иммунизации или пассивной иммунизации, а именно введением антител, индуцированных против данных окисленных эпитопов.

Известно, что для вакцинации пептиды АроВ-100 могут быть введены как в окисленной, так и не в окисленной форме вследствие того, что пептиды, по всей видимости, окисляются при введении in vivo. Поэтому в понятие «введение окисленного эпитопа ЛПНП» мы включаем введение неокисленного эпитопа, который станет окисленным in vivo.

Во избежание недоразумений в контексте данного изобретения все антитела для пассивной иммунизации связываются с окисленными ЛПНП.

В понятие «фрагмент» пептидного эпитопа АроВ-100, включенного в Таблицу 1, мы включаем, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислот данной последовательности. Таким образом, фрагмент может содержать 6, или 7, или 8, или 9, или 10, или 11, или 12, или 13, или 14, или 15, или 16, или 17, или 18, или 19 последовательных аминокислот данной последовательности. «Активным» называется фрагмент, который в окисленном состоянии может быть использован для индукции антител, которые индуцируют обратное развитие атеросклеротических бляшек у человека в результате активной иммунизации или пассивной иммунотерапии. Способы определения того, является ли тот или иной фрагмент пептидных эпитопов, перечисленных в Таблице 1, активным, представлены в Примерах.

В одном аспекте настоящего изобретения иммунотерапия включает введение особи, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП.

Таким образом, настоящее изобретение включает способ индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек у человека, которому это необходимо, способ, включающий введения больному, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП.

Настоящее изобретение также включает применение, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП в препарате лекарственного средства, которое индуцирует обратное развитие атеросклеротических бляшек у человека.

В воплощении настоящего изобретения введение антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, включает введение особи полинуклеотида, кодирующего указанную молекулу антитела.

Способы введения полинуклеотидов пациенту хорошо известны специалистам в данной области техники и включают применение иммунолипосом, вирусных векторов (включая вакцинии, модифицированные вакцинии и аденовирус) и прямой доставки ДНК, например, при применении генной пушки и электропорации. Например, Svensson et al., 1999, описывает доставку рекомбинантных генов в кардиомиоциты посредством инъекции внутрь миокарда или инфузией в коронарный сосуд кардиотропных векторов, таких как рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы, результатом чего являлась экспрессия трансгена в кардиомиоцитах мыши in vivo. Melo et al., 2004, опубликовали обзор по генной и клеточной терапии сердечных заболеваний. Альтернативный предпочтительный путь введения - введение через катетер или стент. Стенты предоставляют привлекательную альтернативу для локального трансгеноза, поскольку они обеспечивают платформу для пролонгированного высвобождения гена и эффективной трансдукции артериальных стенок. Данная стратегия переноса генов имеет потенциал для уменьшения системного распространения вирусных векторов, из-за чего происходит уменьшение иммунного ответа хозяина. Как для синтетических, так и для природных оболочек стентов была показана возможность обеспечения пролонгированного высвобождения гена без значительных побочных реакций (Sharif et al., 2004).

Предпочтительно, если полинуклеотид, кодирующий молекулу антитела, функционально связан с адресующими и/или регуляторными последовательностями, которые направляют экспрессию антител в артерии и желательно в артериальные стенки. Таким образом, полинуклеотид делает возможным образование специфичных антител внутри больного человека. Соответствующие последовательности для адресования и регуляции известны специалистам.

Может оказаться желательным уметь регулировать экспрессию полинуклеотида в клетке во времени. Поэтому может оказаться желательным, чтобы экспрессия полинуклеотида находилась прямо или косвенно (см. ниже) под контролем промотора, который мог бы регулироваться, например, концентрацией небольшой молекулы, которую можно было бы вводить больному, когда будет необходимо активировать или, что более вероятно, репрессировать (в зависимости от того, действует ли небольшая молекула на активацию или на репрессию упомянутого промотора) экспрессию антитела, кодируемого полинуклеотидом. Это может быть особенно удобно, если экспрессия конструкции стационарна, то есть с конструкции антитела могут экспрессироваться (в присутствии любой необходимой из регуляторных молекул) в клетке в течение периода, равного, по меньшей мере, одной неделе, одному, двум, трем, четырем, пяти, шести, восьми месяцам или одному году или более лет. Таким образом, полинуклеотид может быть функционально связан с регулируемым промотором. Примеры регулируемых промоторов включают промоторы, упомянутые в следующих статьях: Rivera et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(15), 8657-62 (контроль при помощи рапамицина - биологически доступного лекарства, принимающегося перорально, применение двух различных аденовирусных или аденоассоциированных (AAV) вирусных векторов, один из которых кодирует ген-мишень индуцибельного человеческого гормона роста (hGH), а другой кодирует состоящий из двух частей регулируемый рапамицином фактор транскрипции); Magari et al. (1997) J Clin Invest 100(11), 2865-72 (контроль при помощи рапамицина); Bueler (1999) Biol Chem 380(6), 613-22 (обзор аденоассоциированных вирусных векторов); Bohl et al. (1998) Blood 92(5), 1512-7 (контроль доксициклином в аденоассоциированном вирусном векторе); Abruzzese et al. (1996) J Mol Med 74(7), 379-92 (обзор факторов индукции, например гормонов, факторов роста, цитокинов, цитостатических средств, радиации, теплового шока и ассоциированных чувствительных элементов).

В предпочтительном воплощении молекула антитела является антителом, индуцированным против окисленного эпитопа ЛПНП, такого, например, как эпитопы, перечисленные в Таблице 1 и патенте WO 02/080954. Как подробно описано в патенте WO 02/080954, пептиды могут быть окислены при контакте с множеством агентов, таких как железо, кислород, медь, миелопероксидаза, фосфолипаза, хлорноватистая кислота, или при модификации малоновым диальдегидом (МДА) для имитирования различных модификаций аминокислотных остатков, которые могут происходить во время окисления ЛПНП. В качестве альтернативных для окисления эпитопов ЛПНП могут быть использованы другие способы, известные в этой области техники.

Выработка человеческих антител, реагирующих с пептидами, полученными из АроВ-100 и модифицированными МДА, была описана в патенте WO 02/090854 и в работе Schiopu et al., 2004). Как более подробно обсуждается ниже, человеческие или похожие на человеческие антитела также могут быть получены при применении других технологий, хорошо известных в этой области техники, включая иммунизацию мышей, трансгенных по локусу человеческого иммуноглобулина, или посредством гуманизации, например, мышиных антител с нужной специфичностью.

Под антителом, которое «селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП», мы имеем в виду то, что молекула антитела связывается с окисленным эпитопом ЛПНП с бóльшим сродством, чем с неокисленным ЛПНП. Предпочтительно, антитело связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, по меньшей мере, в 1,5, или, по меньшей мере, в 2, или, по меньшей мере, в 5, или, по меньшей мере, в 10, или, по меньшей мере, в 50 раз с большим сродством, чем с неокисленным ЛПНП.

Более предпочтительно, чтобы молекула антитела связывала окисленный эпитоп ЛПНП со средством, по меньшей мере, в 100, или, по меньшей мере, в 1000, или, по меньшей мере, в 10000 раз выше, чем неокисленный ЛПНП. Такое связывание можно измерить с использованием методов, хорошо известных в данной области, таких как система Biacore®. Предпочтительно, чтобы молекула антитела селективно связывала окисленный эпитоп ЛПНП и не связывала неокисленный ЛПНП.

Предпочтительно, если антитела имеют сродство к эпитопу-мишени, по меньшей мере, 10^-8 М, хотя антитела с большим сродством могут оказаться даже более предпочтительными.

Известно, что защитные эффекты человеческого иммунитета опосредуются семейством молекул со структурным родством, которые называются антителами. Антитела проявляют свою биологическую активность при связывании с антигенами. Связывание антител с антигенами обычно является специфичным для одного антигена, и связывание обычно происходит с высоким сродством. Антитела вырабатываются В-лимфоцитами. В крови содержится много различных антител, каждое из которых производится клоном В-клеток и каждое обладает отличающейся структурой и специфичностью по отношению к антигену. Антитела присутствуют на поверхности В-лимфоцитов, в плазме крови, в тканевой жидкости тканей и в секреторных жидкостях, таких как слюна и слизь на слизистых поверхностях. Все встречающиеся в природе антитела имеют похожую общую структуру, которая отвечает за определенную схожесть физико-химических свойств, таких как заряд и растворимость. Все антитела обладают общей центральной структурой из двух идентичных легких цепей с массой каждой цепи около 24 килодальтон и двумя идентичными тяжелыми цепями с молекулярной массой каждой цепи приблизительно равной 55-70 килодальтон. Одна легкая цепь прикреплена к каждой тяжелой цепи, и две тяжелые цепи соединены вместе. И легкая, и тяжелая цепи содержат серию повторяющихся гомологичных единиц, каждая примерно в 110 аминокислотных остатков длиной, которые независимо сворачиваются в общий глобулярный мотив, называемый иммуноглобулиновым (Ig) доменом. Участок антитела, сформированный при соединении двух тяжелых цепей, гидрофобен. Известно, что антитела, и особенно моноклональные антитела, когда подвергаются воздействию неблагоприятных физических или химических условий, расщепляются в участке, где легкие цепи присоединяются к тяжелым цепям. Поскольку антитела содержат множество остатков цистеина, они могут образовывать цистеин-цистеиновые дисульфидные связи. Все Ig домены содержат два слоя бета-складок с тремя или четырьмя тяжами антипараллельных полипептидных цепочек.

