ПЛОТНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЛЕПРОМ БОЛЬНЫХ ЛЕПРОЙ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано, в частности, для культивирования микобактерий, выделенных из лепрозных источников - лепром больных лепрой людей и экспериментально зараженных животных.

Из практики медицины известна яичная среда Левенштейна-Йенсена, применяемая во всем мире в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и других микобактерий из патологического материала от больных (Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.2003 г., приложение №11, С.266.). Среда Левенштейна-Йенсена включает следующие ингредиенты: калий однозамещенный фосфорнокислый (КН₂РO₄), магний сернокислый (MgSO₄×7Н₂O), магний лимоннокислый (Мg₃(С₆Н₅O₇)₂×14Н₂O), L-аспарагин (C₄H₈N₂O₃×H₂O), глицерин (С₃Н₈О₃), малахитовый зеленый (C₅₂H₅₄O₁₂N₄), яичная масса (свежие диетические куриные яйца), вода дистиллированная. Известная среда не дает возможность получить технический результат - выделение возбудителя из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией в аксеническую культуру при первичном посеве материала.

Из практики медицины известна яичная среда Финн-II, применяемая для первичного выделения возбудителя туберкулеза и других микобактерий из патологического материала от больных (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под. ред. М.О.Биргера.- 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982. - С.79), которая содержит следующие ингредиенты: магний сернокислый (MgSO₄×7Н₂О), натрий лимоннокислый (Nа₃С₆Н₅O₇×5,5Н₂O), квасцы железоаммонийные (FeNH₄(SO₄)₂×12H₂O), калий однозамещенный фосфорнокислый (КН₂РO₄), аммоний лимоннокислый однозамещенный (C₈H₁₁O₇N), натрий глутаминовокислый однозамещенный (NaC₅H₈NO₄×H₂O), глицерин (C₃H₈O₃), малахитовый зеленый (C₅₂H₅₄O₁₂N₄), яичная масса (свежие диетические куриные яйца), вода дистиллированная. Известная среда не дает возможность получить технический результат - выделение возбудителя из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией в аксеническую культуру при первичном посеве материала.

Наиболее близкой предлагаемой является среда Школьниковой, содержащая калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, L-аспарагин, глицерин, дистиллированную воду (Пр. МЗ №109 от 21.03.2003 г., приложение №11, С.270-271). Известная среда не дает возможности получить технический результат - выделение возбудителя из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией в аксеническую культуру при первичном посеве материала.

Сходство известной среды с предлагаемой заключается в том, что они обе относятся к медицине, а именно к микробиологии, и содержат глицерин, солевую композицию, включающую калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированную воду.

Задачей предлагаемого изобретения является выделение возбудителя из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией в аксеническую культуру.

Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением положительного результата.

Решение поставленной задачи состоит в том, что питательная среда, содержащая калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, глицерин и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит натрий хлористый, мочевину и сухой питательный агар для культивирования микроорганизмов - ГРМ-агар (RU 2089609 С1, 10.09.1997) следующего качественного и количественного состава (мас.%): панкреатический гидролизат рыбной муки - 2,4; натрия хлорид - 0,4; агар - 1,2 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

калий однозамещенный фосфорнокислый 0,15 натрий двузамещенный фосфорнокислый 0,25 магний сернокислый 0,05 натрий лимоннокислый, 0,15 лимоннокислое аммиачное железо 0,005 глицерин 3,5 натрий хлористый 0,5-3,0 мочевина 1,0-4,0 сухой питательный агар   для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар) 1,0-2,5 дистиллированная вода остальное

Предлагаемой плотной питательной средой достигается результат - выделение возбудителя в аксеническую культуру, повышение высеваемости микобактерий из лепром больных лепрой (на 77,8% по сравнению с прототипом).

Известно, что не существует общепризнанных методов культивирования M.leprae на искусственных питательных средах, несмотря на то что попытки получить культуру возбудителя лепры продолжаются 135 лет с момента открытия M.leprae А.Гансеном в 1874 году.

