СПОСОБ ПРЕДПОСЕВНОЙ ОБРАБОТКИ ПРОБ, СНЯТЫХ С ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ, НА ВЫДЕЛЕНИЕ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/84 

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к обнаружению микобактерий туберкулеза в пробах, снятых с объектов внешней среды.

Предпосевная обработка исследуемого материала на выделение микобактерий основана на том, что вещества, используемые в этих целях, должны оказывать бактерицидное действие на сопутствующую микрофлору, при этом существенно не влияя на жизнеспособность микобактерий. Обнаружение таких веществ составляет одну из актуальных задач ветеринарной и гуманной медицины, так же, как и для микробиологии в целом.

В этих целях в практике микробиологических лабораторий в настоящее время используют растворы серной (А.Ф.Коржинская, 1926; К.К.Креслинг, 1929; А.Н.Маккавейская, 1956), соляной (Ю.А.Юденич, 1928), щавелевой кислот (метод Гона, Левенштейна-Сумиоши, метод А.П.Аликаевой, 1971), едкого натра (метод флотации О.В.Мартова, 1971), гипохлорита кальция и других растворов.

К недостаткам перечисленных способов следует отнести губительное, в некоторой степени, действие кислот и щелочей на микобактерии. Однако процент загрязнения остается высоким, особенно при обработке проб, снятых с объектов внешней среды. Растворы кислот в малых концентрациях для обработки исследуемого на наличие микобактерий материала не обеспечивают освобождение его от сопутствующей микрофлоры.

Используемые в медицинской практике детергенты для обработки материала непригодны, так как в 70-87,5% случаев не обеспечивают подавление роста сопутствующей микрофлоры в пробах, снятых с объектов внешней среды, и в гомогенатах биоматериала, полученного от животного.

Следует отметить, что при обработке материала 5%-ным раствором щавелевой кислоты без последующего промывания физиологическим раствором как рекомендует Банникова Б.Н. (1980), рост микобактерий на средах Левенштейна-Йенсена, Финн II не происходит, так как рН среды в ней изменяется ниже 6,8.

Из перечисленных способов наиболее близким по технической сущности заявляемому изобретению является способ обработки проб с объектов внешней среды 2-4% раствором едкого натра с последующим двукратным отмыванием стерильным физиологическим раствором.

Исследуемую пробу растирали в ступке пестиком вместе с мелкобитым стеклом, заливали 4% раствором едкого натра, выдерживали 30 минут. Затем центрифугировали 20 минут при 3-4 тыс. оборотах в минуту. Надосадочную жидкость сливали и 2 раза отмывали стерильным физиологическим раствором. Осадок высевали на среду Финн II.

К недостаткам этих методов следует отнести низкую частоту выделения микобактерий и высокий процент проростов сопутствующей микрофлоры на питательных средах. Эксперименты показали недостаточное избавление гомогената от сопутствующей микрофлоры. Кроме того, частота выделения микобактерий при предварительной обработке проб этим способом была низкая. Опыты также показали, что едкий натр недостаточно снижал вязкость гомогената, в связи с чем посевы на питательные среды становились затруднительными, не полностью покрывали всю поверхность среды, и, вероятно, микобактерии, находящиеся в обволоченном слизью состоянии, не находят контакта с питательной средой.

Целью изобретения явилось повышение эффективности бактериологической диагностики туберкулеза за счет оптимизации условий предпосевной обработки биоматериала раствором, оказывающим высокое бактерицидное действие на сопутствующую микрофлору и максимально низкое - на микобактерии.

Поставленная цель достигается обработкой проб, снятых с объектов внешней среды, 1,5% раствором лаурилсульфата на 1,5% растворе едкого натра. Предварительную обработку гомогената проводили по следующей прописи: пробы, снятые с объектов внешней среды, измельчали и заливали физиологическим раствором. Оставляли на 24 часа при комнатной температуре, затем фильтровали через смоченную физиологическим раствором вату, и фильтрат центрифугировали 20 минут при 3-4 тыс. оборотах в минуту. К осадку добавляли 1,5% раствор лаурилсульфата на 1,5% растворе едкого натра, выдерживали 20 минут, центрифугировали еще 20 минут при 3-4 тыс. оборотах в минуту. В стерильных условиях надосадочную жидкость сливали, осадок отмывали физиологическим раствором 2-3 раза. Из полученного осадка делали высевы на поверхность питательной среды путем равномерного втирания.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав раствора отличается от прототипа введением новых компонентов, а именно: лаурилсульфата натра и едкого натра. Таким образом заявляемое техническое решение соответствует критерию «новизна». Анализ известных способов, используемых в целях предварительной обработки материалов на выделение микобактерий, показал, что использованные компоненты известны. Однако их применение в отдельности не обеспечивает таких свойств, которые они проявляют в заявленном решении, а именно значительное расширение бактерицидной и бактериостатической способности на сопутствующую микрофлору (за счет детергентного воздействия лаурилсульфата) и щадящее - на микобактерии. Таким образом, данный состав компонентов придает раствору новые свойства, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «существенные отличия»

В пробах, снятых с объектов внешней среды, куда вносили микобактерии птичьего вида или БЦЖ, предварительную обработку которых проводили предлагаемым методом, всегда обнаруживали исходную культуру.