Несмотря на общее сходство молекулы антител могут быть разделены на небольшое число различных классов и подклассов на основании физико-химических свойств, таких как размер, заряд и растворимость, и по их поведению при связывании с антигенами. У людей присутствуют следующие классы молекул антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, про членов каждого класса говорят, что они принадлежат к одному изотипу. Изотипы IgA и IgG далее подразделяются на подклассы, называемые IgA1, IgA2 и IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Тяжелые цепи всех антител одного изотипа имеют обширные регионы с идентичной аминокислотной последовательностью, но отличаются от тяжелых цепей антител, принадлежащих к другим изотипам или подклассам. IgG, IgE и IgD циркулируют в виде мономеров, в то время как секретированные формы IgA и IgM являются димерами или пентамерами соответственно, которые стабилизируются J-цепью. Некоторые молекулы IgA существуют в виде мономеров или тримеров.

В понятие «антитело» или «молекулы антитела» мы включаем не только целые молекулы иммуноглобулина, которые описаны выше, но также фрагменты молекул, такие как Fab, F(ab')₂, Fv и другие фрагменты молекул иммуноглобулинов, которые сохраняют антигенсвязывающий участок. Аналогично, термин «антитело» включает производные антител, полученные при помощи генной инженерии, такие как молекулы с одной цепью Fv (scFv) и доменные антитела (dAbs). Данный термин также включает антителоподобные молекулы, которые могут быть получены с применением технологии фаговых дисплеев или других технологий случайного отбора для молекул, которые связываются с окисленными ЛПНП или с их специфичными участками. Поэтому термин «антитело» включает все молекулы, которые содержат структуру, желательно пептидную структуру, которая является частью сайта узнавания природного антитела (то есть часть антитела, которая связывается или объединяется с эпитопом или антигеном).

В распознавании антигена участвуют вариабельные домены тяжелых (V_H) и легких (V_L) цепей антитела, этот факт был впервые признан в ранних экспериментах по расщеплению протеазами. Дальнейшее подтверждение было обнаружено при «гуманизации» антител грызунов. Вариабельные домены антител грызунов могут быть слиты с константными доменами антител человека так, что полученное в результате антитело сохраняет антигенную специфичность родительского антитела грызуна (Morrison et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81, 6851-6855). Из экспериментов по экспрессии в бактериях фрагментов антител, содержащих один или более вариабельных доменов, известно, что антигенная специфичность определяется вариабельными доменами и не зависит от константных доменов. Данные молекулы включают Fab-подобные молекулы (Better et al. (1988) Science 240, 1041); молекулы Fv (Scerra et al. (1988) Science 240, 1038); одноцепочечные молекулы Fv (scFv), где домены-партнеры V_H и V_L соединены гибким олигопептидом (Bird et al. (1988) Science 242, 423; Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85, 5879), и антитела с одним доменом (dAbs), включающие изолированные V-домены (Ward et al. (1989) Nature 341, 544). Общий обзор методов, применяемых для синтеза фрагментов антител, которые включают их специфические участки связывания, можно найти в работе Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Под термином «ScFv-молекулы» мы подразумеваем молекулы, в которых домены-партнеры V_H и V_L соединены гибким олигопептидом. Сконструированные антитела, такие как ScFv-антитела, могут быть созданы при помощи технологий и подходов, описанных в работе J. Huston et al. (1988) "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in anti-digoxin single chain Fv analogue produced in E.coli", Proc Nati Acad Sci USA, 85, p.5879-5883, и в A. Pluckthun (1991) "Antibody engineering; Advances from use of E.coli expression systems", Biothecnology 9(6): 545-51, включено в данный документ путем ссылки.

Преимущества использования фрагментов антител по сравнению с использованием целых антител выше в несколько раз. Меньший размер фрагментов может приводить к улучшенным фармакологическим свойствам, таким как лучшее проникновение к месту-мишени. Устраняются эффекторные функции антител, такие как связывание комплемента. Фрагменты Fab, Fv, scFv и dAb могут быть экспрессированы E.coli и секретируются бактериями, что дает возможность легко производить большие количества данных фрагментов.

Целые антитела и фрагменты F(ab')₂ «бивалентны». Под определением «бивалентный» мы имеем в виду то, что антитела и фрагменты F(ab')₂ имеют два сайта объединения с антигеном. Напротив, фрагменты Fab, Fv, scFv и dAb моновалентны, они имеют только один участок объединения с антигеном.

Предпочтительно, чтобы антитело являлось моноклональным антителом. При некоторых обстоятельствах, особенно если антитело планируется вводить человеку-пациенту многократно, предпочтительно, чтобы антитело являлось человеческим моноклональным антителом или гуманизированным моноклональным антителом.

Подходящие моноклональные антитела, которые реагируют так, как описано в данном документе, могут быть приготовлены при помощи известных технологий, например, раскрытых в "Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H. Zola (CRC Press, 1988) или в "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", SGR Hurrell (CRC Press, 1982).

Антителам можно придавать желаемые свойства, касающиеся, например, специфичности и перекрестной реактивности, изотипа, сродства и времени полужизни в плазме крови. Возможность разработки антител с заданными свойствами стала очевидной уже при создании технологии получения моноклональных антител (Milstein and Köhler, 1975, Nature, 256: 495-7). В данной технологии используются мышиные клетки гибридомы, продуцирующие большие количества идентичных, но мышиных антител. В действительности огромное количество доклинических, а также клинических испытаний было начато с применением мышиных моноклональных антител для терапии, например, злокачественных новообразований. Однако вследствие того, что антитела были не человеческого происхождения, иммунная система пациентов распознавала их как чужеродные и вырабатывала к ним антитела. Вследствие этого эффективность и время полужизни в плазме крови мышиных антител снижались и часто побочные эффекты от аллергических реакций, вызванных чужеродным антителом, препятствовали успешному лечению.

Для разрешения этих проблем, для уменьшения мышиного компонента специфичных и потенциально терапевтических антител были предприняты несколько подходов. Первый подход представлял собой технологию создания так называемых химерных антител, у которых мышиные вариабельные домены были перенесены на человеческие константые участки, в результате чего было получено антитело, которое было в основном человеческого происхождения (Neuberger et al., 1985, Nature 314; 268-70; Neuberger et al., 1998, 8^th International Bionechnology Symposium Part 2, 792-799).

Дальнейшим усовершенствованием данного подхода являлась разработка гуманизированных антител, в которых участки мышиных антител, которые контактируют с антигеном, гипервариабельные участки (CDRs) были перенесены в конструкцию человеческого антитела. Подобные антитела получаются почти полностью человеческими и при введении пациентам редко вызывают какие-либо вредные иммунные ответы. Несколько химерных или гуманизированных антител были зарегистрированы в качестве терапевтических лекарств и в настоящее время широко применяются при различных показаниях (Borrebaeck & Carlsson, 2001, Curr. Opin Pharmacol. 1: 404-408).

Предпочтительно, если антитело представляет собой гуманизированное антитело. Полученные соответствующим образом антитела могут быть «гуманизированы» известными способами, например вставкой CDR-участков мышиных антител в конструкцию человеческого антитела. Гуманизированные антитела могут быть приготовлены с применением технологий и подходов, описанных в Verhoeyen et al. (1988) Science, 239, 1534-1536, и в Kettleborough et al. (1991) Protein Engineering, 14(7), 773-783.

Антитела, которые являются полностью человеческими, могут быть произведены при использовании технологии получения рекомбинантных антител. Обычно используются большие библиотеки, содержащие миллиарды различных антител. В отличие от предыдущих технологий, использующих создание химерных или гуманизированных мышиных антител, данная технология не основана на иммунизации животных для получения специфичных антител. Вместо этого используются рекомбинантные библиотеки, содержащие огромное число уже готовых вариантов антител, при этом вероятно, что библиотека будет содержать, по меньшей мере, одно антитело для любого антигена. Таким образом, при использовании этих библиотек может быть идентифицировано уже имеющееся антитело, обладающее необходимыми характеристиками связывания. Для того чтобы эффективно находить в библиотеке антитело с хорошими характеристиками связывания, были разработаны различные системы, где фенотип, то есть антитело или его фрагмент, сцеплен с его генотипом, то есть кодирующим геном. Наиболее часто используемой системой является так называемая система фагового дисплея, где фрагменты антитела экспрессируются и экспонируются в качестве слитого белка с поверхностными белками фага на поверхности частиц нитевидного бактериофага, при этом фаг одновременно несет генетическую информацию, кодирующую данную молекулу (McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552-554). Фаг, экспонирующий фрагменты антитела, специфичного для определенного антигена, может быть отобран посредством связывания с антигеном, о котором идет речь. Отобранный фаг затем может быть амплифицирован, и ген, кодирующий вариабельные домены отобранного антитела, может быть при желании перенесен в другие форматы антител, такие как, например, полноцепочечный иммуноглобулин, и экспрессированы в больших количествах с применением соответствующих векторов и клеток-хозяев, которые хорошо известны в этой области техники.

