СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам выделения чистой культуры микроорганизмов из патологического материала.

Известны способы выделения чистой культуры микобактерий туберкулеза путем обработки патологического биоматериала, мокроты 2-6% раствором серной кислоты или едкого натра, 10% раствором трехзамещенного фосфата натрия, хлоргексидина, 15-20% раствором соляной кислоты в двойном объеме, антибиотиками с последующим пересевом на плотные питательные среды, но в основном на среду Левенштейна-Йенсена, рекомендованную ВОЗ.

Недостатками указанных способов является депрессивное воздействие указанных средств на жизнеспособность микобактерий туберкулеза и, соответственно, их рост на питательных средах, длительность обработки (до 24 часов при использовании трехзамещенного фосфата натрия) и необходимость проведения центрифугирования, отмывания осадка.

За прототип взят метод Гона: обработка 2-6% растворами серной кислоты патологического материала для подавления посторонней микрофлоры с последующим центрифугированием и отмыванием (Хоменко А.Г. Туберкулез. - М.: Медицина, 1996. - С.117-118).

Недостатком способа является использование серной кислоты, необходимость центрифугирования, отмывания, опасность проводимых обработок и вредное воздействие серной кислоты на рост микобактерий туберкулеза при высеве на питательные среды.

Для устранения указанных недостатков, улучшения выделения и усиления роста культуры микобактерий туберкулеза, повышения безопасности обработки патологического материала разработан и апробирован щадящий способ выделения микобактерий туберкулеза, включающий обработку патологического гомогенизированного биоматериала, мокроты и др. в соотношении 1:1 с массой биоматериала раствором 5-6% лимонной кислоты с 3-4% перекисью водорода в течение 30-60 минут, затем раствором 4-5% янтарной кислоты с 3% перекисью водорода в том же соотношении в течение 30-60 минут с последующей нейтрализацией суспензии 5-10% раствором аммиака до рН 6,8-7,0, декантацией надосадочной жидкости и высевом содержимого осадка на минеральную агаровую среду Левенштейна-Йенсена.

При проведении исследований для подтверждения эффективности способа перед обработкой проводили дополнительное обсеменение суспензии патологического биоматериала стафилококками, кишечной палочкой и сальмонеллами из расчета 10 тыс. микроорганизмов в 1 мл суспензии и 1 мг микобактерий туберкулеза бычьего и человеческого видов на 1 мл суспензии.

Пример осуществления способа

Суспензию из кусочков пораженных органов (легких, селезенки, лимфоузлов) от больных туберкулезом животных (крупный рогатый скот, морские свинки) после измельчения ножницами заливают раствором, содержащим 4-6% лимонной кислоты и 3% перекиси водорода, в соотношении 1:1 к суспензии биоматериала и выдерживают в течение 30-60 минут при комнатной температуре. После обработки суспензии из пораженных органов и тканей раствором лимонной кислоты и перекиси водорода добавляют раствор, содержащий 4-5% янтарной кислоты и 3% перекиси водорода, в соотношении с суспензией 1:1 для полного подавления, уничтожения посторонней микрофлоры. После выдерживания суспензии в растворе течение 30-60 минут при комнатной температуре проводят ее нейтрализацию 5-10% раствором аммиака до рН 7,0, декантацию надосадочной жидкости и высев осадка на плотную агаровую среду Левенштейна-Йенсена.

Концентрации растворов кислот и перекиси водорода для обработки патологического материала и длительность обработки были определены экспериментальным путем (см. таблицу).

  Результаты изыскания щадящего способа подавления посторонней микрофлоры для выделения чистой культуры бактерий туберкулеза № п/п Способ и средства подавления посторонней микрофлоры в суспензии патологического материала Рост микроорганизмов при пересеве на минеральный или мясопептонный агар с глицерином Стафилококки, 100 тыс/мл Сальмонеллы, 100 тыс/мл Кишечная палочка E. coli, 100 тыс/мл Микобактерий, 1 мг в 1 мл 1 2 3 4 5 6 1. 3% р-ром лимонной кислоты с 3% перекисью водорода, а затем 3% р-ром янтарной кислоты с 3% перекисью водорода с последующей нейтрализацией суспензии 5-10% р-ром аммиака Рост отсутствует Рост на 2-й день Рост на 2-й день Рост отсутствовал из-за сплошного роста посторонней микрофлоры 2. 4% р-ром лимонной кислоты с 3% перекисью водорода, а затем 4% р-ром янтарной кислоты с 3% перекисью водорода с последующей нейтрализацией суспензии 5-10% р-ром аммиака Рост отсутствует Рост отсутствует Рост отсутствует Рост на 8-9-й день после высева 3. 5% р-ром лимонной кислоты с 3% перекисью водорода, а затем 4% р-ром янтарной кислоты с 3% перекисью водорода с последующей нейтрализацией суспензии 5-10% р-ром аммиака Рост отсутствует Рост отсутствует Рост отсутствует Стабильный рост на 9-10-й день после высева 4. 6% р-ром лимонной кислоты с 3% перекисью водорода, а затем 5% р-ром янтарной кислоты с 3% перекисью водорода с последующей нейтрализацией суспензии 5-10% р-ром аммиака Рост отсутствует Рост отсутствует Рост отсутствует Стабильный рост на 9-12-й день после высева

Из данных, представленных в таблице, следует, что обработка гомогенизированной суспензии из кусочков легкого, печени, селезенки, мокроты, обсемененных стафилококками, сальмонеллами, кишечной палочкой и микобактериями туберкулеза, раствором лимонной кислоты 4-6% с 3% перекиси водорода в течение 30-60 минут, а затем раствором 4-5% янтарной кислоты с 3% перекиси водорода в течение 30-60 минут с последующей нейтрализацией суспензии 5-10% раствором аммиака подавляет рост посторонней микрофлоры и обеспечивает стабильный рост микобактерий туберкулеза через 9-12 суток после высева на плотную среду Левенштейна-Йенсена. Внесение янтарной кислоты обеспечивало не только подавление посторонней микрофлоры, но и улучшало начальное развитие микобактерий туберкулеза.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам выделения чистой культуры микроорганизмов из патологического материала. Способ предусматривает следующее. Измельчают кусочки пораженных органов (биоматериал) и готовят суспензию. Полученную суспензию заливают раствором, содержащим 4-6% лимонной кислоты и 3% перекиси водорода в соотношении 1:1 к суспензии биоматериала и выдерживают в течение 30-60 минут при комнатной температуре с последующей обработкой раствором, содержащим 4-5% янтарной кислоты и 3% перекиси водорода в соотношении с суспензией 1:1. Выдерживают 30-60 минут с последующей нейтрализацией полученной суспензии 5-10% раствором аммиака до рН 7,0. Проводят декантацию надосадочной жидкости и высев осадка на агаровую среду Левенштейна-Йенсена. Изобретение позволяет сократить сроки выделения микобактерий. 1 табл., 1 пр.

Способ выделения чистой культуры микобактерий туберкулеза, включающий обработку гомогенизированного патологического биоматериала растворами кислот, отличающийся тем, что обработку проводят сначала раствором, содержащим 4-6% лимонной кислоты и 3% перекиси водорода, в соотношении 1:1 с массой биоматериала в течение 30-60 мин, затем раствором, содержащим 4-5% янтарной кислоты и 3% перекиси водорода, в том же соотношении в течение 30-60 мин, после этой обработки нейтрализуют суспензию 5-10%-ным раствором аммиака до рН 6,8-7,0, проводят декантацию надосадочной жидкости и высевают осадок на агаровую среду Левенштейна-Йенсена.