ФРАГМЕНТЫ ПЕПТИДОВ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И ВАКЦИНЫ НА ИХ ОСНОВЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ТЕРАПИИ АТЕРОСКЛЕРОЗА Российский патент 2007 года по МПК A61K38/10 A61K38/00 A61P9/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым пептидам, в частности к пептидам, предназначенным для применения при лечении атеросклероза, и к разработке на основе пептидов ИФА для определения иммунного ответа против окисленного липопротеина низкой плотности и диагностики наличия или отсутствия атеросклероза.

В частности, изобретение включает в себя

1) Применение любого из пептидов, перечисленных в таблице 1, индивидуально или в сочетании друг с другом, нативного или модифицированного MDA, предпочтительно совместно с подходящим носителем и адъювантом, в качестве иммунотерапии или «противоатеросклерозной «вакцины» для профилактики и лечения ишемического сердечно-сосудистого заболевания.

2) Применение тех же пептидов в ИФА для определения антител, связанных с усиленным или пониженным риском развития ишемических сердечно-сосудистых заболеваний.

Известный уровень техники

Атеросклероз представляет собой хроническое заболевание, которое вызывает утолщение внутреннего слоя (интимы) крупных артерий и артерий среднего размера. Это снижает ток крови и может вызвать ишемию и разрушение ткани в органах, снабжающихся кровью через поврежденный сосуд. Атеросклероз является главной причиной сердечно-сосудистого заболевания, включая инфаркт миокарда, инсульт и заболевание периферических артерий. Он является основной причиной смерти на Западе и, как предсказывается, станет лидирующей причиной смерти во всем мире в пределах двух десятилетий.

Заболевание начинается с накопления липопротеинов, в первую очередь, липопротеина низкой плотности (ЛПНП), во внеклеточном матриксе сосуда. Данные частицы ЛПНП агрегируют и подвергаются модификации в результате окисления. Окисленный ЛПНП является токсичным и вызывает повреждение сосудов. Во многих отношениях атеросклероз представляет собой ответ на повреждение, включающий воспаление и фиброз.

В 1989 г. Palinski и соавторы идентифицировали циркулирующие антитела против окисленных ЛПНП у человека. Это позволяло предположить, что атеросклероз может быть аутоиммунным заболеванием, вызываемым в результате иммунных реакций против окисленных липопротеинов. К настоящему времени несколько лабораторий начало исследовать связи между титрами антител против окисленных ЛПНП и сердечно-сосудистыми заболеваниями. Однако картина, которая возникла в результате данных исследований, далека от ясности. Антитела существовали против большого числа различных эпитопов окисленных ЛПНП, но структура таких эпитопов была неизвестной. Термин «антитела к окисленным ЛПНП», таким образом, относится к неизвестной смеси различных антител, а не к одному специфичному антителу. Независимые от Т-клеток антитела IgM встречались более часто, чем зависимые от Т-клеток антитела IgG.

Антитела против окисленных ЛПНП присутствовали как у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, так и у здоровых лиц в контроле. Хотя в некоторых ранних исследованиях описаны связи между титрами антител к окисленным ЛПНП и сердечно-сосудистым заболеванием, другие исследователи были не в состоянии найти такие связи. Основным слабым моментом таких исследований был тот факт, что в применяемых для определения титров антител тестах ИФА в качестве лиганда использовали окисленные частицы ЛПНП. Состав ЛПНП является различным у разных индивидуумов, степень модификации в результате окисления трудно как контролировать, так и оценивать, и уровни антител против различных эпитопов в окисленных частицах ЛПНП не могут быть определены. В некоторой степени из-за технических проблем трудно оценить роль ответов антител против окисленных ЛПНП с применением доступных до сих пор методологий, но, однако, невозможно создать хорошо определяемые и воспроизводимые компоненты вакцины при применении интактных частиц окисленных ЛПНП.

Другим подходом в изучении предположения, что аутоиммунные реакции против окисленных ЛПНП в сосудистой стенке играют ключевую роль в развитии атеросклероза, является иммунизация животных против их собственных окисленных ЛПНП. Идея, лежащая в основе данного подхода, заключается в том, что если аутоиммунные реакции против окисленных ЛПНП усилятся при применении классических способов иммунизации, это должно привести к усилению воспаления сосудов и прогрессии атеросклероза. Для проверки данной гипотезы кроликов иммунизировали гомологичным окисленным ЛПНП и затем индуцировали атеросклероз путем содержания животных на диете с высоким содержанием холестерина в течение 3 месяцев.

Однако, в отличие от исходной гипотезы, иммунизация окисленным ЛПНП оказывала защитный эффект, снижая атеросклероз приблизительно на 50%. Сходные результаты были также получены при последующем исследовании, в котором диету с высоким содержанием холестерина сочетали с повреждением сосуда с помощью баллона для индукции более агрессивного развития бляшек. Параллельно с исследованиями авторов изобретения несколько других лабораторий представили сходные наблюдения. Суммарно доступные данные ясно указывают на то, что существуют иммунные реакции, которые защищают против развития атеросклероза и которые включают и аутоиммунный ответ против окисленных ЛПНП.

Данные наблюдения также предполагают возможность разработки иммунотерапии или «вакцины» для лечения возникшего в результате атеросклероза сердечно-сосудистого заболевания у человека. Один такой подход заключается в иммунизации индивидуума своим собственным ЛПНП после его окисления в результате экспозиции, например, с медью. Однако данный подход осложняется в связи с тем, что остается неизвестным вопрос о том, какая структура в окисленном ЛПНП отвечает за индукцию защитного иммунитета и может ли окисленный ЛПНП содержать также эпитопы, которые могут вызывать индукцию неблагоприятных иммунных реакций.

Идентификация эпитопов в окисленном ЛПНП важна по нескольким причинам:

Во-первых, один или несколько таких эпитопов, скорее всего, являются ответственными за активацию антиатерогенного иммунного ответа, наблюдаемого у животных, иммунизированных окисленным ЛПНП. Пептиды, содержащие данные эпитопы, могут, следовательно, предоставлять возможность для разработки иммунотерапии или «вакцины от атеросклероза» у человека. Кроме того, они могут быть использованы для терапевтического лечения развившегося у человека атеросклероза.

Во-вторых, пептиды, содержащие идентифицированные эпитопы, могут быть использованы для разработки методов ИФА, с помощью которых можно определять антитела против специфической структуры в окисленных ЛПНП. Такие методы ИФА должны быть более точными и надежными, чем доступные в настоящее время, в которых в качестве антигена используются частицы окисленного ЛПНП. Они должны также позволить анализировать иммунные ответы против различных эпитопов в окисленных ЛПНП, ассоциированных с сердечно-сосудистым заболеванием.

Патент США 5972890 относится к применению пептидов для диагностики атеросклероза. Способ, представленный в указанном патенте США, представляет собой в принципе форму радиофизической диагностики. Последовательность пептида метят радиоактивностью и его вводят в кровоток. Если данная пептидная последовательность будет идентична последовательностям, присутствующим в аполипопротеине В, она будет связываться с тканью, в которой присутствуют рецепторы для аполипопротеина В. В сосудах это, прежде всего, атеросклеротическая бляшка. Концентрирование радиоактивности в стенке сосуда может быть затем определено, например, с помощью гамма-счетчика. Способ, таким образом, представляет собой радиофизический способ диагностики, основанный на том, что радиоактивно меченые пептидные последовательности будут связываться со своими нормальными тканевыми рецепторами, присутствующими в атеросклеротической бляшке, и будут определяться с применением внешнего анализа радиоактивности. Он представляет собой способ прямого анализа для идентификации атеросклеротической бляшки. Он требует того, чтобы больной получал радиоактивные соединения.

Методология настоящего изобретения основывается на совершенно других принципах и способах. В соответствии с пунктом 1 формулы изобретения, изобретение относится к фрагментам аполипопротеина В для иммунизации против сердечно-сосудистого заболевания, а также к способу диагностики иммунных реакций против пептидных последовательностей аполипопротеина В. Такие иммунные реакции, в свою очередь, как показано, увеличиваются у индивидуумов, страдающих развитым атеросклерозом. Настоящий способ основан на прикреплении пептидных последовательностей к дну полимерных лунок. Когда добавляют образец крови, пептиды будут связываться с антителами, которые специфичны для данных последовательностей. Затем определяют количество связанных антител с применением иммунологического способа/метода. В отличие от способа указанного патента США данный способ, таким образом, не является методом прямого определения для идентификации и установления локализации атеросклеротической бляшки, но служит для определения иммунологического ответа, который проявляет высокую степень ковариантности со степенью атеросклероза.

Основной принцип настоящего изобретения является, таким образом, совершенно отличным от такового в указанном патенте. Последний зависит от связывания пептидных последовательностей с нормальными рецепторами липопротеинов, присутствующими в атеросклеротической ткани, в то время как первый основывается на открытии иммунных реакций против пептидных последовательностей и определении антител к данным пептидным последовательностям.

Опубликованные исследования (Palinski et al., 1995, and George et al., 1998) показали, что иммунизация против окисленных ЛПНП снижает развитие атеросклероза. Это должно указывать на то, что иммунные реакции против окисленных ЛПНП в целом обладают защитным эффектом. Представленные здесь результаты, однако, неожиданно показывают, что это происходит не всегда. Например, иммунизация с применением смеси пептидов #10, 45, 154, 199 и 240 дает толчок к усилению развития атеросклероза. Иммунизация с применением других пептидных последовательностей, например, пептидных последовательностей #1 и с 30 по 34, в целом не влияет на развитие атеросклероза. Результаты являются неожиданными потому, что они подводят базу под тот факт, что иммунные реакции против окисленных ЛПНП могут защищать против развития, вносить вклад в развитие атеросклероза и совсем не оказывать какого-либо эффекта, в зависимости от того, на какие структуры окисленных ЛПНП они направлены. Эти данные делают возможным разработку способов иммунизации, которые отдельно активируют защитные иммунные реакции. Далее, они показывают, что иммунизация с применением интактных окисленных ЛПНП может оказывать вредное воздействие, если применяемые частицы содержат высокий уровень структур, которые вызывают подъем атерогенных иммунных реакций.

Патент WO 99/08109 относится к применению панели моноклональных мышиных антител, которые связываются с частицами окисленных ЛПНП, для определения присутствия окисленных ЛПНП в сыворотке и плазме. Это, таким образом, совершенно отлично от настоящего изобретения, в котором раскрыт способ определения антител против окисленных ЛПНП.

Патент США 4970144 относится к способу получения антител с помощью иммунизации с применением пептидных последовательностей, причем антитела могут применяться для определения аполипопротеинов с использованием ИФА. Это, таким образом, нечто также совершенно отличное от настоящего изобретения.