Проведенный анализ патентной и научной литературы показал, что предлагаемая плотная питательная среда для культивирования микобактерий, выделенных из лепром больных лепрой, ранее не применялась.

Отсутствие воспроизводимых способов культивирования M.leprae на искусственных питательных средах создает определенные трудности для изучения биологии возбудителя лепры и создания различных биологических препаратов на основе M.leprae. Лабораторные животные (мыши, крысы, броненосцы), в организме которых размножаются M.leprae, выделенные из пораженных тканей больных лепрой людей, до настоящего времени являются единственным источником бактериальной массы, используемой в лепрологии для научных и практических целей. В частности изучение чувствительности к противолепрозным препаратам производится на мышах, зараженных в подушечку лапки. (Shepard С.С. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads of mice // J. Exp.Med., 1960. - V. 36. - P. 445-454.) Пассирование M.leprae на животных - длительный процесс, занимающий от 1,5 до 2 лет. Кроме этого отсутствие сред для культивирования M.leprae делает невозможным бактериологическую диагностику лепры. Следуя теории о двухфазности жизненного цикла в природном существовании М.leprae, внеорганизменная фаза которого может протекать в почве, авторы предлагают минимальную плотную питательную среду, не содержащую сложных органических соединений: ферментов и других белков, витаминов, нуклеиновых кислот, микобактинов и т.п. В качестве источника азота и углерода авторы добавляют в питательную среду простое органическое соединение - мочевину (CH₆N₂O), которая в качестве метаболита всегда присутствует как в макроорганизме, так и в почве. Основываясь на галотолерантности микобактерий, природным резервуаром которых является почва (Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М. и др.: под ред. А.И.Нетрусова. Экология микроорганизмов // М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 272 с.), авторы добавляют к питательной среде хлорид натрия в качестве ингибитора возможных сапрофитных контаминантов.

Предлагаемая питательная среда имеет следующий качественный состав: глицерин (С₃Н₈О₃), солевая композиция, включающая калий однозамещенный фосфорнокислый (KH₂PO₄), натрий двузамещенный фосфорнокислый (Nа₂НРO₄), магний сернокислый (MgSO₄×7Н₂O), натрий лимоннокислый (Nа₃С₆Н₅O₇×2H₂O), лимоннокислое аммиачное железо (FеNН₄С₆Н₅O₇), а также мочевина (CH₆N₂O), хлорид натрия (NaCl), сухой питательный агар (ГРМ-агар), дистиллированная вода.

Предлагаемая среда имеет следующий количественный состав: неизменяемая солевая композиция прототипа (в граммах на 1 литр среды в соответствии с Пр. МЗ №109 от 21. 03 2003 г., приложение №11, С.270-271): КН₂РO₄ - 1,5; Na₂HPO₄ - 2,5; MgSO₄×7H₂O - 0,5; Nа₂С₆Н₅O₇×2Н₂O - 1,5; Fe NН₄С₆Н₅O₇ - 0,05; что соответствует следующему содержанию ингредиентов в мас.%: КН₂РO₄ - 0,15; Na₂HPO₄ - 0,25; MgSO₄×7H₂O - 0,05; Na₂C₆H₅O₇×2Н₂O - 0,15; Fe NН₄С₆Н₅O₇ - 0,005; глицерин - 3 мл (на 100 мл среды), или 3,5 (мас.%);

дополнительные компоненты (мас.%):

натрий хлористый 1,5 мочевина 2,0 сухой питательный агар   для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар) 1,5 дистиллированная вода остальное

Предлагаемую плотную питательную среду готовят следующим образом. Вышеуказанную солевую композицию, глицерин, натрий хлористый (1,5 г) растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют в паровом стерилизаторе при 120°С в течение 20 минут. Затем к 96,5 г стерильной солевой основы добавляют 2 г кристаллической мочевины, 1,5 г ГРМ-агара, перемешивают, разливают по 5 мл среды в пробирки и стерилизуют при 112°С в течение 15 минут. Готовую стерильную плотную питательную среду в пробирках скашивают.