Формат состояний экспонированных на фаговых частицах антител может отличаться. Наиболее часто используемыми форматами являются Fab (Griffiths et al., 1994 EMBO J. 13: 3245-3260) и одноцепочечные фрагменты (scFv) (Hoogenboom et al., 1992, J. Mol Biol. 227: 381-388), оба формата содержат вариабельные домены антител, которые связывают антиген. Одноцепочечный формат состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (V_H), присоединенного к вариабельному домену легкой цепи (V_L) с помощью гибкого линкера (US 4946778). Перед применением в качестве терапевтического агента антитело может быть переведено в растворимый формат, например Fab или scFv, и анализировано в таком виде. На более поздних этапах идентифицированный фрагмент антитела, обладающий желаемыми характеристиками, может быть перенесен в другие новые форматы, такие как полноразмерные антитела.

Недавно была представлена новая технология для генерации разнообразия в библиотеках антител (патент WO 98/32845; Soderlind et al., 2000) Nature BioTechnol. 18:852-856). Все фрагменты антител, полученные из этой библиотеки, имеют одинаковые участки каркаса и отличаются только по CDR. Поскольку участки каркасов принадлежат к зародышевой последовательности, ожидается, что иммуногенность антител, полученных из данной библиотеки, или аналогичных библиотек, полученных при применении той же технологии, будет особенно низкой (Soderlind et al., 2000). Данное свойство имеет большую ценность для терапевтических антител, поскольку уменьшает риск того, что у пациента будут образовываться антитела к введенным антителам, таким образом уменьшается риск возникновения аллергических реакций, наличия блокирующих антител и обеспечивается длительное время полужизни антител в плазме.

Поэтому при разработке терапевтических антител, которые будет использованы на людях, в настоящее время применяется современная технология библиотек рекомбинантных ДНК (Soderlind et al., 2001, Comb. Chem. & High Throughput Screen. 4: 409-416), а не более ранняя гибридомная технология.

Известно, что пептиды, идентифицированные в патентной заявке WO 02/080954 и перечисленные в Таблице 1, могут быть использованы в качестве антигенов для генерации полностью человеческих антител с заранее заданными свойствами, которые могут быть особенно значимыми в качестве терапевтических антител для индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек. Ожидается, что полученные полностью человеческие антитела не будут вызывать каких-либо нежелательных иммунологических реакций при введении пациентам.

Некоторые предпочтительные антитела включают антитела, которые связываются с эпитопами АроВ-100 Р45 (аминокислотные остатки 661-680) и/или Р143 (аминокислотные остатки 2131-2150). Антитела, обладающие данной связывающей специфичностью, включают IEI-I3 (Schiopu et al., 2004) и 2D03 (описано в примере 2).

Ранее было показано, что антитело IEI-E3 в значительной степени ингибирует развитие бляшек в животных моделях (Schiopu et al., 2004). Мы продемонстрировали (см. Примеры), что оно может индуцировать обратное развитие атеросклеротических бляшек. Мы также продемонстрировали, что все другие антитела к окисленным ЛПНП с различной специфичностью, а именно 2D03, LDO-D4 и КТТ-В8, но не контрольное антитело FITC-8, могли значительно уменьшать уровень бляшек в аорте по сравнению с площадью бляшек, наблюдаемой у животных до начала терапии. CDR-последовательности антител перечислены в Таблице 2. Последовательности V_H и V_L антител IEI-E3 и КТТ-В8 представлены на Рисунке 3 патентной заявки WO 2004/030607 и включены в данный документ путем отсылки.

В другом аспекте данного изобретения иммунотерапия включает введение особи, по меньшей мере, одного окисленного эпитопа ЛПНП. Этот, по меньшей мере, один окисленный эпитоп ЛПНП влияет на индукцию иммунного ответа против окисленного эпитопа таким образом, чтобы индуцировать обратное развитие атеросклеротических бляшек у больного. Другими словами, по меньшей мере, один окисленный эпитоп ЛПНП действует как вакцина, индуцирующая иммунный ответ, который индуцирует обратное развитие атеросклеротических бляшек у вакцинированной особи.

Таким образом, настоящее изобретение включает способ индукции обратного развития (регрессии) атеросклеротических бляшек у индивидуума, который в этом нуждается, способ, включающий введение индивидууму, по меньшей мере, одного окисленного эпитопа ЛПНП.

Таким образом, данное изобретение включает, по меньшей мере, один окисленный эпитоп ЛПНП в препарате лекарственного средства для индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек у вакцинированной особи.

В основном, особь является млекопитающим, таким как лошадь, корова, овца, свинья, верблюд, собака или кошка. Более предпочтительно, если особь является человеком.

Человек обычно является пациентом, который имеет сердечно-сосудистое заболевание, связанное с атеросклерозом, или риск возникновения такого заболевания. Термин «сердечно-сосудистое заболевание, связанное с атеросклерозом» включает ссылки на болезни, которые с медицинской точки зрения связаны с атеросклерозом таким образом, что они являются следствием атеросклеротических поражений. Сердечно-сосудистые заболевания, связанные с атеросклерозом, которые должны быть упомянуты, включают болезнь коронарных артерий, инфаркт миокарда и инсульты.

Сможет ли тот или иной пациент получить пользу от терапии, определяет лечащий врач.

Известно, что поскольку способы и применения данного изобретения ведут к обратному развитию уже существующих атеросклеротических бляшек, данное изобретение включает уменьшение риска сердечно-сосудистого заболевания, связанного с атеросклерозом, у больного, у которого существует риск развития упомянутых сердечно-сосудистых заболеваний вследствие присутствия у него атеросклеротических бляшек.

Пациентом с риском развития сердечно-сосудистого заболевания, связанного с атеросклерозом, может оказаться тот, кто имеет в крови высокие уровни холестерина, которые, вероятно, могут вызывать или обострять сердечно-сосудистое заболевание или дисфункцию.

Пациентом может быть тот, кто имеет риск развития коронарного сердечного заболевания из-за множественных факторов риска (включая ожирение, курение, гипертонию, диабет и наличие в семейной истории коронарной сердечной болезни); тот, кто имеет семейные условия, характеризующиеся очень высокими концентрациями холестерина и/или триглицеридов в плазме крови; тот, у кого гиперлипидемия не является вторичной по отношению к предшествующим заболеваниям (таким, как гипотиреоидит, нефротический синдром, заболевание печени или алкоголизм); тот, у кого повышен уровень холестерина в ЛПНП; или тот, кто получает гиполипидемическую диету (дополнительное лечение).

Кроме того, известно, что, поскольку способы и применения данного изобретения ведут к уменьшению размера уже существующих атеросклеротических бляшек, данное изобретение особенно полезно для лечения пациентов с запущенным или тяжелым атеросклерозом и с запущенными или тяжелыми формами сердечно-сосудистого заболевания, связанными с атеросклерозом.

В воплощении данное изобретение может включать первый этап определения размера и/или протяженности атеросклеротических бляшек у больного. Это может быть сделано для оценки того, нуждается ли больной в терапии для уменьшения скоплений атеросклеротических бляшек, или для получения базовой линии измерений для оценки эффективности подобной терапии, или для обеих целей.

Таким образом, можно считать, что данное изобретение включает способ идентификации пациента со скоплениями атеросклеротических бляшек, нуждающегося в их уменьшении, и последующее введение больному, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или, по меньшей мере, одного окисленного эпитопа ЛПНП.

Известно, что отложения атеросклеротических бляшек, нуждающиеся в уменьшении, могут требовать уменьшения из-за размера и/или распространенности суммарного скопления бляшек. Дополнительно или в качестве альтернативы уменьшение может быть необходимым вследствие природы бляшек, например из-за их нестабильности.

Также можно считать, что данное изобретение включает применение, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или как в препарате медикамента для индукции обратного развития атеросклеротических бляшек у индивидуума, для которого была определена необходимость такого лечения, путем измерения размера, и/или количества, и/или распространенности атеросклеротических бляшек у индивидуума.