В патенте США 5861276 описывается рекомбинантное антитело к нормальной форме аполипопротеина В. Данное антитело применяют для определения присутствия нормального аполипопротеина В в плазме и сыворотке и для лечения атеросклероза с помощью снижения количества частиц нормальных ЛПНП в системе циркуляции.

Таким образом, в настоящем изобретении описывается применение антител для лечения атеросклероза. Однако в противоположность патенту США 5861276, данные антитела направлены на структуры, присутствующие в частицах окисленных ЛПНП, а не на нормальную частицу ЛПНП. Преимущество состоит в том, что используются окисленные ЛПНП, которые, как предполагается, вызывают стимуляцию развития атеросклероза. Применение антител, направленных на структуры, являющиеся специфичными для окисленных ЛПНП, не описано в указанном патенте США.

Краткое изложение существа изобретения

Окисление липопротеинов, главным образом ЛПНП, в артериальной стенке, как считается, является важным фактором развития атеросклероза. Продукты, вырабатываемые при окислении ЛПНП, являются токсичными для клеток сосудов, вызывают воспаление и инициируют образование бляшек. Эпитопы в окисленных ЛПНП узнаются иммунной системой и вызывают стимуляцию образования антител. Эксперименты на животных показали, что некоторые из данных иммунных ответов обладают защитным эффектом в отношении атеросклероза. Антитела обычно направлены почти исключительно против структур на основе пептидов. Применяя библиотеку полипептидов, покрывающую полную последовательность только белка, представленного в ЛПНП, аполипопротеина В, были идентифицированы эпитопы в окисленных ЛПНП, которые вызывают стимуляцию образования антител у человека. Данные эпитопы пептидов могут быть использованы для разработки методов ИФА для исследования связи между иммунными ответами против окисленных ЛПНП и сердечно-сосудистым заболеванием и для разработки иммунотерапии или «вакцины» против атеросклероза для профилактики и лечения ишемического сердечно-сосудистого заболевания.

Подробное описание изобретения

Осуществлена молекулярная характеристика эпитопов окисленных ЛПНП, которые вызывают рост зависящих от антител иммунных ответов у человека. Применяемый подход имеет преимущества благодаря тому факту, что иммунные реакции почти исключительно направлены против пептидных последовательностей длиной в 5-6 аминокислот. ЛПНП содержит только один белок, аполипопротеин В длиной 4563 аминокислоты. При окислении аполипопротеин В фрагментируется, и альдегидные аддукты соединяются с положительно заряженными аминокислотами, в частности с лизином. Это означает, что пептидные последовательности, обычно не экспонирующиеся из-за трехмерной структуры аполипопротеина В, становятся доступными для иммунных клеток и/или что обычно экспонируемые пептидные последовательности становятся иммуногенными из-за гаптенилирования с альдегидами.

Таким образом, было определено, что следующие пептиды, нативные или производные MDA, обладающие такой эффективностью в плане индукции иммунного ответа, представляют собой

FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG

PQCSTHILQWLKRVHANPLL

VISIPRLQAEARSEILAHWS

KLVKEALKESQLPTVMDFRK

LKFVTQAEGAKQTEATMTFK

DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK

KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE

RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ

SLTSTSDLQSGIIKNTASLK

TASLKYENYELTLKSDTNGK

DMTFSKQNALLRSEYQADYE

MKVKIIRTIDQMQNSELQWP

IALDDAKINFNEKLSQLQTY

KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH

EEEMLENVSLVCPKDATRFK

GSTSHHLVSRKSISAALEHK

IENIDFNKSGSSTASWIQNV

IREVTQRLNGEIQALELPQK

EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE

HTFLIYITELLKKLQSTTVM

LLDIANYLMEQIQDDCTGDE

CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ

GNMGQTMEQLTPELKSSILK

SSILKCVQSTKPSLMIQKAA

IQKAAIQALRKMEPKDKDQE

RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ

SLNSHGLELNADILGTDKIN

WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ

TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ

EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ

ALLVPPETEEAKQVLFLDTV

IEIGLEGKGFEPTLEALFGK

SGASMKLTTNGRFREHNAKF

NLIGDFEVAEKINAFRAKVH

GHSVLTAKGMALFGEGKAEF

FKSSVITLNTNAELFNQSDI

FPDLGQEVALNANTKNQKIR, также как не вызывающий продукцию антител пептид

ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS

или активный сайт одного или более из данных пептидов.

Материалы и способы

Для определения того, какие части аполипопротеина В становятся иммуногенными в результате окисления ЛПНП, была создана библиотека полипептидов, состоящая из пептидов длиной 20 аминокислот, покрывающих полную последовательность аполипопротеина В человека. Пептиды получали с перекрыванием из 5 аминокислот для покрытия всех последовательностей в точках разрыва. Пептиды применяли в их нативном состоянии или после включения в фосфолипидные липосомы после окисления путем экспозиции с медью или после модификации малоновым деальдегидом (MDA) для имитации различных модификаций аминокислот, которые могут происходить во время окисления ЛПНП.

Пептиды

302 пептида, соответствующих полной аминокислотной последовательности аполипопротеина В человека, были синтезированы (Euro-Diagnostica AB, Malmö, Швеция и KJ Ross Petersen AS, Horsholm, Дания) и применены в ИФА. Часть каждого синтетического пептида была модифицирована 0,5 М MDA (Sigma-Aldrich Sweden AB, Stockholm, Швеция) в течение 3 час при 37°С и в присутствии липосом 0,5 М MDA в течение 3 час при 37°С или 5 мкМ CuCl₂ (Sigma) в течение 18 час при 37°С. Модифицированные MDA пептиды диализовали против ЗФР, содержащего 1 мМ ЭДТА, с несколькими сменами в течение 18 час при 4°С. Модификацию пептидов тестировали в денатурирующих полиакриламидных гелях (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), подходящих для разделения пептидов. Пептиды нумеровали 1-302, начиная с N-конца белка.

Для получения производных могут быть применены другие альдегиды, такие как гидроксиноненаль и другие.

Липосомы

Смесь яичного фосфатидилхолина (EPC) (Sigma) и фосфатидилсерина (PS) (Sigma) в растворе хлороформа при молярном отношении 9:1 и концентрации 3 мМ фосфолипида (PL) упаривали в стеклянном контейнере под слабой струей аргона. Контейнер затем помещали в вакуум на 3 часа. К высушенной пленке EPC/PS добавляли раствор, содержащий 0,10 мМ пептида (5 мл) в стерильно отфильтрованном 10 мМ HEPES-буфере рН 7,4, 145 мМ NaCl и 0,003% азида натрия, и инкубировали в течение 15 мин при 50°С. Смесь осторожно перемешивали в течение приблизительно 5 мин при комнатной температуре и затем помещали в баню с ледяной водой и сонифицировали с амплитудой 7,5 микрон в течение 3 х 3 мин (Sonyprep 150 MSE Sanyo, Tamro-Medlab, Швеция) с промежутками 1 мин. PL-петидную смесь, нативную или модифицированную 0,5 М MDA в течение 3 час при 37°С или 5 мМ CuCl₂ в течение 18 час при 37°С, хранили под аргоном в стеклянных сосудах при 4°С, закрытых алюминиевой фольгой, и использовали в пределах 1 недели. Модифицированную MDA смесь диализовали против ЗФР, содержащего 1 мМ ЭДТА, с несколькими сменами в течение 18 час при 4°С перед хранением. Модификацию смеси тестировали в денатурирующих полиакриламидных гелях (Bio-Rad Laboratories, AB, Sundbyberg, Швеция), подходящих для разделения пептидов.

Образцы плазмы

Образцы плазмы от 10 больных с сердечно-сосудистым заболеванием (AHP) и 50 образцов плазмы, 25 женских и 25 мужских, от нормальных доноров крови (NHP) собирали и объединяли. Два пула аликвотировали и хранили при -80°С.

ИФА

Нативные или модифицированные синтетические пептиды, разведенные в ЗФР, рН 7,4 (20 мкг/мл), в присутствии или в отсутствие липосом, абсорбировали на лунках планшета для микротитрования (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Дания) в ходе ночной инкубации при 4°С. В качестве контроля в каждый планшет вносили один из пептидов (P6). После промывки ЗФР, содержащим 0,05% Твин-20 (ЗФР-Т), покрытые планшеты блокировали с помощью SuperBlock в TBS (Pierce, Rockford, IL) в течение 5 мин при комнатной температуре с последующей инкубацией объединенной плазмы человека, AHP или NHP, разведенной 1/100 в TBS-0,05% Твин-20 (TBS-T) в течение 2 час при комнатной температуре и затем в течение ночи при 4°С. После промывки определяли задержку аутоантител против пептидов с применением биотинилированных антител кролика против IgG или IgM человека (Dako A/S, Glostrup, Дания), разведенных подходящим образом в TBS-T. После дополнительной инкубации в течение 2 час при комнатной температуре планшеты промывали и связанные биотинилированные антитела определяли с помощью щелочной фосфатазы, конъюгированной со стрептавидином (Sigma), с инкубацией в течение 2 час при комнатной температуре. Цветная реакция развивалась при применении набора субстрата фосфатазы (Pierce), и измеряли поглощение при 405 нм через 1 час инкубации при комнатной температуре. Величины поглощения различных пептидов делили на величину поглощения Р6 и сравнивали.

Последовательности аполипопротеина В, которые узнавались антителами плазмы человека, показаны как Seq. Id 1-37 на прилагаемой фигуре. И AHP, и NHP содержат антитела к большому количеству различных пептидов. Были идентифицированы антитела против как нативных, так и модифицированных пептидов. В целом титры антител к модифицированным MDA пептидам были выше или равны таковым для соответствующего нативного пептида. Сравнение нативного, модифицированного MDA, окисленного медью пептида показало высокую степень корреляции, а также то, что наибольшие титры антител определялись с применением модифицированных MDA пептидов. Применение пептидов, включенных в липосомы, не приводило к повышенному уровню антител. Антитела подкласса IgM были более распространенными, чем антитела подтипа IgG.

Пептиды, против которых были определены наиболее высокие уровни антител, могли быть подразделены на шесть групп с общими характеристиками (Таблица 1):

(A) Высокие уровни антител IgG против модифицированных MDA пептидов (n=3).

(B) Высокие уровни антител IgM, но нет различий между нативными и модифицированными MDA пептидами (n=9).

(С) Высокие уровни антител IgG, но нет различий между нативными и модифицированными MDA пептидами (n=2).

(D) Высокие уровни антител IgG против модифицированных MDA пептидов и, по меньшей мере, в 2 раза больше антител в пуле NHP по сравнению с пулом AHP (n=5).