Предлагаемая авторами плотная питательная среда позволяет получить аксеническую культуру микобактерий, выделенных из лепром больных лепрой людей и тканей экспериментально зараженных животных. Культивирование микобактерий лепры на предлагаемой авторами питательной среде осуществляется следующим образом: ткань лепромы человека больного лепрой, или лапу мыши, зараженной интраплантарно по методу Shepard С.С. предварительно обрабатывают 5%-раствором серной кислоты с последующим промыванием физиологическим раствором, измельчают ножницами и гомогенизируют. Гомогенат центрифугируют при 1000 об/мин (3 мин). Собирают надосадочную жидкость и подсчитывают в ней количество микобактерий по методу Shepard C.C., McRae D.H. Посевы осуществляют градуированной пипеткой в объеме 0,1 мл надосадочной жидкости на скошенную поверхность плотной питательной среды, разлитой по 5 мл в пробирки.

Питательная среда имеет следующий состав (мас.%):

калий однозамещенный фосфорнокислый 0,15 натрий двузамещенный фосфорнокислый 0,25 магний сернокислый 0,05 натрий лимоннокислый 0,15 лимоннокислое аммиачное железо 0,005 глицерин 3,5 натрий хлористый 1,5 мочевина 2,0 сухой питательный агар   для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар) 1,5 дистиллированная вода остальное

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицей 1.

Таблица 1 Зависимость показателей роста микобактерий от содержания компонентов среды Содержимое компонентов среды,       мас.% Количество образцов Сроки появления видимого роста (сутки) Средний срок выделения культуры (сутки) Глицерин, солевая композиция в дист.воде Сухой питательный агар (ГРМ-агар) Мочевина NaCl       97,5 1,0 1,0 0,5 4 20-70 35 95,0 1,5 2,0 1,5 4 14-60 27 90,5 2,5 4,0 3,0 4 28-80 54

Таким образом, оптимальным соотношением компонентов среды, обеспечивающим решение поставленной задачи, является: глицерин и солевая композиция в дистиллированной воде - 95,0, мочевина - 2,0, хлорид натрия - 1,5, сухой питательный агар (ГРМ-агар) - 1,5.

Предлагаемая плотная питательная среда прошла успешную апробацию в ФГУ «НИИ по изучению лепры Росздрава» в 2008-2009 гг. при культивировании микобактерий из 1 образца лепром от больного лепроматозной лепрой и 9 образцов от экспериментально зараженных животных.

Ниже приведена сводная таблица результатов апробации плотной питательной среды для культивирования микобактерий из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией.

Таблица 2 Оценка роста колоний микобактерий на различных питательных средах Плотная питательная среда Количество штаммов Количество выросших культур Доля выросших штаммов (%) Глицерин, солевая композиция       в дистиллированной 9 9 100 воде с мочевиной, хлоридом       натрия и сухим питательным       агаром (ГРМ-агар)       Среда Школьниковой 9 2 22,2 Среда Левенштейна- 9 3 33,3 Йенсена       Среда Финна-II 9 1 11,1

Ниже приводятся результаты апробации среды.

Пример 1.

Штамм M.leprae (I-пассаж) первично получен из лепромы больного Ку-ва Т.С., и.б. №3893, диагноз: лепра, лепроматозный тип (LLs), пассировали на мышах линии СВА по методу Shepard C.C. Ткань лапы мыши, зараженной интраплантарно, после предварительной обработки 5%-ным раствором серной кислоты с последующим промыванием физиологическим раствором измельчают ножницами и гомогенизируют. Гомогенат центрифугируют при 1000 об/мин (3 мин). Собирают надосадочную жидкость и подсчитывают в ней количество микобактерий по методу Shepard C.C., McRae D.H. Посевы осуществляют градуированной пипеткой в объеме 0,1 мл надосадочной жидкости на плотную питательную среду, разлитую по 5 мл в пробирки и скошенную. Посевная доза составила 1×10⁴ клеток. Питательная среда имеет следующий состав: глицерин и солевую композицию, включающую калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она вместо L-аспарагина дополнительно содержит хлорид натрия, мочевину и сухой питательный агар (ГРМ-агар) при следующем соотношении предлагаемых компонентов, мас.%:

мочевина - 1,0;

хлорид натрия - 0,5;

сухой питательный агар (ГРМ-агар) - 1,0;

солевая композиция и глицерин в дистиллированной воде - остальное (97,5).