Не обязательно и обычно настоящее изобретение может также включать заключительную стадию определения размера, и/или количества, и/или распространенности атеросклеротических бляшек у пациента после введения, по меньшей мере, одного антитела, селективно связывающего окисленный эпитоп ЛПНП, или, по меньшей мере, одного окисленного эпитопа ЛПНП для того, чтобы оценить эффективность терапии по сравнению с базовым измерением, проведенным до терапии.

Доза, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, вводимого пациенту, обычно будет определяться лечащим врачом с учетом атеросклеротического состояния пациента, который будет проходить лечение, других терапевтических агентов, которые будут введены, возраста, пола и размера пациента и других факторов. Однако обычно доза, по меньшей мере, одного окисленного эпитопа ЛПНП, вводимого пациенту, будет определяться лечащим врачом на основании веса тела пациента, который проходит лечение.

Было доказано, что статины (ингибиторы 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А (НМG-СоА)-редуктазы) эффективно предотвращают острые сердечно-сосудистые события путем уменьшения содержания холестерина в плазме (и с помощью других механизмов, которые только должны быть выяснены). Введение статина совместно с описанной выше иммунотерапией может оказаться целесообразным способом терапии для усиления обратного развития атеросклеротических бляшек. Предпочтительно выбираются два режима введения для оказания взаимоусиливающего эффекта.

Поэтому в следующем аспекте изобретения представлен способ борьбы с сердечно-сосудистым заболеванием, связанным с атеросклерозом у особи при необходимости этого, включающий:

Индукцию обратного развития атеросклеротических бляшек у особи путем введения особи: (а) по меньшей мере, одной молекулы антитела, которая селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b) по меньшей мере, одного окисленного эпитопа ЛПНП; и

введение особи статина.

В следующем аспекте изобретения представлено применение: (а) по меньшей мере, одной молекулы антитела, которая селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b) по меньшей мере, одного окисленного эпитопа ЛПНП; в препарате лекарственного средства для борьбы с сердечно-сосудистым заболеванием, связанным с атеросклерозом, путем индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек, где индивидуум является тем, кому вводится статин.

В связанном аспекте изобретения представлено применение статина в препарате лекарственного средства для борьбы с сердечно-сосудистым заболеванием, связанным с атеросклерозом, где больному вводятся: (а) по меньшей мере, одна молекула антитела, которая селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b) по меньшей мере, один окисленный эпитоп ЛПНП, для индукции обратного развития атеросклеротических бляшек.

Еще один связанный аспект данного изобретения представляет применение: (а) по меньшей мере, одной молекулы антитела, которая селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b) по меньшей мере, одного окисленного эпитопа ЛПНП и статина, в препарате лекарственного средства для борьбы с сердечно-сосудистым заболеванием, связанным с атеросклерозом, путем индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек.

Дополнительно предоставляется фармацевтическая композиция, включающая: (а) по меньшей мере, одну молекулу антитела, которая селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b) по меньшей мере, один окисленный эпитоп ЛПНП и статин, в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, растворителем или носителем.

В следующем аспекте данного изобретения предоставляется набор, включающий следующие компоненты:

(а) по меньшей мере, одну молекулу антитела, которая селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b) по меньшей мере, один окисленный эпитоп ЛПНП и статин,

в котором каждый компонент представлен в форме, подходящей для введения в сочетании с другими.

В понятии «в сочетании» мы имеем в виду то, что компоненты могут быть пригодны для одновременного или комбинированного введения пациенту. Однако, поскольку может потребоваться введение компонентов различными способами или с различными скоростями, в понятие «в сочетании» мы также включаем понятие последовательного введения или раздельного введения в одном режиме терапии.

Подходящие статины включают аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.

В воплощении данного изобретения антитело может быть присоединено к противовоспалительным агентам. Соответствующие противовоспалительные агенты включают стероидные соединения, такие как дексаметазон, бетаметазон, преднизон, преднизолон, триамцинолон, гидрокортизон, алкометазон, амцинонид, дифлоразон и т.д., а также нестероидные противовоспалительные агенты. Способы присоединения веществ, таких как перечисленные выше противовоспалительные агенты, к антителам хорошо известны в данной области техники.

Следующий аспект данного изобретения предоставляет способ идентификации антитела, которое индуцирует обратное развитие атеросклеротических бляшек у больного, способ включает:

предоставление антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП и

его тестирование в анализе обратного развития атеросклеротических бляшек,

где обратное развитие атеросклеротических бляшек в анализе указывает, что антитело индуцирует обратное развитие атеросклеротических бляшек.

Анализ обратного развития атеросклеротических бляшек может быть анализом in vivo, как, например, в животных моделях, описанных в примерах 2 или 4.

Предпочтительно, чтобы тестируемое антитело было выбрано из библиотеки фрагментов человеческих антител, как описано выше.

Также предпочтительно, чтобы тестируемое антитело селективно связывалось с окисленным, в особенности MDA-модифицированным, пептидом, полученным из АроВ-100.

Идентифицированные фрагменты антител с желаемыми характеристиками обратного развития атеросклеротических бляшек затем для применения в терапевтических целях могут быть перестроены в другие конфигурации антител, например полноцепочечный иммуноглобулин человека.

Следующий аспект данного изобретения предоставляет способ идентификации агента, который индуцирует обратное развитие атеросклеротических бляшек у больного, способ включает:

предоставление агента, содержащего окисленный эпитоп ЛПНП,

введение агента больному, у которого есть атеросклеротические бляшки, и

определение того, индуцирует ли данный агент обратное развитие атеросклеротических бляшек,

где обратное развитие атеросклеротических бляшек указывает, что агент индуцирует обратное развитие атеросклеротических бляшек.

Известно, что особь может представлять собой животную модель атеросклероза, такую, какая описана в примере 2 или примере 4. В качестве альтернативы способ может быть использован в условиях клинического испытания агента, в котором особью может быть человек, у которого присутствуют атеросклеротические бляшки.

Заключительный аспект данного изобретения предоставляет антитело, включающее:

по меньшей мере, один гипервариабельный участок (CDR), который содержит аминокислотную последовательность, соответствующую CDR антитела 2D03, которая указана в Таблице 2, или,

по меньшей мере, один CDR, который содержит аминокислотную последовательность, соответствующую CDR антитела LDO D4, которая указана в Таблице 2,

Более предпочтительно, чтобы антитело содержало два, или три, или четыре, или пять CDR-участков, которые имеют последовательность соответствующих CDR-участков антител 2D03 или LDO D4.

Если антитело содержит три или четыре CDR-участка, которые обладают соответствующими CDR-участками антител 2D03 или LDO D4, предпочтительно, чтобы антитело имело все три CDR-участка тяжелых цепей или все три CDR-участка легких цепей, которые обладают последовательностью соответствующих CDR-участков антител 2D03 или LDO D4.

Таким образом, данный аспект данного изобретения включает антитело, включающее:

три CDR-участка легких цепей, которые имеют последовательности соответствующих трех CDR-участков легких цепей антитела 2D03, или

три CDR-участка тяжелых цепей, которые имеют последовательности соответствующих трех CDR-участков тяжелых цепей антитела 2D03, или

три CDR-участка легких цепей, которые имеют последовательности соответствующих трех CDR-участков легких цепей антитела LDO D4, или

три CDR-участка тяжелых цепей, которые имеют последовательности соответствующих трех CDR-участков тяжелых цепей антитела LDO D4.

Еще более предпочтительно, когда антитело содержит три CDR-участка легких цепей и три CDR-участка тяжелых цепей, которые имеют последовательности соответствующих CDR-участков антитела 2D03, или три CDR-участка легких цепей и три CDR-участка тяжелых цепей, которые имеют последовательности соответствующих CDR-участков антитела LDO D4.

Если антитело не содержит все шесть CDR-участков, которые имеют последовательности соответствующих CDR-участков антител 2D03 или LDO D4, предпочтительно, если некоторые или все из 1, 2, 3, 4 или 5 «неидентичных» CDR-участков включали бы варианты последовательности соответствующих CDR-участков антител 2D03 или LDO D4. В понятие «вариант» мы включаем значение, по которому вариант имеет последовательность, по меньшей мере, на 50% идентичную последовательности соответствующего CDR-участка, более предпочтительно, чтобы идентичность составляла, по меньшей мере, 70%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80% идентичности, или, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95%. Более предпочтительно, если вариант имеет последовательность, на 96%, или 97%, или 98%, или 99% идентичную последовательности соответствующего CDR-участка антител 2D03 или LDO D4. Обычно «вариант» последовательности CDR-участка имеет 5, или 4, или 3, или 2, или 1 аминокислотный остаток, отличающийся от последовательности соответствующего CDR-участка антител 2D03 или LDO D4.

Данный аспект изобретения включает антитело 2D03 и антитело LDO D4.

Данное изобретение также включает антитело, которое селективно связывается с эпитопом окисленного ЛПНП, с которым селективно связываются антитело 2D03 или антитело LDO D4. Способы определения того, происходит ли селективное связывание любого данного антитела с эпитопом окисленного ЛПНП, с которым селективно связываются антитело 2D03 или антитело LDO D4, хорошо известны специалисту в данной области техники.