(E) Высокие уровни антител IgM против модифицированных MDA пептидов и, по меньшей мере, в 2 раза больше антител в пуле NHP по сравнению с пулом AHP (n=11).

(F) Высокие уровни антител IgG, но нет различий между интактными и модифицированными MDA пептидами, но, по меньшей мере, в 2 раза больше антител в пуле AHP по сравнению с пулом NHP (n=7).

(G) Отсутствуют антитела IgG или IgM

Таблица 1А. Высокий IgG, отличие от MDAP 11.
P 25.
P 74.FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG
PQCSTHILQWLKRVHANPLL
VISIPRLQAEARSEILAHWSB. Высокий IgM, отсутствие отличия от MDAP 40.
P 68.
P 94.
P 99.
P 100.
P 102.
P 103.
P 105.
P 177.KLVKEALKESQLPTVMDFRK
LKFVTQAEGAKQTEATMTFK
DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK
KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE
RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
SLTSTSDLQSGIIKNTASLK
TASLKYENYELTLKSDTNGK
DMTFSKQNALLRSEYQADYE
MKVKIIRTIDQMQNSELQWPC. Высокий IgG, отсутствие отличия от MDAP 143.
P 210.IALDDAKINFNEKLSQLQTY
KTTKQSFDLSVKAQYKKNKHD. NHS/AHP, IgG-ak>2, отличие от MDAP1.
P 129.
P 148.
P 162.
P 252.EEEMLENVSLVCPKDATRFK
GSTSHHLVSRKSISAALEHK
IENIDFNKSGSSTASWIQNV
IREVTQRLNGEIQALELPQK
EVDVLTKYSQPEDSLIPFFEE. NHS/AHP, IgM-ak>2, отличие от MDAP 301.
P 30.
P 31.
P 32.
P 33.
P 34.
P 100.
P 107.
P 149.
P 169.
P 236.HTFLIYITELLKKLQSTTVM
LLDIANYLMEQIQDDCTGDE
CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ
GNMGQTMEQLTPELKSSILK
SSILKCVQSTKPSLMIQKAA
IQKAAIQALRKMEPKDKDQE
RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
SLNSHGLELNADILGTDKIN
WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ
TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ
EATLQRIYSLWEHSTKNHLQF. NHS/AHP, IgG-ak<0,5, отсутствие отличия от MDAP 10.
P 45.
P 111.
P 154.
P 199.
P 222.
P 240.ALLVPPETEEAKQVLFLDTV
IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
SGASMKLTTNGRFREHNAKF
NLIGDFEVAEKINAFRAKVH
GHSVLTAKGMALFGEGKAEF
FKSSVITLNTNAELFNQSDI
FPDLGQEVALNANTKNQKIRG.P 2.ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS

Все из этих 38 пептидных последовательностей представляют собой мишени для иммунных реакций, которые могут иметь важное значение для развития атеросклероза и ишемических сердечно-сосудистых заболеваний. Данные пептиды могут, следовательно, быть применены для разработки ИФА для определения связей между уровнями антител против определенных последовательностей модифицированных MDA аминокислот в аполипопротеине В и риска развития сердечно-сосудистого заболевания.

Данные пептиды также представляют собой возможные посредники защитного иммунитета, наблюдаемого у экспериментальных животных, иммунизированных окисленным ЛПНП, и могут быть применены для тестирования в последующей разработке иммунотерапии или "вакцины" против атеросклероза.

Так, было идентифицировано 38 различных последовательностей в белке аполипопротеина В человека, которые вызывают значительные иммунные ответы у человека. Данные эпитопы, по-видимому, представляют собой то, что ранее было описано как антитела против окисленного ЛПНП. Поскольку большинство иммунных ответов направлено против пептидных последовательностей, и аполипопротеин В является единственным белком в ЛПНП, примененный в данном проекте подход должен давать возможность идентифицировать специфические эпитопы по существу для всех антител против окисленных частиц ЛПНП. Было описано семейство специфичных в отношении фосфолипидов антител, включающее антитела против кардиолипина, которые взаимодействуют с окисленным ЛПНП, однако специфичность и роль данных антител предстоит полностью охарактеризовать.

Во многих случаях титры антител были выше по отношению к модифицированным MDA полипептидам по сравнению с нативными последовательностями. Когда антитела определяли против модифицированной MDA последовательности, это почти всегда было связано с наличием антител против нативной последовательности. Вероятное объяснение этому заключается в том, что иммунный ответ против модифицированной MDA аминокислотной последовательности в аполипопротеине В (модификация MDA происходит в результате окисления ЛПНП) ведет к нарушению толерантности к нативной последовательности. Для других последовательностей не было различий в титрах антител против модифицированных MDA или нативных последовательностей. Это заставляет предположить, что иммунные реакции направлены против нативных последовательностей. Не должно быть иммунного ответа против аминокислотных последовательностей белка, нормально экспонированного иммунной системе. В нативной частице ЛПНП значительные части белка аполипопротеина В скрыты в фосфолипидном слое ЛПНП и, следовательно, не доступны для иммунной системы. Во время окисления ЛПНП аминокислотная цепь аполипопротеина В фрагментируется, что ведет к изменениям в трехмерной структуре. Это, по-видимому, ведет к экспонированию пептидных последовательностей, в норме недоступных для иммунной системы, и к выработке антител против данных последовательностей, что может объяснить наблюдавшееся наличие антител против нативных последовательностей аполипопротеина В. Альтернативно, истинный иммунный ответ направлен против модифицированных MDA последовательностей, однако перекрестная реакция с нативными последовательностями является настолько высокой, что не удается показать различий в связывании.

Возможность того, что методы ИФА на основе данных пептидов (нативных или модифицированных MDA) могут быть использованы для определения связей между иммунной реакцией против определенных эпитопов в окисленных ЛПНП и наличием и/или риском развития сердечно-сосудистого заболевания изучали в пилотном исследовании. Исследование выполняли на субъектах, участвующих в исследовании противораковых диет Malmö, популяционном исследовании, в котором в промежутке между 1989 и 1993 гг. участвовало свыше 30000 индивидуумов. Уровни антител против 24 из 38 пептидов, перечисленных в таблице 1, определяли в базовых образцах плазмы 26 субъектов, у которых развился острый инфаркт миокарда в течение последующего периода, и у 26 здоровых контрольных субъектов, подобранных по возрасту, полу и употреблению сигарет. Дополнительную группу из 26 субъектов, подобранных по возрасту, полу и употреблению сигарет, но для всех с уровнями холестерина ЛПНП выше 5,0 ммоль/л, также включали для исследования уровней антител в виде группы с высокой степенью риска, в которой не развилось сердечно-сосудистое заболевание.

Для 19 из 24 проанализированных пептидов были выявлены существенные корреляции между уровнями антител IgM против пептидов, модифицированных MDA, и тяжестью атеросклероза в каротидной артерии (толщины интимы/среднего слоя) при оценке с помощью ультразвукового исследования общей каротидной артерии, т.е. чем больше уровни антител, тем больше атеросклероз (Таблица 2). Для многих из данных пептидов существовали также значительные корреляции между уровнями антител к нативным пептидам и толщиной интимы/среднего слоя. Только для 4 пептидов показана существенная корреляция между антителами IgG и толщиной интимы/среднего слоя. Данные наблюдения предполагают, что ИФА с использованием данных модифицированных MDA пептидов (по одиночке или в сочетании) может быть применен для идентификации субъектов с усиленным атеросклерозом.

Четыре из протестированных пептидов были не только связаны с наличием усиленного атеросклероза, но были также существенно увеличены в группе субъектов, которые впоследствии страдали от инфаркта миокарда (Таблица 2). Такие наблюдения также показывают, что ИФА на основе пептидов может быть также использован для идентификации субъектов с усиленным риском развития инфаркта миокарда.

Выявлено также существенное увеличение уровней антител IgG для нативного пептида 103, 162 и 199, а также для модифицированного MDA 102, в группе, которая впоследствии страдала от инфаркта миокарда. Однако антитела IgG против данных пептидов не были значимо связаны с наличием атеросклероза в каротидной артерии.

Особенно интересное наблюдение было проведено для антител против пептида 210, модифицированного MDA, для которого наблюдались значительно более высокие уровни антител IgM у здорового контроля и в группе высокого риска (холестерин ЛПНП выше 5,0 ммоль/л), чем в группе, в которой развился инфаркт миокарда. Соответственно, антитела против пептида 210, модифицированного MDA, могут являться маркерами для индивидуумов с пониженным риском развития сердечно-сосудистого заболевания.

В настоящее время показано, что иммунизация нативными и модифицированными MDA апо В-100 пептидными последовательностями ведет к ингибированию атеросклероза у экспериментальных животных (Nordin Fredrikson, Söderberg et al., Chyu et al.). Механизмы, с помощью которых осуществляются данные атерозащитные иммунные ответы, остается полностью выяснить. Однако одна вероятная возможность заключается в том, что атерозащитный эффект опосредуется антителами, выработанными против данных пептидных последовательностей. Данные антитела могут, например, ускорять удаление поврежденных в результате окисления частиц ЛПНП с помощью Fc-рецепторов макрофагов.

Макрофагальные рецепторы-мусорщики узнают только ЛПНП с большим окислительным повреждением [9]. Последние исследования выявили наличие циркулирующих окисленных ЛПНП [10, 11]. Данные частицы характеризуются только минимальным окислительным повреждением и не узнаются рецепторами-мусорщиками. Связывание антител с данными циркулирующими окисленными частицами ЛПНП может способствовать их удалению из циркуляции до их аккумуляции в ткани сосудов [12].

В ряде исследований поддерживается роль антител в защите против атеросклероза. Узнавание В-клетками ингибирует развитие атеросклероза у спленэктомированных нокаутных по апо Е мышей [13], также как образование неоинтимы после повреждения каротидной артерии у мышей RAG-1 (неопубликованные наблюдения в лаборатории авторов изобретения). Более того, показано, что повторяющиеся инъекции иммуноглобулинов снижают атеросклероз у нокаутных по апо Е мышей [6].

Как обсуждалось выше, антитела против пептидных последовательностей, модифицированных MDA, в апо В-100 могут быть выработаны путем активной иммунизации с применением синтетических пептидов. Данная процедура требует 2-3 недель для достижения полного эффекта в плане получаемой продукции антител.

В некоторых ситуациях может быть необходим более быстрый эффект. Одним из примером могут служить нестабильные атеросклеротические бляшки, в которых окисленные ЛПНП, очевидно, вносят вклад в воспаление, клеточную токсичность и риск отрыва бляшек. В данных условиях пассивная иммунизация путем введения очищенных или полученных рекомбинантным способом антител против нативных и модифицированных MDA последовательностей может оказывать более быстрый эффект.