Одновременно посевы производят на питательную среды Левенштейна-Йенсена и Финн II. Посевы выдерживают в термостате при 30°С.

Через 70 суток после первичного посева материала обнаружен рост на предлагаемой авторами среде в виде мелких беспигментных шероховатых колоний. При микроскопии мазка выделенной культуры, окрашенного по методу Циля-Нильсена, обнаружены мелкие кислотоустойчивые палочки. При окраске мазка аурамин-родамином регистрировали характерное для микобактерий золотисто-желтое свечение палочек в ультрафиолетовых лучах.

На средах Левенштейна-Иенсена и Финн II роста бактерии не было обнаружено в течение всего срока наблюдения (12 месяцев).

Таким образом, из данного примера видно, что микобактерии растут только на предлагаемой авторами среде.

Пример 2.

Лепрома с правого плеча больного Мо-ва, и.б. №3894, диагноз: лепра, погранично-лепроматозная форма (BL). Подготовку материала и посев на среду осуществляли аналогично первому примеру. Посевная доза составила 4,2×10⁶ клеток. Питательная среда имеет следующий состав: глицерин и солевую композицию, включающую калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она вместо L-аспарагина дополнительно содержит хлорид натрия, мочевину и сухой питательный агар (ГРМ-агар) при следующем соотношении предлагаемых компонентов, мас.%:

мочевина - 4,0;

хлорид натрия - 3,0;

сухой питательный агар (ГРМ-агар) - 2,5,

солевая композиция и глицерин в дистиллированной воде - остальное (90,5).

Через 14 суток после первичного посева материала обнаружен рост на предлагаемой авторами среде в виде беспигментных мелких шероховатых колоний. При микроскопии мазка выделенной культуры, окрашенного по методу Циля-Нильсена, обнаружены мелкие кислотоустойчивые палочки. При окраске мазка аурамин-родамином регистрировали характерное для микобактерии золотисто-желтое свечение палочек в ультрафиолетовых лучах. На средах Левенштейна-Иенсена и Финн II роста бактерий не было обнаружено в течение всего срока наблюдения (4 месяца). Таким образом, из данного примера видно, что видимый рост микобактерии обнаружен только на предлагаемой авторами среде.

Пример 3.

Штамм M.leprae (IX пассаж) первично получен из лепромы больного Кр-ва В.А., и.б. №3863, диагноз: лепра, лепроматозный тип (LLs), пассировали на мышах линии СВА по методу Shepard C.C. Подготовку материала и посев на среды осуществляли аналогично первому примеру. Посевная доза составила 2,4×10⁷ клеток. Питательная среда имеет следующий состав: глицерин и солевую композицию, включающую калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она вместо L-аспарагина дополнительно содержит хлорид натрия, мочевину и сухой питательный агар (ГРМ-агар) при следующем соотношении предлагаемых компонентов, мас.%:

мочевина - 2,0;

хлорид натрия - 1,5;

сухой питательный агар (ГРМ-агар) - 1,5;

солевая композиция и глицерин в дистиллированной воде - остальное (95,0).

Через 36 суток после первичного посева материала обнаружен рост на предлагаемой авторами среде. На среде Левенштейна-Иенсена рост обнаружен позже на 2 недели. На среде Финн II рост отсутствовал в течение всего срока наблюдения (12 месяцев).

Таким образом, из данного примера видно, что рост микобактерий на предлагаемой среде опережает рост на среде Левенштейна-Иенсена.

Штамм M. leprae (VIII пассаж) первично получен из лепромы больной Му-вой М.С., и.б. №3120, диагноз: лепра, лепроматозный тип (LLs), пассировали на мышах линии СВА по методу Shepard C.C.

Подготовку материала и посев на среду осуществляли аналогично первому примеру. Посевная доза составила 3,4×10⁷ клеток.

Через 1,5 месяца после первичного посева материала визуализирован рост только на предлагаемой авторами среде в виде мелких шероховатых колоний.