Бактериологическое исследование как проб объектов внешней среды, так и патологического материала по предлагаемому методу доступно каждой ветеринарной лаборатории и вполне приемлемо для исследований в практике медицинских учреждений.

При экспериментальной проверке определяли влияние растворов лаурилсульфата натра на растворе едкого натра в разных концентрациях: 3% раствор лаурилсульфата натра на 1, 2, 3% растворах едкого натра; 1,5% раствор лаурилсульфата натра на 1,5 и 2% растворе едкого натра при экспозициях 30, 40, 60 минут и 3 часа. Порядок проведения испытания был следующий: в пробу, взятую из объекта внешней среды, вносили микобактерии птичьего вида, обрабатывали испытуемыми растворами в различных концентрациях и экспозициях. У выделенных первичных культур изучали и описывали следующие свойства:

- сроки обнаружения первичного роста;

- характер роста;

- интенсивность роста (слабый, умеренный, хороший, обильный).

По результатам многократных исследований наилучшие результаты получили при обработке 1,5% раствором лаурилсульфата на 1,5% растворе едкого натра. При этом первичный рост обнаруживали на 5-6 дней раньше. Причем рост происходил сплошной и более обильный. В нашем опыте экспозиция особой роли не играла, поскольку лаурилсульфат оказался намного более щадящим даже при 3-часовой экспозиции. Это очень важно при обработке сильно загрязненных материалов.

В следующих опытах проводили испытание 1,5% раствора лаурилсульфата на 1,5% растворе едкого натра при экспозиции 40 минут для предпосевной обработки проб, снятых с объектов внешней среды. Эти исследования проводили сравнительно. Контролем служили способы предпосевной обработки 10% раствором серной кислоты при экспозиции 20 минут и 4% раствором едкого натра при экспозиции 30 минут (таблица). Исследовали 47 проб (соскобы с кормушек, с пола, со стен), корма (сено, солома), взятые из неблагополучного по туберкулезу хозяйства. Было выделено 11 культур: 2- паратуберкулезные, 1 - птичьего вида и 8 - атипичных микобактерий.

Таким образом, проведенные исследования показали, что при предпосевной обработке проб внешней среды на выделение микобактерий наиболее эффективным является 1,5% раствор лаурилсульфата натра на 1,5% растворе едкого натра при экспозиции 40 минут.

Источники информации

1. Щуревский В.Е., Косенко В.И., Тажгалиев Н.М. Использование различных химических веществ для обработки патологического материала и влияние их на высеваемость микобактерий. / Бюллетень ВИЭВ. - 1987. - В. 64. - С.15-19.

2. Колычев М.Н., Шлыгин И.В. Значение прямого бактериологического контроля качества дезинфекции в комплексе мер борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота. / Тр. Омского вет. института. - С.54-55.

3. Банникова В.Н. Совершенствование методов бактериологического исследования патологического материала на туберкулез. /Тез. докл. научн. конф. Омск, 1980. - В.4, - С.63-64.

4. Колычев Н. характеристика микобактерий, изолированных из объектов звероводческих и животноводческих ферм. / Сб. н.т. Сиб. НИВИ. - 1976. - С.47-55.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к лабораторным методам исследования. Способ предпосевной обработки проб, снятых с объектов внешней среды, на выделение микобактерий заключается в том, что измельченные пробы биологического материала заливают физиологическим раствором на 24 часа при комнатной температуре, фильтруют через вату, центрифугируют 20 мин при 3-4 тыс. оборотах в минуту. Далее к осадку добавляют 1,5% раствор лаурилсульфата на 1,5% растворе едкого натра, выдерживают 20 мин, центрифугируют 20 мин при 3-4 тыс. оборотах в минуту, осадок 2-3 раза отмывают физиологическим раствором и делают посев на питательную среду. Использование способа позволяет оптимизировать условия предпосевной обработки биоматериала, что позволяет повысить эффективность бактериологической диагностики туберкулеза. 1 табл.

Способ предпосевной обработки проб, снятых с объектов внешней среды, на выделение микобактерий, заключающийся в воздействии на них раствором едкого натра, отличающийся тем, что измельченные пробы заливают физиологическим раствором на 24 ч при комнатной температуре, фильтруют через вату, центрифугируют 20 мин при 3-4 тыс. оборотах в минуту, к осадку добавляют 1,5%-ный раствор лаурилсульфата на 1,5%-ном растворе едкого натра, выдерживают 20 мин, центрифугируют 20 мин при 3-4 тыс. оборотах в минуту, осадок 2-3 раза отмывают физиологическим раствором и делают посев на питательную среду.