Другой ситуацией, при которой пассивная иммунизация с помощью введения очищенных или полученных рекомбинантным способом антител может быть эффективной, является коронарная болезнь сердца у пожилых индивидуумов. Исследования авторов показали, что с возрастом у человека происходит снижение антител против последовательностей пептида апо В, и оно связано с увеличением уровня окисленных ЛПНП в плазме (Nordin Fredrikson, Hedblad et al.). Это может предполагать наличие старения иммунных клеток, ответственных за продукцию антител против антигенов в окисленных ЛПНП, и вести к дефектному клиренсу поврежденных в результате окисления частиц ЛПНП из циркуляции. Соответственно, данные субъекты должны извлечь больше пользы из пассивной иммунизации с помощью введения очищенных или полученных рекомбинантным способом антител, чем из активной иммунизации пептидными последовательностями апо В-100.

Синтетические нативные пептиды (Euro-Diagnostica AB, Malmö, Швеция), применяемые здесь в последующем, представляют собой пептид 1, 2 и 301 из первоначального скрининга полипептидной библиотеки.

В случае пептида 1 (аминокислотная последовательность: EEEMLENVSLVCPKDATRFK, n=10) и пептида 301 (аминокислотная последовательность: HTFLIYITELLKKLQSTTVM, n=10), как обнаружено, выявляется более высокий ответ антител IgG или IgM на форму, модифицированную MDA, чем на нативный пептид, соответственно, и оба титра выше у здорового субъекта. Данные пептиды были выбраны на основе предположения, что ответ антител на данные пептиды может быть защитным в отношении атеросклероза.

В случае пептида 2 (аминокислотная последовательность: ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS, n=10) не выявлено ответа антител при первоначальном скрининге антител, следовательно, он был выбран как контрольный пептид. Мыши, получавшие квасцы, служили контролем (n=9).

Мыши апо Е (-/-) получали первичную подкожную иммунизацию в возрасте 6-7 недель с последующей внутрибрюшинной бустерной инъекцией через 3 недели. Мышей содержали на диете с высоким содержанием холестерина с момента иммунизации и продолжали содержать до забоя в возрасте 25 недель. Ко времени забоя не наблюдалось существенных различий в массе тела у 4 групп мышей. Не было статистически значимых различий в уровне холестерина сыворотки, измеренного имеющимся в продаже набором (Sigma). У всех них средние уровни холестерина в сыворотке составляли выше 715 мг/дл.

Область нисходящей аорты, покрытую атеросклеротической бляшкой, измеряли на препарате en face после окрашивания масляным красным О. По сравнению с контрольной группой мыши, иммунизированные пептидом No. 2 и No. 301, характеризовались существенно сниженным атеросклерозом (фиг.2). Иммунизация пептидом No. 1 не вызывала значимого снижения атеросклероза по сравнению с контролем. В отличие от нисходящей аорты степень атеросклероза в корне аорты и дуге аорты не различалась в 4 экспериментальных группах (фиг.3).

Не выявлено различий между 4 группами в плане размера бляшек синуса аорты или содержания в них липидов (таблица А). Средние размеры бляшек в дугах аорты 4 групп мышей не различались. Однако при оценке размеров бляшек в нисходящей грудной и брюшной аорте en face с помощью окрашивания масляным красным О выявлено, что контрольная группа и группа с пептидом No. 1 имели сходное количество атеросклеротических бляшек в аорте, в то время как группы с пептидом No. 2 и No.9 характеризовались существенно сниженной тяжестью атеросклеротических изменений в аорте (таблица А). Выявление того, что иммунизация пептидами не влияла на размер бляшек в синусе аорты или дуге аорты, но снижала бляшки в нисходящей аорте, предполагает, что иммунизация пептидом должна снижать образование новых бляшек, но не влиять на прогрессирование бляшек.

Дополнительно тестировали, будет ли иммунизация пептидами модулировать фенотип атеросклеротических бляшек. Замороженные срезы бляшек синуса аорты окрашивали иммуногистохимически антителом против моноцитов/макрофагов (MOMA-2, Serotec). В соответствии с данными, полученными при исследовании en face, пептид No. 2 значительно снижал инфильтрацию бляшек макрофагами (фиг.1). Окрашивание трихромом выявило среднее содержание коллагена 40,0±7,7% в бляшках синуса аорты в группе с пептидом 2; в то время как среднее содержание коллагена в контрольной группе с квасцами, группе с пептидом 1 и группе с пептидом 9 составляло 32,3±5,3%, 35,6±8,5% и 29,4±9,6%, соответственно.

В каждой группе определяли ответ антител против пептидов, применяемых для иммунизации. Титр антител после иммунизации возрастал в 6,1±3,1 раз в группе с пептидом 1, в 2,4±1,0 раз в группе с пептидом 2 и в 1,8±0,6 раз в группе с пептидом 9; в то время как в группе с квасцами наблюдалось увеличение титра антител против пептида 1 в 3,9±2,7 раза, увеличение против пептида 2 в 2,0±0,5 раза и увеличение против пептида 9 в 2,0±0,9 раза. Неожиданным оказалось параллельное увеличение титра антител против пептидов для иммунизации как в группах с иммунизацией пептидами, так и в группе с обработкой квасцами. Это может быть обусловлено следующими возможными причинами: (1) механизм(ы), отличные от гуморального иммунного ответа (такие как клеточный иммунный ответ), могут быть вовлечены в модуляцию атеросклероза; или (2) данное увеличение антитела представляло собой наблюдаемый ответ на гиперхолестеринемию, развивающийся со временем.

Хотя неясны предполагаемые механизмы, объясняющие, почему иммунизация пептидами снижает атеросклероз и/или модулирует фенотип бляшек, новизна данного изобретения состоит в концепции применения пептидов ЛПНП в качестве иммуногена и ее осуществимости в качестве стратегии иммуномодуляции. Данная стратегия иммунизации на основе пептидов модулирует атеросклеротические бляшки. Иммунизация с использованием гомологичных окисленных ЛПНП или нативных ЛПНП в качестве антигена, как показано, снижает размер бляшек [1-3], однако пригодность, продукция, инфекционное загрязнение и безопасность гомологичных человеческих ЛПНП делают данный подход привлекательным для клинического применения. Здесь продемонстрировано, что иммунотерапия на основе пептидов является реальной, хотя окончательные результаты авторов отличаются от их первоначальной гипотезы о том, что иммунизация с применением пептидов с более высоким ответом антител IgM или IgG у нормальных субъектов может защищать экспериментальных животных от повышенного развития атеросклеротических бляшек.

Неожиданным оказалось выявление того, что иммунизация с применением пептида 2 защищала животного от развития новых атеросклеротических повреждений в нисходящей аорте и снижала инфильтрацию макрофагами и обусловливала более высокое содержание коллагена в бляшках, так как данный пептид не давал никакого ответа антител при первоначальном скрининге у человека. Это может быть связано с тем, что (а) пептид No 2 может быть частью структуры белка апо-В-100 человека, которая не предъявляется иммунной системе человека. Следовательно, антитела не вырабатываются и не определяются в пулах сыворотки здоровых людей; (b) аминокислотная последовательность пептида No 2 является чужеродной для мышей, следовательно, у мышей развивается иммунный ответ против данного пептида, который модулирует образование нового атеросклеротического повреждения и его фенотип.

Эффект иммунизации гомологичными ЛПНП на размер бляшек варьировал, когда размеры бляшек оценивали в различных частях древа орты. Например, Ameli et al показали, что у кролика с гиперхолестеринемией иммунизация нативными ЛПНП вела к снижению образования бляшек в аорте [1], в то время как Freigang et al. продемонстрировали снижение размера бляшек в синусе аорты, но не в аорте. Суммируя эти данные и представленные здесь данные, можно предположить, что иммунизация пептидами модулирует не только размер бляшек, но также и состав бляшек. Снижающий бляшки эффект наблюдался только в нисходящей аорте. У мышей апо Е (-/-), как известно, развиваются атеросклеротические повреждения на различных стадиях развития отдельного животного, особенно когда его содержат на богатой холестерином диете. Первоначальное появление атеросклеротического повреждения у молодого животного происходит в синусе аорты [6,7], и через 15 недель содержания на богатой холестерином диете повреждения в синусе аорты представляют собой развитые бляшки; в то время как более ранняя стадия атеросклероза представлена в нисходящей аорте [6]. Так как временные характеристики созревания бляшек и их развитие в нисходящей аорте являются поздними по сравнению с таковыми синуса аорты, данные о том, что иммунизация снижала размеры повреждений в нисходящей аорте, но не в синусе аорты, предполагали, что иммунизация влияет на раннюю стадию образования атеросклероза. Возможно, что при старении животного и в присутствии сверхфизиологического уровня холестерина сыворотки снижающий бляшки эффект иммунизации перекрывается токсическим эффектом гиперхолестеринемии. Возможно также, что бляшки синуса аорты созревают быстрее и забой через 25 недель является слишком поздним для определения какого-либо различия в размере бляшек. Хотя размер повреждения не модулируется в бляшке синуса аорты, иммунизация пептидами действительно модулирует составы бляшек. Представленный здесь дизайн экспериментов не допускает исследования состава бляшек на их ранней стадии развития в нисходящей аорте.

Экспериментальные данные подчеркивают осуществимость применения пептидных последовательностей ЛПНП, связанных с апо В-100, в качестве иммуногенов для нового подхода к профилактике атеросклероза и/или благоприятного модулирования фенотипа бляшек, несмотря на тяжелую гиперлипидемию. Данная основанная на пептидах стратегия иммунизации потенциально выгодна по сравнению с применением гомологичных окисленных ЛПНП или нативных ЛПНП в качестве антигена, потому что такая стратегия может устранять необходимость в выделении и получении гомологичных ЛПНП с сопутствующим риском их загрязнения. Снижающий бляшки эффект иммунизации пептидом No 2 и 301 наблюдался только в нисходящей аорте. Эти данные находятся в соответствии с предшествующими сообщениями, в которых, как показано, другие терапевтические воздействия обладают более сильным эффектом на нисходящую аорту по сравнению с дугой аорты [14-17], вероятно, потому, что повреждения развиваются быстрее в корне и дуге аорты, чем в нисходящей аорте, создавая таким образом меньшие рамки для возможности вмешательства [14, 15, 16, 18, 19]. Так как временные характеристики созревания бляшек и их развитие в нисходящей аорте являются поздними по сравнению с таковыми синуса аорты и дуги аорты, данные о том, что иммунизация снижала размеры повреждений в нисходящей аорте, но не в синусе и дуге аорты, предполагают, что иммунизация предпочтительно предотвращает раннюю стадию образования атеросклероза. Возможно, что при старении животного и в присутствии сверхфизиологического уровня холестерина сыворотки снижающий бляшки эффект иммунизации перекрывается токсическим эффектом тяжелой гиперхолестеринемии. Хотя размер повреждения не модулируется в синусе или дуге аорты, иммунизация пептидом No 2 действительно модулирует состав бляшек в благоприятном направлении, создавая более стабильный фенотип бляшек со сниженной инфильтрацией макрофагами и увеличенным содержанием коллагена. В результате, представлен новый подход к иммуномодуляции на основе пептидов для торможения атеросклероза на мышиной модели.