Данное изобретение также включает фармацевтическую композицию, включающую антитело, соответствующее данному аспекту изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель; антитело согласно данному аспекту настоящего изобретения для применения в медицине; и применение антитела, соответствующего данному аспекту изобретения, в препарате лекарственного средства для индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек.

Все документы, на которые есть ссылка в данном документе, во всей своей полноте включены в данный документ в виде ссылок.

Перечисление или обсуждение ранее опубликованного документа в данном описании изобретения не должны в обязательном порядке восприниматься как признание того, что этот документ является частью уровня техники или представляет собой общеизвестное знание.

Перечень фигур

Теперь данное изобретение будет описано более детально с помощью ссылок на следующие Примеры и Фигуры.

Фигура 1. Люминесцентный ELISA-анализ, демонстрирующий связывание антител 2D03 и IEI-E3 с окисленными и нативными формами ЛПНП и Аро-В100. Приставка MDA означает модифицированные MDA формы ЛПНП и Аро-В100, в то время как Na означает нативные формы данных сущностей. Cu-ЛПНП означает окисленные медью ЛПНП. Связывание детектировалось с помощью конъюгированных с пероксидазой IgG к человеческим антителам (RLU - относительные единицы люминесценции).

Фигура 2. Анализ связывания (на основе ELISA) антител 2D03 и IEI-E3 с MDA-модифицированным человеческим Аро-В100. Контроль соответствует связыванию антитела FITC-8 с тем же антигеном. Сродство определялось анализом на Biacore.

Фигура 3. Связывание одноцепочечного фрагмента (scFv) антител IEI-E3 и 2D03 с рядом различных MDA-модифицированных антигенов. Р2 (аминокислоты [ак] 16-31); Р45 (ак 661-680); Р129 (ак 1921-1940); Р143 (ак 2131-2150); Р210 (ак 3136-3155) и Р301 (ак 4502-4521) представляют собой пептиды, соответствующие определенным участкам последовательности человеческого Аро-В100. Контрольным пептидом был не относящийся к Аро-В100 лизинсодержащий пептид (MDA-модифицированный, черный). Данные представлены в виде сигнал/10⁵. Сокращения такие же, как были определены в тексте.

Фигура 4. Иммуногистохимическое окрашивание человеческих бляшек с антителами 2D03, IEI-E3 и контрольным антителом FITC-8. Связанное антитело детектировалось с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела и окрашивания диаминобензидином.

Фигура 5. Площадь бляшек в нисходящей аорте мышей АроВес с атеросклерозом, получавших терапию антителами 2D03 и IEI-E3, LDO-D4 и KIT B8, которые специфичны к окисленным ЛПНП. В качестве контроля использовали антитело соответствующего изотипа FITC-8. Площадь бляшек оценивали окрашиванием Oil Red О. Значения представлены как процент общей площади бляшек от общей площади нисходящей аорты.

Фигура 6. Обработка человеческих макрофагов, происходящих из моноцитов, IgG к окисленным ЛПНП блокирует высвобождение МСР-100. Человеческие макрофаги, происходящие из моноцитов, прокультивированные в течение 10 дней в присутствии человеческой сыворотки, в течение 4 дней обрабатывались 60 мкг/мл клонами IgG1 к окисленным ЛПНП, отрицательным контролем IgG или только физиологическим раствором, как указано. Супернатанты отделяли и анализировали на содержание МСР-100 при помощи коммерчески доступного ELISA. Данные представлены в виде среднего трех значений, полученных от четырех доноров, и стандартной ошибки среднего.

Фигура 7. Эффект блокирования МСР с помощью IgG к окисленным ЛПНП на атеромаподобных макрофагах был быстрым и стабильным во времени. Человеческие моноциты или человеческие макрофаги, происходящие из моноцитов, были получены от двух доноров (кружки и квадраты соответственно). Клетки обрабатывали 60 мкг/мл антитела 2D03 (закрытые символы) или контрольным антителом (открытые символы) или сразу (левая часть графика), или после прекультивирования моноцитов в течение 14 дней в присутствии человеческой сыворотки (правая часть графика). Супернатанты отделяли и анализировали на содержание хемокина МСР^-1 СС при помощи коммерчески доступного ELISA. Данные представлены в виде среднего трех значений и стандартной ошибки среднего.

Осуществление изобретения

Пример 1: Получение человеческих антител с высоким сродством и специфичностью к эпитопам, присутствующим на окисленных ЛПНП.

Фрагменты человеческих антител, специфично связывающих окисленные ЛПНП, были выбраны из библиотеки n-CoDeR практически так, как описано (Schiopu et al., 2004). Кратко, библиотеку экспрессировали с помощью метода фагового дисплея и отобрали для связывания со смесью биотинилированных окисленных пептидов, полученных из Аро-В100. Связанные фаги были отобраны с помощью покрытых авидином магнитных частиц 2-3 циклами отбора (Soderlind et al. (2000) Nature BioTechnol. 18: 852-856) и окончательно проверены на связывание с MDA-модифицированными и окисленными Сu формами ЛПНП и АроВ-100. Антитела связывались с MDA-модифицированными и окисленными Cu формами ЛПНП и АроВ-100, но не связывали их нативные, неокисленные формы (Фигура 1). Примеры связывания и сродства антител представлены на Фигуре 2, на которой связывание антитела 2D03 сравнивается со связыванием антитела IEI-E3. Сравнение специфичности связывания 2D03 и IEI-E3 выявило, что они обладают сходной, но не идентичной специфичностью к MDA-модифицированным формам пептидов, полученных из АроВ-100, и 2D03 дает в анализе больший сигнал (Фигура 3).

Как показано на Фигуре 4, при помощи иммуногистохимии было оценено, что антитела также специфично связываются с человеческими атеросклеротическими бляшками, но не с нормальной тканью.

Пример 2: Обратное развитие атеросклеротических бляшек в животной модели при применении иммунотерапии, основанной на пассивной иммунизации.

Способы

Антитела

Выбранные scFv с желаемыми свойствами были перенесены в формат полноразмерного человеческого антитела IgG1 с применением ранее описанных способов (Schiopu et al., 2004).

Мыши, пассивная иммунизация и препараты тканей.

В данном исследовании были использованы самцы мышей LDLR^-/- АроВес на основе C57BL/6 из Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). С 4-недельного возраста мышей кормили диетой с высоким содержанием холестерина (0,15% холестерин, 21% жира, Lactamin AB, Kimstad, Sweeden), предоставленной в неограниченном количестве. За одну неделю до первой иммунизации диета была изменена на нормальную пищу. В возрасте 25 недель одна группа мышей была умерщвлена в качестве контроля уровня образования бляшек в начале эксперимента, а трем оставшимся группам внутрибрюшинно инъецировали 1 мл на дозу человеческих антител IgG1, специфичных к MDA-модифицированным пептидам АроВ-100, или контрольное антитело соответственно. В качестве контроля использовали неспецифическое человеческое антитело IgG1 к флуоресцеинизотиоцианату (FITC-8). Инъекции повторяли два раза с интервалами в одну неделю.

В возрасте 29 недель мышей, анестезированных внутрибрюшинным введением 300 мкл раствора из дистиллированной воды, фентанила/флуанизона и мидазолама (2:1:1, объем/объем/объем), гуманно умертвили путем обескровливания через пункцию сердца. После перфузии всего тела фосфатно-солевым буфером и следовавшего за ней Histochoice (Amresco, Solon, Ohio) сердце вырезали и хранили в Histochoice при 4° до обработки. Нисходящая аорта была отделена от внешнего жира и соединительных тканей, разрезана вдоль, закреплена en face просветом вверх на покрытых яичным альбумином (Sigma, St. Louis, Missouri) предметных стеклах (так называемый плоский препарат) (Branen et al., 2001). Местный Комитет по Биоэтике одобрил экспериментальный протокол, использованный в данном исследовании.

Анализ площади бляшек

Окрашивание и количественное определение площади бляшек в плоских препаратах нисходящей аорты было проведено, как описано ранее (Fredriksson et al., 2003). Площадь бляшек была непосредственно измерена посредством микроскопии и морфометрии с применением компьютера (Image Pro Plus), и результаты были выражены как среднее значение площади бляшек на срез.

Статистический анализ

Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение. Анализ данных был проведен с применением двустороннего критерия Манна-Уитни. Результаты считались статистически значимыми при уровне ≤0,05.

Результаты

В данном исследовании проводили сравнение рекомбинантных человеческих антител IgG1, направленных против окисленных ЛПНП. Ранее мы продемонстрировали, что антитело IEI-E3 эффективно ингибирует раннее развитие атеросклероза у мышей АроЕ^-/- (Sciopu et al., 2004). В качестве изотипического контроля было использовано человеческое антитело IgG1, направленное против флуоресцеинизотиоцианата, FITC-8, которое не связывается с нативными или окисленными ЛПНП.