На средах Левенштейна-Иенсена и Финн II роста бактерий не было обнаружено в течение всего срока наблюдения (12 месяцев).

Таким образом, из данного примера видно, что видимый рост микобактерий обнаруживают только на предлагаемой авторами среде.

Пример 4.

Штамм М.leprae (III пассаж) первично получен из лепромы больной Ка-ной А.П., и.б. №3541, диагноз: лепра, погранично-лепроматозная форма (BL), пассировали на мышах линии СВА по методу Shepard C.C. Подготовку материала и посев на среды осуществляли аналогично первому примеру. Посевная доза составила 1,5×10⁸ клеток. Питательная среда имеет следующий состав: глицерин и солевую композицию, включающую калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она вместо L-аспарагина дополнительно содержит хлорид натрия, мочевину и сухой питательный агар (ГРМ-агар) при следующем соотношении предлагаемых компонентов, мас.%:

мочевина - 0,3;

хлорид натрия - 0,2;

сухой питательный агар (ГРМ-агар) - 0,5;

солевая композиция и глицерин в дистиллированной воде - остальное (99,0).

Визуального роста микобактерий не обнаружено в течение всего срока наблюдения (12 месяцев).

Пример 5.

Штамм М.leprae (IV пассаж) первично получен из лепромы больной Ка-ной А.П., и.б. №3541, диагноз: лепра, погранично-лепроматозная форма (BL), пассировали на мышах линии СВА по методу Shepard C.C. Подготовку материала и посев на среды осуществляли аналогично первому примеру. Посевная доза составила 3,0×10⁷ клеток. Питательная среда имеет следующий состав: глицерин и солевую композицию, включающую калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она вместо L-аспарагина дополнительно содержит хлорид натрия, мочевину и сухой питательный агар (ГРМ-агар) при следующем соотношении предлагаемых компонентов, мас.%:

мочевина - 5,0;

хлорид натрия - 5,0;

сухой питательный агар (ГРМ-агар) - 3,5;

солевая композиция и глицерин в дистиллированной воде - остальное (86,5).

Визуального роста микобактерий не обнаружено в течение всего срока наблюдения (8 месяцев). На среде Левенштейна-Йенсена обнаружен рост культуры через 14 суток инкубации.

Предлагаемая среда позволяет выделить возбудителя из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией в аксеническую культуру, обеспечить рост и размножение микобактерий при посеве материала из лепрозных источников, получить рост изолированных колоний и повысить частоту высеваемости по сравнению с прототипом на 77,8%.

Таким образом, авторами предложена новая, никем ранее не предлагаемая плотная питательная среда для культивирования микобактерий при посеве образцов из лепром больных лепрой и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией. Предлагаемая среда может быть рекомендована для использования в научных и практических лабораториях противолепрозных учреждений системы здравоохранения.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования микобактерий из лепром больных лепрой людей и животных с экспериментальной лепрозной инфекцией. Питательная среда содержит калий однозамещенный фосфорнокислый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, лимоннокислое аммиачное железо, глицерин, натрий хлористый, мочевину, сухой питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар) и дистиллированную воду в заданных количествах. Изобретение позволяет повысить выход микобактерий и сократить срок их выявления. 2 табл.

Плотная питательная среда для культивирования микобактерий, выделенных из лепром больных лепрой, содержащая калий однозамещенный фосфорно-кислый, натрий двузамещенный фосфорно-кислый, магний сернокислый, натрий лимонно-кислый, лимонно-кислое аммиачное железо, глицерин и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит натрий хлористый, мочевину и сухой питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ- агар) при следующем соотношении компонентов, мас.%:
калий однозамещенный фосфорно-кислый 0,15 натрий двузамещенный фосфорно-кислый 0,25 магний сернокислый 0,05 натрий лимонно-кислый 0,15 лимонно-кислое аммиачное железо 0,005 глицерин 3,5 натрий хлористый 0,5-3,0 мочевина 1,0-4,0 сухой питательный агар для культивирования   микроорганизмов (ГРМ-агар) 1,0-2,5 дистиллированная вода остальное