В результате представлен новый подход к иммуномодуляции на основе пептидов для модуляции атеросклеротических бляшек. Хотя изменения в формировании атеросклероза в модели авторов изобретения были только умеренными, все же данная иммунизация на основе пептидов может обеспечить альтернативный подход к изучению, профилактике или лечению атеросклероза.

Способы

Получение пептидов. Пептиды получали с применением EDC набора Imject® SuperCarrier® (Pierce, Rockford, IL) согласно инструкции производителя с небольшой модификацией. Один мг пептида в 500 мкл буфера для конъюгации смешивали с 2 мг носителя в 200 мкл деионизированной воды. Смесь затем инкубировали с 1 мг конъюгирующего реагента (EDC, 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид HCl) при комнатной температуре в течение 2 часов. Содержимое затем диализовали против раствора 0,083 М фосфата натрия, 0,9 М хлорида натрия, pH 7,2, в течение ночи при 4°С. Диализованный конъюгат разбавляли сухой смесью буфера для очистки (Imject) до конечного объема 1,5 мл. В качестве иммуноадъюванта применяли квасцы, которые смешивали с конъюгатом пептида в разведении 1:1 по объему. Количество пептида при каждой иммунизации составляло 33 мкг/100 мкл на инъекцию.

Протокол работы с животными. Мыши апо E (-/-) из Jackson Laboratories (Bar Harbor, Me) получали подкожную первичную иммунизацию в возрасте 6-7 недель с последующей интраперитонеальной бустерной инъекцией через 3 недели. Мышей кормили диетой с высоким содержанием холестерина с начала иммунизации и вплоть до забоя в возрасте 25 недель. Образцы крови собирали через 2 недели после бустерной инъекции и во время забоя. В качестве контроля служили мыши, получавшие квасцы. Протокол эксперимента был одобрен институционным комитетом по содержанию и применению животных медицинского центра Cedars-Sinai. Все мыши содержались в оборудовании для животных, аккредитованном Американской ассоциацией по аккредитации содержания лабораторных животных, и содержались при 12-часовом цикле день/ночь при неограниченном доступе к воде и пище. Во время забоя мышей анестезировали ингаляцией энфлурана. Плазму получали ретроорбитальным кровопусканием перед забоем.

Сбор тканей и получение срезов. Для оценки влияния иммунизации пептидом на развитие атеросклероза определяли размер бляшки в синусе аорты, дуге аорты и нисходящей грудной и брюшной аорте. После перфузии сердца и древа аорты обычным физиологическим раствором при физиологическом давлении сердце и проксимальную часть аорты вырезали и погружали в соединение OCT (Tissue-Tek) и получали замороженные срезы. Собирали серийные срезы толщиной 6 мкм, начиная, по меньшей мере, с появления 2 клапанов аорты до исчезновения створок клапана аорты, для оценки бляшки синуса аорты. Обычно на одном стекле размещали 3 последовательных среза, и от одной мыши получали в общей сложности 25-30 стекол, и каждый пятый срез отбирали для окраски. Восходящую аорту и дуги аорты вплоть до левой подключичной артерии также нарезали и обрабатывали сходным образом. Отдельно обрабатывали нисходящую грудную и брюшную аорту для оценки en face образования бляшек после окрашивания масляным красным O.

Получение en face нисходящей грудной и брюшной аорты. Куриный яичный альбумин (Sigma) в концентрации 0,8 г/мл в воде смешивали 1:1 с глицерином. Добавляли азид натрия с получением конечной концентрации азида натрия 0,2%. После отделения нисходящей грудной и брюшной аорты от окружающей ткани и жира сегмент аорты от левой подключичной артерии до уровня почечной артерии осторожно извлекали для фиксации в течение ночи в Histochoice (Amresco). Аорту затем осторожно раскрывали продольно и помещали люминальной стороной на свежепокрытое раствором яичного альбумина стекло. После высыхания раствора альбумина аорту окрашивали масляным красным O для оценки степени атеросклероза с применением компьютеризированной гистоморфометрии.

Иммуногистохимия и гистоморфометрия. Срезы синуса аорты подвергали иммуногистохимической окраске антителом MOMA-2 (Serotec) с применением стандартного способа. Трехцветную окраску для оценки содержания коллагена и окраску масляным красным O для оценки размера бляшки и содержания липидов проводили с применением стандартного способа окраски. Для гистоморфометрической оценки проводили компьютеризированный морфометрический анализ, как описано ранее [8].

Измерение титра антител. Для измерения ответа антител после иммунизации пептидом был разработан ИФА. Титр антител против пептида иммунизации измеряли с применением крови, собранной через 2 недели после повторной иммунизации и при забое. Ответ антител против 3 пептидов определяли также в группе, получавшей квасцы, при тех же временных интервалах. Вкратце, неденатурированные синтетические пептиды, разведенные в ЗФР с pH 7,4 (20 мкг/мл), абсорбировали на лунки планшета для микротитрования (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Дания) в процессе ночной инкубации при 4°С. После промывки ЗФР, содержащим 0,05% твин-20 (ЗФР-Т), покрытые планшеты блокировали SuperBlock в TBS (Pierce) в течение 5 мин при комнатной температуре с последующей инкубацией с сывороткой мыши, разведенной 1/50 в TBS-0,05% твин-20 (TBS-T) в течение 2 час при комнатной температуре и затем в течение ночи при 4°С. После промывки удерживаемые антитела против пептидов определяли с применением биотинилированных антител кролика против Ig мыши (Dako A/S, Glostrup, Дания), разведенных надлежащим образом в TBS-T. После еще одной инкубации в течение 2 час при комнатной температуре планшеты промывали и связанные биотинилированные антитела определяли с помощью конъюгированного с щелочной фосфатазой стрептавидина (Sigma) с инкубацией в течение 2 час при комнатной температуре. Применение набора субстрата фосфатазы (Pierce) обеспечивало развитие цветной реакции, и производили измерение поглощения при 405 нм через 1 час инкубации при комнатной температуре. После вычитания фона рассчитывали средние величины.

Разумеется, могут быть применены и другие модели тестирования, такие как любые способы иммунологического анализа антитела, такие как радиоиммунологический анализ, иммуноблоттинг, Саузерн-блоттинг, а также определение антител, связанных с пептидами, ферментные электроды и другие способы анализа.

Статистика

Данные представлены в виде среднего ±станд. откл. Примененный статистический способ указан в тексте, таблице или подписи к фигуре. В качестве статистически значимого принимали уровень P<0,05.

Таблица A
Размер бляшек в синусе аорты и содержание в них липидов, размер бляшек в дуге аорты и процент бляшек в нисходящей аорте Суммарный размер бляшек в синусе аорты (мм²)Площадь масляного красного (+) (% от бляшек в синусе аорты)Размер бляшек в дуге аорты (мм²)% от бляшек в аорте (плоский преп.)Квасцы0,49±0,1321,7±4,40,057±0,04020±4,7Пептид 10,40±0,1432,0±8,10,054±0,02717±4,3Пептид 20,52±0,1223,9±3,50,078±0,0226,3±1,9*Пептид 3010,46±0,1623,8±4,10,050±0,0248,9±2,2**Значимое отличие от группы с квасцами. Для статистического анализа применяли ANOVA с последующим тестом Таки-Крамера.

Дополнительные данные о влиянии иммунизации пептидными последовательностями аполипопротеина B-100 на атеросклероз у мышей с нокаутом апо E представлены ниже в таблице B.

Таблица B
Влияние иммунизации пептидными последовательностями аполипопротеина B-100 на атеросклероз у мышей с нокаутом апо EИммунизации с применением смесей нескольких пептидных последовательностей
Влияние на атеросклероз в аорте1. Пептидные последовательности 143 и 210-64,6%2. Пептидные последовательности 11, 25 и 74-59,6%3. Пептидные последовательности 129, 148 и 167-56,8%4. Пептидные последовательности 99, 100, 102, 103 и 105-40,1%5. Пептидные последовательности 30, 31, 32, 33 и 34+6,6%6. Пептидные последовательности 10, 45, 154, 199 и 240+17,8%Иммунизации с применением одной пептидной последовательности1. Пептидная последовательность 2-67,7%2. Пептидная последовательность 210-57,9%3. Пептидная последовательность 301-55,2%4. Пептидная последовательность 45-47,4%5. Пептидная последовательность 74-31,0%6. Пептидная последовательность 1-15,4%7. Пептидная последовательность 2400%

Ведение пептидов обычно производят путем инъекции, такой как подкожная инъекция, внутривенная инъекция, внутримышечная инъекция или внутрибрюшинная инъекция. Первая иммунизирующая доза может составлять от 1 до 100 мг на больного, в зависимости от массы тела, возраста и других физических и медицинских показателей. В конкретных условиях возможно также местное введение раствора, содержащего один или более пептидов, посредством катетера в коронарные сосуды. Можно также подумать о пероральных препаратах, хотя должны быть предприняты особые предосторожности для обеспечения всасывания в кровяное русло. Инъекционная доза может содержать от 0,5 до 99,5% по массе одного или более фрагментов пептидов согласно изобретению.

Пептиды обычно вводят в форме, связанной с катионизированным бычьим сывороточным альбумином, и с применением гидроксида алюминия в качестве адъюванта. Могут быть также применены и другие адъюванты, известные в данной области техники.

Растворы для введения пептидов не должны содержать ЭДТА или какие-либо антиоксиданты.

Пептиды могут быть также применены в качестве терапевтических агентов у больных, уже страдающих от атеросклероза. Таким образом, для доставки одного или более фрагментов или пептидов согласно изобретению может быть применен любой подходящий способ введения.

Первоначально исследования были сосредоточены на определении типа окислительных модификаций пептидов, ведущих к узнаванию антителами в человеческой плазме. Данные исследования были проведены с применением пептидов 1-5 и 297-302. Во время окисления ЛПНП полиненасыщенные жирные кислоты в фосфолипидах и эфирах холестерина подвергаются перекисному окислению, ведущему к образованию высокореакционных продуктов распада, таких как малондеальдегид (MDA). MDA может затем образовывать ковалентные аддукты с остатками лизина и гистидина в апо B-100, делая их высокоиммуногенными. Окисление ЛПНП также вызывает фрагментацию апо B-100, что может вести к экспозиции пептидных последовательностей, которые в норме не доступны для иммунной системы. В данных экспериментах применяли пептиды в их нативной форме, после модификации MDA или после включения в фосфолипидные липосомы с последующим окислением медью или модификацией MDA. Были идентифицированы антитела IgM против нативных, окисленных MDA- и липосомами пептидов с титрами антител MDA-пептид > MDA-модифицированные липосомные пептиды > окисленный пептид липосом > нативный пептид. Тестирование специфичности показало, что за связывание антител с модифицированными MDA пептидами конкурируют и MDA-ЛПНП, и ЛПНП, окисленные медью.