Эффект антител на развитие атеросклероза был протестирован на мышах LDLR^-/- АроВес. Мыши получали три внутрибрюшинные инъекции 1 мг антитела в дозе в возрасте 25, 26 и 27 недель и были умерщвлены через 2 недели после последней инъекции, в возрасте 29 недель. Терапия антителами не влияла на общее состояние здоровья мышей. Значительные отличия по весу и уровням в плазме холестерина и триацилглицерола между исследуемыми и контрольными группами отсутствовали (данные не приведены). Одна группа животных была умерщвлена в начале исследования для определения базового уровня скопления бляшек.

Степень атеросклероза была измерена на окрашенных Oil Red О en face-препаратах грудной аорты и брюшной аорты. Как показано на Фигуре 5, все исследованные антитела индуцировали значительное обратное развитие скопления бляшек в получавших терапию животных по сравнению с контрольными антителами и базовым значением, полученным на мышах в возрасте 25 недель. Антитело 2D03 продемонстрировало максимальный уровень обратного развития с эффектом, равным 51% (р=0,0003), по сравнению с антителом FITC-8, и равным 60% (р=0,003), по сравнению с базовым значением. Другие антитела также значительно уменьшали скопление бляшек (p<0,01) по сравнению с группой, получавшей FITC-8, или с базовым значением.

Обсуждение

Настоящее исследование продемонстрировало, что терапия рекомбинантными человеческими антителами IgG1 против эпитопов окисленных ЛПНП на животной модели значительно уменьшает скопление атеросклеротических бляшек в нисходящей аорте. Похоже, что более эффективно связывающееся антитело 2D03 оказывает более сильный эффект, чем IEI-E3 и другие антитела, но различия по площади бляшек в группах, получавших антитела, были недостоверными. Этот результат впервые демонстрирует, что антитела, связывающиеся с окисленными формами ЛПНП, имеют способность индуцировать обратное развитие атеросклеротических бляшек.

Антитела, обнаруженные в плазме у людей и направленные против окисленных ЛПНП, были ассоциированы с длительностью болезни, прогрессированием и степенью активности во многих исследованиях (Tsimikas et al., 2001, Salonen et al., 1992, Maggi et al., 1993). Титры подобных антител в будущем могут быть полезны в качестве маркеров для детектирования присутствия нестабильных бляшек у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями (Nilsson and Fredriksson, 2004, Nilsson and Kovanen, 2004).

Пациенты с высокой степенью риска возникновения инфаркта миокарда и инсульта нуждаются в немедленной, быстродействующей и эффективной терапии. Статины (ингибиторы HMG-CoA) эффективны в предотвращении острых сердечно-сосудистых заболеваний за счет уменьшения содержания холестерина в плазме и дополнительных механизмов, которые еще должны быть выяснены. Были начаты непрерывные попытки разработать новые средства терапии, которые, не заменяя статинов, добавили бы свое действие при использовании других, дополняющих механизмов.

Поэтому прямая непосредственная эффективная терапия антителами могла бы стать решением для пациентов в группе риска, которые близки к опасному для жизни цереброваскулярному или сердечному эпизоду. В настоящем исследовании мы показали, что переведение мышей с диеты западного типа к нормальному питанию с последующим введением трех доз антител, выраженность атеросклероза уменьшилась на 50% в течение 4-х недельного периода. Как указано выше, на момент начала терапии у мышей уже наблюдался комплекс атеросклеротических бляшек.

Терапия антителами у человека может оказаться даже более эффективной, чем у мышей. Антитела, которые мы использовали, были человеческими антителами IgG1, полученными против человеческих окисленных ЛПНП АроВ-100. Гомология между человеческим и мышиным АроВ-100 не абсолютна, что ухудшает в известной мере связывание человеческих антител с мышиными окисленными ЛПНП. Иммунная система мышей реагирует на чужеродные человеческие антитела, образуя мышиные антитела к человеческим IgG1, что отрицательно коррелирует с количеством введенных антител, которые все еще присутствуют в плазме на момент эвтаназии, как было продемонстрировано ранее (Schiopu et al., 2004). Данные антитела могут уменьшать эффективность терапии у мышей человеческими антителами IgG1 путем блокирования их сайтов связывания или индуцируя их выведение из кровотока.

Пример 3: Модуляция воспалительной активности макрофагов антителами против окисленных эпитопов ЛПНП

Молекулярные механизмы, лежащие в основе эффектов защиты от атеросклероза посредством терапии антителами к окисленному АроВ-100 (охАроВ-100), охарактеризованы не полностью. Однако роль макрофагов в развитии и гомеостазе бляшек (Li and Glass, 2002) и наблюдение того, что терапия антителами против охАроВ-100 уменьшает содержание макрофагов в бляшках in vivo (Schiopu et al., 2004), указывает на механизмы, которые регулируют рекрутинг и функционирование макрофагов. Метаболический путь МСР-1, образованный МСР-1 и его рецептором CCR2, является наиболее важным хемотаксическим регулятором инфильтрации и миграции моноцитов и макрофагов и на различных уровнях вовлечен в атерогеный процесс (Charo and Taubman, 2004). И поэтому мы исследовали вероятность того, что эффекты защиты от атеросклероза IgG против охАроВ-100 включают интерференцию сигнального пути МСР-1.

При обработке человеческих макрофагов, происходящих из моноцитов, IgG против охАроВ-100 было обнаружено уменьшение высвобождения МСР-1 вплоть до 60% по сравнению с клетками, обработанными контрольным IgG (Фигура 6). Ингибиторный эффект можно было оттитровать, максимальные эффекты наблюдались от 30 до 60 мкг/мл. Эффект блокирования МСР-1 антителами против охАроВ-100 на зрелых макрофагах был быстрым и стабильным во времени (Фигура 7). Концентрации МСР-1 в супернатантах, изолированных через 24, 48, 72 или 96 часов после инкубации с IgG против охАроВ-100, оставались постоянными, на низком уровне. Напротив, при обработке контрольным IgG наблюдалось равномерное увеличение концентрации МСР-1 во времени. Эффект блокирования МСР-1 был даже ярче выражен, когда антитела инкубировали со свежевыделенными моноцитами (Фигура 7). В результате обработки моноцитов IgG против охАроВ-100 в течение 48 часов наблюдалось поразительное уменьшение в 60 раз концентраций МСР-1 по сравнению с клетками, обработанными контрольным IgG.

Также было обнаружено, что обработка IgG против охАроВ-100 регулирует синтез МСР-1 на транскрипционном уровне. Свежевыделенные моноциты инкубировали с IgG против охАроВ-100 или с контрольным IgG в течение двух дней. Клетки были собраны и была выделена мРНК, количество которой было определено с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов была связана с 18S РНК. Клетки моноцитов, инкубированные с IgG против охАроВ-100 в течение двух дней, продемонстрировали 80% уменьшение уровня мРНК МСР-1 по сравнению с клетками, обработанными контрольным IgG (данные не приведены).

Эффект блокирования МСР-1 IgG против охАроВ-100 не был следствием общего цитотоксического эффекта. Макрофаги, собранные после обработки IgG против охАроВ-100, были полностью жизнеспособны, как было определено окрашиванием трипановым синим и последующим анализом при помощи светового микроскопа.

Наши результаты означают, что защитные эффекты против атеросклероза, которые оказывают антитела против охАроВ-100, включают ингибиторное воздействие на высвобождение МСР-1 в моноцитах и макрофагах. В рекрутинге моноцитов и макрофагов, а также в их миграции во время здорового состояния и болезни МСР-1 является основным фактором. В особенности делеция тронного СС-хемокина моноцитов/макрофагов МСР-1 (Gu et al., 1998) или его соответствующего рецептора CCR2 (Boring et al., 1998) защищает мышей от атеросклероза in vivo. При стимуляции моноцитов МСР-1 in vitro была показана стимуляция трансэндотелиальной миграции моноцитов, а в присутствии охЛПНП была показана стимуляция макрофагов к трансформации в пенистые клетки (Tangirala et al., 1997). Не желая быть связанными теорией, мы предположили, что обработка антителами против охАроВ-100 может обеспечивать селективное ингибирование высвобождения МСР-1, таким образом сводя к минимуму потенциальные побочные эффекты ингибирования миграции моноцитов к местам воспаления, не связанным с атеросклеротическими бляшками.

Пример 4: Индукция обратного развития атеросклеротических бляшек в животной модели с применением иммунотерапии, основанной на активной иммунизации

Ранее было продемонстрировано, что иммунизация охЛПНП (Palinski et al., 1995, Ameli et al., 1996, Freigang et al., 1998, Zhou et al., 2001, Nilsson et al., 1997) или пептидами ApoB-100 (Fredriksson et al., 2003) эффективна у мышей, и в настоящее время исследования по созданию вакцины против атеросклероза находятся в процессе разработки (Nilsson et al., 2004; Hansson et al., 2002; Sherer & Shoenfeld, 2002; Zhou & Hansson, 2004).