Затем авторы изобретения провели скрининг полной пептидной библиотеки с применением объединенной плазмы, полученной у здоровых контрольных субъектов, и нативных и модифицированных MDA пептидов в качестве антигенов. Были идентифицированы антитела против большого количества сайтов в апо B-100. С использованием двойной величины поглощения фонового контроля в качестве отсечения положительного титра были выявлены антитела против 102 из 302 пептидов, составляющих полную последовательность апо B-100. Связывание IgM было значительно более представительным по сравнению с IgG. В целом, связывание модифицированных MDA пептидных последовательностей было выше, чем связывание соответствующей нативной последовательности, но между ними наблюдалась четкая корреляция. За связывание как нативных, так и модифицированных MDA последовательностей конкурировали модифицированные MDA ЛПНП и окисленные медью ЛПНП, но не нативные ЛПНП. Данные наблюдения позволяют предполагать, что иммунные ответы против модифицированных MDA пептидных последовательностей в апо B-100 приводят к перекрестной активности против нативных последовательностей. Неспособность нативных ЛПНП конкурировать за связывание антителами нативных пептидных последовательностей апо-B-100 является интригующей, но может указывать на то, что данные последовательности начинают экспонироваться лишь после протеолитической деградации апо B-100, которая происходит вследствие окисления ЛПНП. Антителами узнавались и гидрофильные, и гидрофобные части молекулы. Повторный скрининг библиотеки пептидов апо B-100 проводили с применением объединенной плазмы от субъектов с клиническими признаками коронарной болезни сердца (CHD, острый инфаркт миокарда (AMI) и нестабильная стенокардия; n=10). Антитела объединенной плазмы CHD связывались с теми же последовательностями и с таким же общим распределением, что и антитела плазмы здорового контроля. Однако титры антител к нескольким пептидам (#1, 30-34, 100, 107, 148, 149, 162, 169, 236, 252 и 301) в контрольной плазме были по меньшей мере в два раза выше по сравнению с плазмой от субъектов CHD, тогда как титры против немногих пептидов (#10, 45, 111, 154, 199, 222 и 240) были выше в плазме больных CHD по сравнению с контролем. Авторы изобретения провели проспективное клиническое исследование для определения того, предсказывает ли уровень антител против модифицированных MDA пептидных последовательностей в апо B-100 риск развития CHD. Применяя контрольный план эксперимента с группировкой случаев заболевания, авторы изобретения отобрали 78 субъектов с коронарными последствиями (AMI или смерть в результате CHD) и 149 контролей из Malmö Diet Cancer Study. Ни больные, ни контрольные индивидуумы не имели ранее ни MI, ни инсульта. Средний промежуток времени от включения в группу до случая острого коронарного заболевания составлял 2,8 лет (диапазон 0,1-5,9 лет) среди случаев заболевания. Уровни антител определяли в базовых образцах плазмы с добавками антиоксидантов. Применяя показатель толщины интимы - среднего слоя каротидной артерии (IMT), оцениваемый ультрасонографией в базовых условиях, заявители также проанализировали связи между уровнем антител и степенью наступившего сосудистого заболевания. Авторы изучили 8 модифицированных MDA пептидных последовательностей, которые в исходных скрининговых исследованиях были ассоциированы с высокими уровнями антител в плазме (#74, 102 и 210) и/или со значительными различиями между контрольным и CHD пулами плазмы (#32, 45, 129, 162 и 240). Было обнаружено, что в контролях содержатся более высокие уровни IgM против пептида 74 (0,258, диапазон 0-1,123 единиц поглощения по сравнению с 0,178, диапазон 0-0,732 единиц поглощения, p<0,05), а в других отношениях разницы между случаями заболевания и контролями разницы в уровнях антител не было. Связи между IMT и IgM против MDA-пептидов #102, 129 и 162 (r=0,233, 0,232 и 0,234, соответственно, p<0,05) наблюдались между IMT и MDA-пептидом 45 (r=0,18, p<0,05) в контролях. Слабые корреляции наблюдались между антителами против MDA-пептида 129 и общим и ЛПНП холестеринов (r=0,19 и r=0,19, p<0,01, соответственно), а в других отношениях уровни антител против пептидов не проявляли связей с общим холестерином плазмы, холестерином ЛПНП, холестерином ЛПВП или триглицеридами плазмы. Имелись сильные корреляции между уровнями антител к различным пептидам (величины r в диапазоне от 0,6 до 0,9). Единственным исключением были антитела против MDA-пептида 74, которые имели слабую связь с антителами против других пептидов или не имели ее вовсе.

Антитела против всех последовательностей, за исключением MDA-пептида 74, были негативно связаны с возрастом в случаях заболевания (величины r в диапазоне от -0,38 до -0,58, p<0.010.001), но не в контроле. Напротив, уровни окисленных ЛПНП в плазме возрастали с возрастом. И вновь данная связь была сильнее в случаях заболевания, чем в контроле. Для изучения того, различаются ли связи между иммунными ответами против модифицированных MDA пептидных последовательностей и сердечно-сосудистым заболеванием у различных возрастных групп, был проведен подгрупповой анализ в случаях заболевания и в контроле, занимающих положение ниже и выше средневозрастного показателя (61 год). В более молодой возрастной группе в случаях заболевания наблюдались повышенные уровни антител против пептидов 32 и 45 и сниженные уровни антител против пептида 74 по сравнению с контролями, тогда как в более старшей возрастной группе различий не наблюдалось. Антитела против модифицированных MDA пептидных последовательностей, за исключением пептида 74, были значимо связаны с IMT в более молодой возрастной группе, но не в более старшей группе (таблица 3).

В данных исследованиях идентифицирован ряд модифицированных MDA последовательностей апо B-100, которые узнаются антителами человека. Модификация MDA апо B-100 происходит в результате окисления ЛПНП, что указывает на то, что данные антитела относятся к семейству ранее описанных аутоантител против окисленных ЛПНП. Данная концепция подтверждается также наблюдением того, что за связывание антител с модифицированными MDA пептидами апо B-100 конкурируют окисленные ЛПНП. Вместе с окисленными фосфолипидами, идентифицированными Hörkkö et al., данные модифицированные MDA пептидные последовательности, по-видимому, составляют значительное большинство антигенных структур в окисленных ЛПНП. Сходно с антителами против фосфолипидов окисленных ЛПНП, антитела против модифицированных MDA последовательностей апо B-100 относились к типу IgM. Это позволяет предполагать, что последние антитела также принадлежат семейству T 15 природных антител. Антителам T 15 была приписана важная роль в ранней, независимой от T-клеток, защите от бактериальных инфекций, а также в удалении апоптотических клеток. Остается выяснить, имеют ли описанные здесь антитела против MDA-пептидов сходные функции. Были также идентифицированы антитела против большого количества нативных последовательностей апо B-100. Однако ярко выраженная ковариация между антителами против нативных и модифицированных MDA последовательностей позволяет предполагать, что данные антитела также образуются в ответ на окисление ЛПНП. Возможно также, что антитела против модифицированной MDA пептидной последовательности перекрестно взаимодействуют с соответствующей нативной последовательностью. Если бы антитела против нативных последовательностей апо B-100 связывались также с нативными частицами ЛПНП, это, по-видимому, должно было бы иметь важное значение для метаболизма ЛПНП. Однако тот факт, что нативные ЛПНП не конкурируют с нативными последовательностями апо B-100 за связывание с антителами, а также отсутствие корреляции между антителами против нативных последовательностей апо B-100 и уровнями холестерина ЛПНП свидетельствуют против наличия подобного феномена.

Антитела против модифицированных MDA пептидных последовательностей постепенно снижаются с возрастом в случаях заболевания, но не в контроле. За исключением MDA-пептида 74, антитела IgM против MDA-пептидов были значимо связаны с каротидным IMT в более молодой возрастной группе (менее 62 лет), но не в старшей возрастной группе. Данные наблюдения позволяют предполагать, что в возрасте между 50 и 70 годами происходят значительные изменения во взаимодействиях между иммунной системой и атеросклерозом сосудов. Одна возможность заключается в том, что у более молодых индивидуумов процесс заболевания атеросклерозом находится в более активной стадии с более выраженным вовлечением иммунных клеток. Другая возможность заключается в том, что пониженные уровни антител против модифицированных MDA пептидных последовательностей у более старых субъектов отражает старение вовлеченных в атеросклероз иммунных клеток. Было выдвинуто предположение, что ослабленная функция иммунных клеток вследствие иммунологического старения вносит вклад в повышенную подверженность инфекции и раку старшей части населения. Интересно, что иммунологическое старение тормозится антиоксидантами, что указывает на вовлечение окислительного стресса. Иммунные клетки, которые взаимодействуют с эпитопами окисленных ЛПНП, по-видимому, особенно подвержены воздействию окислительного стресса. Поскольку окисленные ЛПНП имеются в артериях уже в очень раннем возрасте, данные иммунные ответы непрерывно провоцируются на протяжении нескольких десятилетий, что может дополнительно способствовать развитию иммунологического старения.

Было обнаружено, что повышенный уровень антител против двух сайтов в апо B-100 позволяет предсказывать риск инфаркта миокарда и коронарной гибели у субъектов в возрасте менее 62 лет. Для антител против данных сайтов был показан высокий уровень ковариации, что позволяет предполагать, что они были продуцированы в ответ на одни и те же базовые патофизиологические процессы. Тот факт, что средний временной интервал от сбора крови до случая коронарного заболевания составлял лишь 2,8 лет, делает данные антитела особенно интересными в качестве маркеров повышенного риска CHD. Не обнаружено связей уровней антител против модифицированных MDA пептидных последовательностей апо B-100 с другими факторами риска CHD, такими как гиперлипидемия, гипертония и диабет, что позволяет предполагать, что они являются независимыми маркерами риска CHD. Случаи CHD в настоящем исследовании не относились к индивидуумам с особо высоким риском, и в данном отношении являются репрезентативными для обычного больного CHD. Тот факт, что IgM против модифицированных MDA последовательностей апо B-100 позволяют прогнозировать краткосрочный риск развития случаев острого коронарного заболевания у индивидуумов, который не мог бы быть определен как высокий риск на основании скрининга известных факторов риска, позволяет предполагать, что это могло бы стать полезным инструментом для выявления индивидуумов, нуждающихся в активном профилактическом лечении. Однако для того, чтобы можно было дать окончательную оценку клинической значимости определения антител против модифицированных MDA пептидов апо B-100, необходимы значительно более развернутые проспективные исследования с многомерным анализом. Другим ограничением данного клинического исследования служит то, что авторы анализировали антитела против лишь небольшого количества антигенных сайтов апо B-100, и то, что титры антител против других сайтов могут быть даже лучшими маркерами риска сердечно-сосудистых заболеваний.

У субъектов моложе 60 лет антитела против большого количества модифицированных MDA сайтов апо B-100 коррелировали со степенью существующего сосудистого заболевания, оцениваемого по каротидному IMT. Антитела IgM были связаны с каротидным IMT более прочно, чем антитела IgG. Хотя в качестве показателя общей тяжести атеросклероза каротидный IMT имеет очевидные ограничения, данные наблюдения все же позволяют предполагать, что определение IgM против модифицированных MDA последовательностей апо B-100 может служить одним из способов оценки тяжести имеющегося атеросклероза. Данные наблюдения также согласуются с некоторыми предшествующими исследованиями, в которых сообщалось о связях между заболеванием коронарной и каротидной артерий и антителами IgM против окисленных ЛПНП.

Антитела против пептида 74 отличались от других антител против пептидов апо B-100 во многих отношениях. Их уровень был выше в контроле, чем в случаях заболевания, они не снижались с возрастом и не были связаны со степенью каротидного заболевания. Следовательно, антитела против данной пептидной последовательности являются интересными кандидатами на роль атерозащитного иммунного ответа.

Важным вопросом является причина существования данных связей. Они ясно показывают, что иммунные ответы против модифицированных MDA сайтов апо B-100 каким-то образом вовлечены в процесс атеросклеротического заболевания. Поскольку высокие уровни антител связаны с более тяжелым атеросклерозом и повышенным риском развития острых коронарных заболеваний, одна из очевидных возможностей заключается в том, что данные иммунные ответы способствуют атерогенезу. Исследования, показывающие, что иммунные ответы против белков теплового шока, таких как HSP 65, являются атерогенными, в какой-то мере подтверждают данное мнение. Однако исследования на экспериментальных животных показали атерозащитное действие иммунизации окисленными ЛПНП. Восстановление B-клеток у мышей с удаленной селезенкой и нокаутированным апо E приводит к снижению атеросклероза. Снижение атеросклероза наблюдалось также у мышей с нокаутированным апо E, получавших повторные инъекции иммуноглобулина. Данные наблюдения не обязательно свидетельствуют против атерозащитной роли иммунных ответов против окисленных ЛПНП. Данные иммунные ответы активируются проатерогенными процессами, такими как окисление ЛПНП. Следовательно, они также должны, по-видимому, находиться в соответствии с тяжестью процесса заболевания и могли бы служить в качестве маркеров тяжести заболевания и риска CHD без внесения вклада в развитие заболевания. Тот факт, что иммунизация мышей с нокаутированным апо E пептидными последовательностями апо B-100 тормозит развитие атеросклероза, о чем сообщается в двух сопроводительных документах, показывает, что это, по-видимому, действительно имеет место. Действительно, наиболее важным результатом настоящего исследования может быть также идентификация структур, которые могли бы быть применены в качестве компонентов вакцины против атеросклероза. То наблюдение, что снижение антител против модифицированных MDA пептидных последовательностей апо B-100, которое происходит с возрастом, сопровождается повышением в плазме уровня окисленных ЛПНП, позволяет предполагать, что повышенный клиренс минимально окисленных ЛПНП из кровяного русла может быть одним из механизмов, посредством которых данные антитела могли бы обеспечивать защиту от атеросклероза.

Способы

Исследуемая популяция

Исследуемые субъекты, родившиеся между 1926 и 1945 гг., относятся к изучаемой группе Malmö «Диета и рак (MDC)». Случайную выборку из 50% тех, кто вошел в исследование MDC между ноябрем 1991 и февралем 1994, пригласили принять участие в изучении эпидемиологии заболевания каротидной артерии. Об обычной практике получения информации о заболевании и смертности после исследования состояния здоровья, а также определения традиционных факторов риска, уже сообщалось.

Было выявлено восемьдесят пять случаев острого коронарного заболевания сердца, т.е. фатальных или нефатальных MI, или смертей вследствие коронарного заболевания сердца (CHD). Участники, у которых в истории болезни имелся инфаркт миокарда или инсульт (n=6), были исключены из настоящего исследования. Для каждого случая заболевания были отобраны два контроля без наличия в истории болезни инфаркта миокарда или инсульта, соответствующие по возрасту, полу, привычки курения, наличию гипертонии и месяцу участия в скрининговом исследовании, а также длительности мониторинга. Вследствие объяснимой причины (отсутствие образцов крови в количествах, достаточных для оценки пептидов), в семи случаях заболевания был доступен лишь один контроль, а для одного случая заболевания контролей не было. Данный случай был исключен из анализа. Таким образом, исследуемая популяция состоит из 227 субъектов, 78 случаев заболевания и 149 контролей, в возрасте 49-67 (в среднем 61) лет в качестве отправной точки.

Лабораторные анализы

Образцы крови собирали после голодания в течение ночи для определения содержания в сыворотке холестерина, триглицеридов, холестерина ЛПВП, холестерина ЛПНП и глюкозы цельной крови. Холестерин ЛПНП в нмоль/л рассчитывали согласно формуле Фридвальда. Окисленные ЛПНП измеряли с помощью ИФА (Mercordia).

Ультразвуковая васкулография B-типа

Для оценки каротидных бляшек в правой каротидной артерии применяли компьютеризованную томографическую систему Acuson 128 (Acuson, Mountain View, Калифорния) с МГц преобразователем, как описано ранее.

Разработка ИФА для пептидных последовательностей апо B-100

Были синтезированы (Euro-Diagnostica AB, Malmö, Швеция, и KJ Ross Petersen AS, Horsholm, Дания) и применены для ИФА 302 пептида, соответствующие полной аминокислотной последовательности аполипопротеина B человека. Часть каждого синтетического пептида модифицировали 0,5 М MDA (Sigma-Aldrich Sweden AB, Стокгольм, Швеция) в течение 3 час при 37°С и в присутствии липосом 0,5 М MDA в течение 3 час при 37°С или 5 мМ CuCl₂ (Sigma) в течение 18 час при 37°С. Модифицированные MDA пептиды диализовали против ЗФР, содержащего 1 мМ ЭДТА, с несколькими сменами в течение 18 час при 4°С. Модификацию пептидов проверяли в денатурирующих полиакриламидных гелях (BioRad Laboratories, Hercules, CA), пригодных для разделения пептидов.

Смесь яичного фосфатидилхолина (EPC) (Sigma) и фосфатидилсерина (PS) (Sigma) в растворе хлороформа в молярном отношении 9:1 и с концентрацией фосфолипида (PL) 3 мМ упаривали в стеклянном контейнере под слабой струей аргона. После этого контейнер помещали в вакуум на 3 часа. К высушенной пленке EPC/PS добавляли раствор, содержащий 0,10 мМ пептида (5 мл) в стерильно отфильтрованном 10 мМ HEPES-буфере pH 7,4, 145 мМ NaCl и 0,003% азид натрия, и инкубировали в течение 15 мин при 50°С. Смесь слегка перемешивали в течение приблизительно 5 мин при комнатной температуре и затем помещали в баню с ледяной водой и сонифицировали с амплитудой 7,5 микрон в течение 3 х 3 мин (Sonyprep 150 MSE Sanyo, Tamro-Mediab, Швеция) с перерывами 1 мин. Смесь PL-пептид, нативный или модифицированный 0,5 М MDA в течение 3 мин при 37°С или 5 мМ CuCl₂ в течение 18 час при 37°C, хранили под аргоном в стеклянных сосудах, закрытых алюминиевой фольгой, при 4°С и использовали в пределах 1 недели. Модифицированную MDA смесь диализовали против ЗФР, содержащего 1 мМ ЭДТА, с несколькими сменами в течение 18 час при 4°С перед хранением. Модификацию смеси проверяли в денатурирующих полиакриламидных гелях (BioRad Laboratories, Sundbyberg, SE), пригодных для разделения пептидов.

Нативные или модифицированные синтетические пептиды, разведенные в ЗФР pH 7,4 (20 мкг/мл) в присутствии или в отсутствие липосом, абсорбировали на лунки планшета для микротитрования (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Дания) ночной инкубацией при 4°С. В качестве контроля один из пептидов (P6) наносили на каждый планшет. После промывки ЗФР, содержащим 0,05% твин-20 (ЗФР-Т), покрытые планшеты блокировали SuperBlock в TBS (Pierce, Rockford, IL) в течение 5 мин при комнатной температуре с последующей инкубацией с объединенной плазмой человека, разведенной 1/100 в TBS-0,05% твин-20 (TBS-T) в течение 2 час при комнатной температуре и затем в течение ночи при 4°С. После промывки определяли задержку аутоантител, направленных против пептидов, с применением биотинилированных кроличьих антител против IgG или IgM человека (Dako A/S, Glostrup, Дания), соответствующим образом разведенных в TBS-T. После дополнительной инкубации в течение 2 час при комнатной температуре планшеты промывали, и связанные биотинилированные антитела определяли с помощью конъюгированного со щелочной фосфатазой стрептавидина (Sigma) инкубацией в течение 2 ч при комнатной температуре. Цветную реакцию проявляли с помощью набора субстрата фосфатазы (Pierce), и через 1 час инкубации при комнатной температуре измеряли поглощение при 405 нм. Величины поглощения различных пептидов делили на величину поглощения P6 и сравнивали.

Статистика

Для статистического анализа применяли SPSS. Результаты представлены в виде среднего диапазона и в виде долей, когда это уместно. Графики в форме столбиков и точечные диаграммы применяли лишь для иллюстрации связи между возрастом и отдельными пептидами в случаях заболевания и в контроле. Соответствующие графики применяли также для иллюстрации соотношения между возрастом и отдельными пептидами, случаями заболевания и контролями, соответственно, для групп с возрастом ниже и выше среднего возраста (61 год) при базовых условиях и отдельно для случаев заболевания и контролей в возрасте ниже среднего. В случаях заболевания и в контроле раздельно вычисляли частичные коэффициенты корреляции, приведенные к возрасту и полу, между отдельными пептидами и уровнями липидов в крови и общим каротидным IMT. Рассчитывали также приведенные к возрасту и полу частичные коэффициенты корреляции между общим каротидным IMT и отдельными пептидами в случаях заболевания и в контроле ниже и выше среднего возраста. Для оценки континуума величин с нормальным распределением применяли t-тест для независимых выборок и критерий хи-квадрат для соотношений между случаями заболевания и контролями. Для оценки континуума величин с аномальным распределением для случаев заболевания и контролей применяли непараметрический критерий (Манна-Уитни). Все величины p получены на основе двойной выборки.