Для того чтобы исследовать возможность вакцинации против пептидов, полученных из окисленного ApoB-100 для уменьшения размеров атеросклеротических бляшек, мышей LDLR^-/- АроВес кормили диетой с высоким содержанием жиров в течение 21 недели, начиная с 4-недельного возраста. Когда мыши достигали 25-недельного возраста, одну группу животных умерщвляли и определяли степень атеросклероза в нисходящих аортах. Данная группа служила в качестве группы базового уровня, с которым сравнивали степень атеросклероза в других группах. Исследуемых животных, которых вакцинировали пептидами или только фосфатно-солевым буфером, сняли с диеты с высоким содержанием жиров и делали им инъекции в течение нескольких недель, после чего животных умертвили и определяли степень атеросклероза.

Выше, в Примере 2, мы продемонстрировали, что степень скопления бляшек сохраняет стабильность в течение 4-недельного периода с 25 до 29 недели, когда животные сняты с диеты с высоким содержанием жиров. Анализ показал, что у животных в группе базового уровня в возрасте 25 недель 10% от площади нисходящей аорты покрыты бляшками. Было продемонстрировано, что у вакцинированных животных скопление бляшек уменьшено по сравнению с контрольной группой и группой базового уровня. Это демонстрирует, что иммунизация против эпитопов, обнаруженных в окисленных формах ЛПНП, может приводить к уменьшению скопления уже существующих бляшек и свидетельствует о том, что вакцинация может быть эффективным способом уменьшения скопления бляшек у пациентов.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено применение иммунотерапии для индукции обратного развития атеросклеротических бляшек, включающее введение окисленных липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), содержащих эпитоп АроВ-100, или антител к ним. Также рассмотрены способ индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек, способ лечения, применение окисленных эпитопов ЛПНП и антител к ним для получения лекарственного средства, фармацевтическая композиция, набор, а также способы идентификации антител и агентов, которые индуцируют обратное развитие атеросклеротических бляшек. Использование настоящего изобретения может найти дальнейшее применение в лечении различных заболеваний, связанных с атеросклерозом. 10 н. и 63 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 4 пр.

1. Применение иммунотерапии против окисленных липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) для индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек у особи,
где иммунотерапия включает либо введение окисленных эпитопов ЛПНП либо антител к окисленным эпитопам ЛПНП,
где иммунотерапия направлена против окисленных эпитопов ЛПНП, где
окисленный эпитоп ЛПНП включает окисленный эпитоп АроВ-100,
где эпитоп АроВ-100 выбирается из пептидов, перечисленных в Таблице 1, или фрагмента, содержащего, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков пептида, перечисленного в Таблице 1.

2. Применение по п.1, где иммунотерапия направлена против эпитопа, присутствующего на окисленном ЛПНП, но отсутствующего на нативном ЛПНП.

3. Применение по п.1 или 2, где иммунотерапия направлена против, по меньшей мере, одного окисленного липидного эпитопа, присутствующего на окисленном ЛПНП.

4. Применение по п.1, где антитело, которое селективно связывает эпитоп окисленного ЛПНП, включает: по меньшей мере, один гипервариабельный участок (CDR), который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 39-44, или, по меньшей мере, один CDR, который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:45-50.

5. Применение по п.4, где антитело включает: три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:42-44, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO: 39-41, или три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:48-50, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:45-47.

6. Применение по п.5, где антитело включает: три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO: 39-44, или три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO:45-50.

7. Способ индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек у особи, которая в этом нуждается, включающий введение особи:
(a) по меньшей мере, одного антитела или фрагмента антитела, которые селективно связываются с окисленным эпитопом ЛПНП, или
(b) по меньшей мере, одного окисленного эпитопа ЛПНП, где окисленный эпитоп ЛПНП включает окисленный эпитоп АроВ-100, где эпитоп АроВ-100 выбирают из пептидов, перечисленных в Таблице 1, или который представляет собой фрагмент, содержащий, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков пептида, перечисленного в Таблице 1.

8. Способ по п.7, где окисленный эпитоп ЛПНП включает окисленный липидный эпитоп ЛПНП.

9. Способ по п.7, где окисленный эпитоп ЛПНП включает эпитоп ЛПНП, который был окислен путем экспозиции с медью или малоновым диальдегидом (MDA).

10. Способ по п.7, где антитело является гуманизированным антителом.

11. Способ по п.7, где антитело является фрагментом антитела.

12. Способ по п.11, где фрагмент антитела является фрагментом одноцепочечного антитела (scFv).

13. Способ по п.7, где особь является человеческой особью.

14. Способ по п.13, где человеческая особь является особью с сердечно-сосудистым заболеванием или риском развития сердечно-сосудистого заболевания, связанного с атеросклерозом.

15. Способ по п.14, где сердечно-сосудистое заболевание, связанное с атеросклерозом, выбирают из болезни коронарных артерий, инфаркта миокарда и инсульта.

16. Способ по любому из пп.13-15, где человеческая особь является особью с запущенным или тяжелым атеросклерозом, или с запущенными или тяжелыми формами сердечно-сосудистого заболевания, связанного с атеросклерозом.

17. Способ по п.7, дополнительно включающий предварительную стадию определения размера, и/или количества, и/или степени атеросклеротических бляшек у особи.

18. Способ по п.7, дополнительно включающий последующий этап определения степени обратного развития атеросклеротических бляшек у особи.

19. Способ по п.7, где антитело, которое селективно связывает эпитоп окисленного ЛПНП, включает: по меньшей мере, один гипервариабельный участок (CDR), который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 39-44, или, по меньшей мере, один CDR, который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:45-50.

20. Способ по п.19, где антитело включает: три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:42-44, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO: 39-41, или три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:48-50, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:45-47.

21. Способ по п.20, где антитело включает: три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO: 39-44, или три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID N0:45-50.

22. Применение (а), по меньшей мере, одного антитела или фрагмента антитела, которые селективно связываются с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b), по меньшей мере, одного окисленного эпитопа ЛПНП, при получении лекарственного средства, которое индуцирует обратное развитие атеросклеротических бляшек у особи, где окисленный эпитоп ЛПНП включает окисленный эпитоп АроВ-100, где эпитоп АроВ-100 выбирают из пептидов, перечисленных в Таблице 1, или который представляет собой фрагмент, содержащий, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков пептида, перечисленного в Таблице 1.

23. Применение по п.22, где окисленный эпитоп ЛПНП включает окисленный липидный эпитоп ЛПНП.

24. Применение по п.22, где окисленный эпитоп ЛПНП включает эпитоп ЛПНП, который был окислен путем экспозиции с медью или малоновым диальдегидом (MDA).

25. Применение по п.22, где антитело является гуманизированным антителом.

26. Применение по п.22, где антитело является фрагментом антитела.

27. Применение по п.26, где фрагмент антитела является фрагментом одноцепочечного антитела (scFv).

28. Применение по п.22, где особь является человеческой особью.

29. Применение по п.28, где человеческая особь является особью с сердечно-сосудистым заболеванием или риском развития сердечно-сосудистого заболевания, связанного с атеросклерозом.

30. Применение по п.29, где сердечно-сосудистое заболевание, связанное с атеросклерозом, выбирают из болезни коронарных артерий, инфаркта миокарда и инсульта.

31. Применение по любому из пп.28-30, где человеческая особь является особью с запущенным или тяжелым атеросклерозом, или с запущенными или тяжелыми формами сердечно-сосудистого заболевания, связанного с атеросклерозом.

32. Применение по п.22, где лекарственное средство для борьбы с сердечно-сосудистым заболеванием, связанным с атеросклерозом, дополнительно содержит статин, где особь является такой особью, которой для индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек вводится (а) молекула, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b), по меньшей мере, один окисленный эпитоп ЛПНП.

33. Применение по п.32, где статин выбирается из аторвастатина, церивастатина, флувастатина, ловастатина, мевастатина, правастатина, розувастатина и симвастатина.

34. Применение по любому из пп.32 и 33, где обратное развитие атеросклеротических бляшек включает, по меньшей мере, 5%-ное уменьшение площади атеросклеротических бляшек в аорте особи.

35. Применение по п.22, где антитело, которое селективно связывает эпитоп окисленного ЛПНП, включает: по меньшей мере, один гипервариабельный участок (CDR), который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 39-44, или, по меньшей мере, один CDR, который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:45-50.

36. Применение по п.35, где антитело включает: три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:42-44, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO: 39-41, или три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:48-50, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:45-47.

37. Применение по п.36, где антитело включает: три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO: 39-44, или три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO:45-50.

38. Способ лечения сердечно-сосудистого заболевания, связанного с атеросклерозом, который включает: индуцирование обратного развития атеросклеротических бляшек у особи путем введения особи (а) молекулы, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b), по меньшей мере, одного, окисленного эпитопа ЛПНП; и введение особи статина, где окисленный эпитоп ЛПНП включает окисленный эпитоп АроВ-100, где эпитоп АроВ-100 выбирают из пептидов, перечисленных в Таблице 1, или который представляет собой фрагмент, содержащий, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков пептида, перечисленного в Таблице 1.

39. Способ по п.38, где статин выбирается из аторвастатина, церивастатина, флувастатина, ловастатина, мевастатина, правастатина, розувастатина и симвастатина.

40. Способ по любому из пп.38 и 39, где обратное развитие атеросклеротических бляшек включает, по меньшей мере, 5%-ное уменьшение площади атеросклеротических бляшек в аорте особи.

41. Способ по п.38, где антитело, которое селективно связывает эпитоп окисленного ЛПНП, включает: по меньшей мере, один гипервариабельный участок (CDR), который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 39-44, или, по меньшей мере, один CDR, который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:45-50.

42. Способ по п.41, где антитело включает: три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:42-44, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO: 39-41, или три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:48-50, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:45-47.

43. Способ по п.42, где антитело включает: три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO: 39-44, или три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO:45-50.

44. Применение: (а) молекулы, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b), по меньшей мере, одного окисленного эпитопа ЛПНП; при получении лекарственного средства для борьбы с сердечно-сосудистым заболеванием, связанным с атеросклерозом, путем индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек, где особь является такой особью, которой вводится статин, где окисленный эпитоп ЛПНП включает окисленный эпитоп АроВ-100, где эпитоп АроВ-100 выбирают из пептидов, перечисленных в Таблице 1, или который представляет собой фрагмент, содержащий, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков пептида, перечисленного в Таблице 1.

45. Применение по п.44, где статин выбирается из аторвастатина, церивастатина, флувастатина, ловастатина, мевастатина, правастатина, розувастатина и симвастатина.

46. Применение по любому из пп.44 и 45, где обратное развитие атеросклеротических бляшек включает, по меньшей мере, 5%-ное уменьшение площади атеросклеротических бляшек в аорте особи.

47. Применение по п.44, где антитело, которое селективно связывает эпитоп окисленного ЛПНП, включает: по меньшей мере, один гипервариабельный участок (CDR), который обладает аминокислотной последовательностью выбранной из SEQ ID NO: 39-44, или, по меньшей мере, один CDR, который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:45-50.

48. Применение по п.47, где антитело включает: три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:42-44, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO: 39-41, или три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:48-50, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:45-47.

49. Применение по п.48, где антитело включает: три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO: 39-44, или три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO:45-50.

50. Применение (а) молекулы, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b), по меньшей мере, одного окисленного эпитопа ЛПНП, и статина при получении лекарственного средства для борьбы с сердечно-сосудистым заболеванием, связанным с атеросклерозом, путем индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек, где окисленный эпитоп ЛПНП включает окисленный эпитоп АроВ-100, где эпитоп АроВ-100 выбирают из пептидов, перечисленных в Таблице 1, или который представляет собой фрагмент, содержащий, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков пептида, перечисленного в Таблице 1.

51. Применение по п.50, где статин выбирается из аторвастатина, церивастатина, флувастатина, ловастатина, мевастатина, правастатина, розувастатина и симвастатина.

52. Применение по любому из предшествующих пп.50 и 51, где обратное развитие атеросклеротических бляшек включает, по меньшей мере, 5%-ное уменьшение площади атеросклеротических бляшек в аорте особи.

53. Применение по п.50, где антитело, которое селективно связывает эпитоп окисленного ЛПНП, включает: по меньшей мере, один гипервариабельный участок (CDR), который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 39-44, или, по меньшей мере, один CDR, который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:45-50.

54. Применение по п.54, где антитело включает: три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:42-44, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO: 39-41, или три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:48-50, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:45-47.

55. Применение по п.54, где антитело включает: три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO: 39-44, или три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO:45-50.

56. Фармацевтическая композиция для индукции обратного развития атеросклеротических бляшек, содержащая (а) молекулу, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b), по меньшей мере, один окисленный эпитоп ЛПНП, и статин, и фармакологически приемлемый адъювант, растворитель или носитель, где окисленный эпитоп ЛПНП включает окисленный эпитоп АроВ-100, где эпитоп АроВ-100 выбирают из пептидов, перечисленных в Таблице 1, или который представляет собой фрагмент, содержащий, по-меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков пептида, перечисленного в Таблице 1.

57. Фармацевтическая композиция по п.56, где статин выбирается из аторвастатина, церивастатина, флувастатина, ловастатина, мевастатина, правастатина, розувастатина и симвастатина.

58. Фармацевтическая композиция по любому из пп.56 и 57, где обратное развитие атеросклеротических бляшек включает, по меньшей мере, 5%-ное уменьшение площади атеросклеротических бляшек в аорте особи.

59. Фармацевтическая композиция по п.56, где антитело, которое селективно связывает эпитоп окисленного ЛПНП, включает: по меньшей мере, один гипервариабельный участок (CDR), который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 39-44, или, по меньшей мере, один CDR, который обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:45-50.

60. Фармацевтическая композиция по п.59, где антитело включает: три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:42-44, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO: 39-41, или три CDR легкой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:48-50, или три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью SEQ ID NO:45-47.

61. Фармацевтическая композиция по п.60, где антитело включает: три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO: 39-44, или три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, которые обладают последовательностью соответствующих CDR, выбранных из SEQ ID NO:45-50.

62. Набор для индукции обратного развития атеросклеротических бляшек, содержащий: (а), по меньшей мере, одно антитело, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, или (b), по меньшей мере, один окисленный эпитоп ЛПНП; и статин, где каждый компонент предоставляется в форме, подходящей для введения в сочетании с другими, где окисленный эпитоп ЛПНП включает окисленный эпитоп АроВ-100, где эпитоп АроВ-100 выбирают из пептидов, перечисленных в Таблице 1, или который представляет собой фрагмент, содержащий, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков пептида, перечисленного в Таблице 1.

63. Набор по п.62, где статин выбирается из аторвастатина, церивастатина, флувастатина, ловастатина, мевастатина, правастатина, розувастатина и симвастатина.

64. Набор по любому из пп.62 и 63, где обратное развитие атеросклеротических бляшек включает, по меньшей мере, 5%-ное уменьшение площади атеросклеротических бляшек в аорте особи.

65. Способ идентификации антитела, которое индуцирует обратное развитие атеросклеротических бляшек у особи, который включает: предоставление антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, и тестирование антитела в анализе на обратное развитие атеросклеротических бляшек, где обратное развитие атеросклеротических бляшек в анализе указывает, что антитело является таким антителом, которое индуцирует обратное развитие атеросклеротических бляшек, где окисленный эпитоп ЛПНП включает окисленный эпитоп АроВ-100, где эпитоп АроВ-100 выбирают из пептидов, перечисленных в Таблице 1, или который представляет собой фрагмент, содержащий, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков пептида, перечисленного в Таблице 1.

66. Способ по п.65, где анализ обратного развития атеросклеротических бляшек является анализом in vivo, с использованием животной модели атеросклероза.

67. Способ по п.65, где антитело было выделено из библиотеки фрагментов человеческих антител.

68. Способ по п.65, где антитело селективно связывается с окисленным эпитопом АроВ-100.

69. Способ по любому из пп.65-68, где обратное развитие атеросклеротических бляшек включает, по меньшей мере, 5%-ное уменьшение площади атеросклеротических бляшек в аорте особи.

70. Способ идентификации агента, который индуцирует обратное развитие атеросклеротических бляшек, включающий: предоставление агента, содержащего окисленный эпитоп ЛПНП, введение агента особи, у которой имеются атеросклеротические бляшки, и определение того, индуцирует ли агент обратное развитие атеросклеротических бляшек, где обратное развитие атеросклеротических бляшек указывает на то, что агент является агентом, который индуцирует обратное развитие атеросклеротических бляшек, где окисленный эпитоп ЛПНП включает окисленный эпитоп АроВ-100, где эпитоп АроВ-100 выбирают из пептидов, перечисленных в Таблице 1, или который представляет собой фрагмент, содержащий, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков пептида, перечисленного в Таблице 1.

71. Способ по п.70, где определение того, индуцирует ли агент обратное развитие атеросклеротических бляшек, включает анализ in vivo с использованием животной модели атеросклероза.

72. Способ по п.70, где определение того, индуцирует ли агент обратное развитие атеросклеротических бляшек, включает тестирование агента в человеческой особи, у которой имеются атеросклеротические бляшки.

73. Способ по любому из пп.70-72, где обратное развитие атеросклеротических бляшек включает, по меньшей мере, 5%-ное уменьшение площади атеросклеротических бляшек в аорте особи.