Таблица

Приведенные к возрасту и полу коэффициенты корреляции для различных MDA пептидов при базовых условиях и толщиной интимы-среднего слоя общей каротидной артерии среди более молодых (49-61 год) и более пожилых (62-67 лет) субъектов со случаями заболевания инфарктом миокарда и их соответствующих контролей, отобранных по возрасту, полу, курению и гипертонии.

ПептидСлучаи заболевания плюс контроли, возраст 49-61 год, n=116Случаи заболевания плюс контроли, возраст 62-67 лет, n=111IGMMDA 320,235t-0,101MDA 450,366S-0,030MDA 740,1780,063MDA 1020,255S-0,039MDA 1290,330S-0,009MDA 1620,24510,001MDA 2100,2540,013MDA 2400,284S0,006IGGMDA 2150,119-0,059P<0,05; s/x0,01

Подписи к фигурам

На фиг.1-6 показан ответ антител против различных пептидов, полученных в соответствии с настоящим изобретением.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 1

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

FLDTVYGNCSTH FTVKTRKG

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 2

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

PQCSTHILQWLKRVHANPLL

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 3

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

VISIPRLQAEARSEILAHWS

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 4

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная Топология: линейная

KLVKEALKESQLPTVMDFRK

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 5

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

LKFVTQAEGAKQTEATMTFK

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 6

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 7

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная Топология: линейная KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 8

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 9

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

SLTSTSDLQSGIIKNTASLK

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 10

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

TASLKYENYELTLKSDTNGK

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 11

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

DMTFSKQNALLRSEYQADYE

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 12

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

MKVKIIRTIDQMQNSELQWP

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 13

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

IALDDAKINFN EKLSQLQTY

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 14

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 15

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

EEEMLENVSLVCPKDATRFK

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 16

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

GSTSHHLVSRKSISAALEHK

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 17

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

IENIDFNKSGSSTASWIQNV

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 18

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

IREVTQRLNGEIQALELPQK

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 19

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 20

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

HTFLIYITELLKKLQSTTVM

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 21

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

LLDIANYLMEQIQDDCTGDE

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 22

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 23

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

GNMGQTMEQLTPELKSSILK

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 24

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

SSILKCVQSTKPSLMIQKAA

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 25

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

IQKAAIQALRKMEPKDKDQE

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 27

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

SLNSHGLELNADILGTDKIN

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 28

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 29

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 30

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 31

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

ALLVPPETEEAKQVLFLDTV

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 32

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

IEIGLEGKGFEPTLEALFGK

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 33

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

SGASMKLTTNGRFREHNAKF

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 34

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

NUGDFEVAEKINAFRAKVH

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 35

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

GHSVLTAKGMALFGEGKAEF

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 36

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

FKSSVITLNTNAELFNQSDI

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 37

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

FPDLGQEVALNANTKNQKIR

Перечень последовательностей: Seq. ID NO 38

Источник: фрагмент аполипопротеина В

Длина: 20

Тип: аминокислотный пептид

Цепь: одиночная

Топология: линейная

ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS

Изобретение относится к области медицины и касается иммунотерапии на основе пептидов для лечения атеросклероза. Сущность изобретения включает фрагменты аполипопротеина В, в частности, его определенные пептиды для иммунизации или терапевтического лечения млекопитающих, включая человека, от ишемических сердечно-сосудистых заболеваний. Преимущество изобретения заключается в разработке новых антигенных пептидов аполипротеина В-100, предназначенных для лечения атеросклероза. 7 н. и 14 з.п. ф-лы, 5 табл., 6 ил.

1. Фрагменты аполипопротеина В, предназначенные для иммунизации или терапевтического лечения млекопитающих, включая человека, для борьбы с ишемическими сердечно-сосудистыми заболеваниями и имеющие иммуногенные или терапевтические свойства в отношении ишемических сердечно-сосудистых заболеваний и/или для диагностики присутствия или отсутствия антител, связанных с повышенным или пониженным риском развития ишемических сердечно-сосудистых заболеваний, причем фрагменты находятся в форме нативных пептидов или их альдегид-производных, включающие в себя группу

FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG

PQCSTHILQWLKRVHANPLL

VISIPRLQAEARSEILAHWS

KLVKEALKESQLPTVMDFRK

LKFVTQAEGAKQTEATMTFK

DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK

KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE

RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ

SLTSTSDLQSGIIKNTASLK

TASLKYENYELTLKSDTNGK

DMTFSKQNALLRSEYQADYE

MKVKIIRTIDQMQNSELQWP

IALDDAKINFNEKLSQLQTY

KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH

EEEMLENVSLVCPKDATRFK

GSTSHHLVSRKSISAALEHK

IENIDFNKSGSSTASWIQNV

IREVTQRLNGEIQALELPQK

HTFLIYITELLKKLQSTTVM

LLDIANYLMEQIQDDCTGDE

GNMGQTMEQLTPELKSSILK

SSILKCVQSTKPSLMIQKAA

IQKAAIQALRKMEPKDKDQE

RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ

SLNSHGLELNADILGTDKIN

WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ

TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ

EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ

ALLVPPETEEAKQVLFLDTV

IEIGLEGKGFEPTLEAKLGK

SGASMKLTTNGRFREHNAKF

NLIGDFEVAEKINAFRAKVH

GHSVLTAKGMALFGEGKAEF

FKSSVITLNTNAELFNQSDI

FRDLGQEVALNANTKNQKIR

ATRFKHLRKYTYNYEAESSS

или активный сайт одного или более из данных пептидов.

HTFLIYITELLKKLQSTTVM

ALLVPPETEEAKQVLFLDTV

FLDTVYGNCSTHFTVKTRK

PQCSTHILQWLKRVHANPLL

LLDIANYLMEQIQDDCTGDE

CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ

GNMGQTMEQLTPELKSSILR

SSILKCVQSTKPSLMIQKAA

IQKAAIQALRKMEPKDKDQE

IEIGLEGKGFEPTLEALFGK

VISIPRLQAEARSEILAHWS

KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE

RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ

SLTSTSDLQSGIIKNTASLK

TASLKYENYELTLKSDTNGK

DMTFSKQNALLRSEYQADYE

GSTSHHLVSRKSISAALENK

IALDDAKINFNEKLSQLQTY

IENIDFNKSGSSTASWIQNV

NLIGDFEVAEKINAFRAKVH

IREVTQRLNGEIQALELPQK

GHSVLTAKGMALFGEGKAEF

KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH

FPDLGQEVALNANTKNQKIR

ATRFKHLRKYTYNYEAESSS

или активный сайт одного или более из данных пептидов.

ATRFKHLRKYTYNYEAESSS

PQCSTHILQWLKRVHANL

GNMGQTMEQLTPELKSSILK

IEIGLEGKGFEPTLEALFGK

VISIPRLQAEARSEILAHWS

SLTSTSDLQSGIIKNTASLK

GSTSHHLVSRKSISAALEHK

IREVTQRLNGEIQALELPQK

KTTKQSFDLSVKAQYKNKH

FPDLGQEVALNANTKNQKIR

в нативной форме или в форме MDA - или гидроксиноненальпроизводных для получения фармацевтических композиций, предназначенных для иммунотерапии или терапии для лечения ишемических сердечно-сосудистых заболеваний, необязательно в сочетании с адъювантом.

ATRFKHLRKYTYNYEAESSS

PQCSTHILQWLKRVHANLL

GNMGQTMEQLTPELKSSILK

IEIGLEGKGFEPTLEALFGK

VISIPRLQAEARSEILAHWS

SLTSTSDLQSGIIKNTASLK

GSTSHHLVSRKSISAALEHK

IREVTQRLNGEIQALELPQK

KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH

FPDLGQEVALNANTKNQKIR

необязательно в сочетании с одним или более фармацевтически инокулируемыми наполнителями и/или адъювантами.

ATRFKHLRKYTYNYEAESSS

PQCSTHILQWLKRVHANPLL

GNMGQTMEQLTPELKSSILK

IEIGLEGKGFEPTLEALFGK

VISIPRLQAEARSEILAHWS

SLTSTSDLQSGIIKNTASLK

GSTSHHLVSRKSISAALEHK

IREVTQRLNGEIQALELPQK

KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH

FPDLGQEVALNANTKNQKIR

необязательно в сочетании с адъювантом.

ATRFKHLRKYTYNYEAESSS

PQCSTHILQWLKRVHANPLL

GNMGQTMEQLTPELKSSILK

IEIGLEGKGFEPTLEALFGK

VISIPRLQAEARSEILAHWS

SLTSTSDLQSGIIKNTASLK

GSTSHHLVSRKSISAALEHK

IREVTQRLNGEIQALELPQK

KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH

FPDLGQEVALNANTKNQKIR

ATRFKHLRKYTYNYEAESSS

PQCSTHILQWLKRVHANPLL

GNMGQTMEQLTPELKSSILK

IEIGLEGKGFEPTLEALFGK

VISIPRLQAEARSEILAHWS

SLTSTSDLQSGIIKNTASLK

GSTSHHLVSRKSISAALEHK

IREVTQRLNGEIQALELPQK

KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH

FPDLGQEVALNANTKNQKIR

либо в нативной форме, либо в форме MDA- или гидроксиноненальпроизводных, вводят указанному млекопитающему, страдающему от атеросклероза или подверженного риску развития ишемических сердечно-сосудистых заболеваний, в частности, инфаркта миокарда.

ATRFKHLRKYTYNYEAESSS

PQCSTHILQWLKRVHANPLL

GNMGQTMEQLTPELKSSILK

IEIGLEGKGFEPTLEALFGK

VISIPRLQAEARSEILAHWS

SLTSTSDLQSGIIKNTASLK

GSTSHHLVSRKSISAALEHK

IREVTQRLNGEIQALELPQK

KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH

FPDLGQEVALNANTKNQKIR

вводят для создания пассивной иммунизации.

Приоритет по пунктам и признакам:

пп.1 и 2 имеют дату приоритета от 05.04.2001 за исключением последнего пептида, который имеет дату приоритета от 09.11.2001;

пп.3-10 имеют дату приоритета от 05.04.2001;

пп.11, 12, 16, 19 имеют дату приоритета от 05.04.2001 за исключением пептидов ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS который имеет дату приоритета от 09.11.2001;

пп.13-15, 17-18, 20-21 имеют дату приоритета от 09.11.2001.