СРЕДСТВО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2015 года по МПК A61K36/185 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано для лечения и профилактики заболеваний, где основным патогенетическим фактором является нарушение метаболических процессов в стенках сосудов, ухудшение капиллярного кровообращения, венозный застой.

Эндотелиальная дисфункция лежит в основе патогенеза атеросклеротических поражений сосудов, диабетических ангиопатий (в том числе ретинопатии, нефропатий, поражений церебральных и коронарных сосудов, сосудов нижних конечностей и др.), нарушений равновесия между вазодилатирующими и вазоконстрикторными, протромбическими и пролиферативными функциями эндотелия.

Известны фармакологические препараты, обладающие ангиопротекторным (капилляропротекторным) действием лекарственных групп (например, аскорбиновая кислота, рутин, кверцетин, диосмин, сулодексид, гесперидин и др.).

Широкое применение в медицинской практике получили полусинтетические производные рутозида («Венорутон», «Троксевазин»), диосмина и гесперидина («Детралекс», «Флебодия»), трибенозида («Гливенол», «Проктогливенол»). Некоторые широкоиспользуемые в медицинской практике эндотелиопротекторы имеют растительное происхождение. Например, препараты «Эскузан», «Веноплант», «Ангионорм» и др. содержат экстракт из плодов конского каштана. Препарат «Антистакс» содержит экстракт из красных листьев винограда, «Эндотелон» - экстракт из виноградных косточек. «Венорутон» предотвращает повреждение клеточных мембран, вызываемое окислением, а также открытие межклеточных щелей и резкое повышение гидропроводности, индуцируемое тромбоцитами и нейтрофилами, оказывает защитный эффект даже при уже нарушенном эндотелиальном барьере и восстанавливает нарушенные морфологические свойства и гидропроводность эндотелия. Учитывая важную роль оксидативного стресса при развитии эндотелиальной дисфункции, важно изучение эндотелиопротекторного действия у препаратов, обладающих высокой антиоксидантной активностью. Антиоксидантный эффект проявляется в снижении и "устранении" окислительных свойств кислорода, ингибировании перекисного окисления липидов, защите сосудистого эндотелия от окислительного действия гидроксильных радикалов и гипохлористой кислоты.

Цитопротекторный эффект «Венорутона» проявляется в ингибировании активации и адгезии нейтрофилов, снижении агрегации эритроцитов и повышении устойчивости эритроцитов к деформации, снижении высвобождения медиаторов воспаления.

«Детралекс» - ангиопротектор, оказывающий стабилизирующее действие на капилляры. Препарат уменьшает растяжимость венозной стенки и веностаз, увеличивает тонус вен, нормализует отток лимфы; укрепляет стенки капилляров, повышая их резистентность и уменьшая их проницаемость, нормализует микроциркуляцию. Данное лекарственное средство оказывает противовоспалительное действие на венозные стенки и створки клапанов путем снижения взаимодействия эндотелия с лейкоцитами и склеивания гранулоцитов в венулах.

Перспективными эндотелиопротекторами являются препараты, изготовленные из природного сырья. Их действие обусловлено синергическим эффектом входящих в них биологически активных веществ (БАВ). Так, терапевтическое действие растительных эндотелиопротекторов обусловлено фармакологически активными флавоноидами, антоцианидинами, тритерпеновыми гликозидами и кумаринами, обладающими как эндотелиопротекторным действием, так и антиоксидантной активностью.

Аналогами изобретения являются препараты на основе природных флавоноидов, тритерпеноидов и кумаринов: рутин, кверцетин, изокверцетин, эсцин. Известны такие их свойства, как эндотелиопротекторные, антиагрегационные, антиэкссудативные, венотонизирующие, противовоспалительные, антиоксидантные.

Механизм действия у эсцина и кверцетина из плодов каштана конского («Эскузан») заключается в снижении концентрации лизосомальных ферментов и торможении деградации мукополисахаридов в области стенок капилляров. «Эскузан» уменьшает проницаемость сосудов, предотвращая фильтрацию низкомолекулярных белков, электролитов и воды в межклеточное пространство. Снижает транскапиллярную фильтрацию и уменьшает периферические отеки, ощущение тяжести в ногах, усталости, напряженности, зуда, боли. «Ангионорм^®», содержащий сухой экстракт, получаемый из смеси лекарственного растительного сырья - боярышника плоды (Crataegi), солодки корни (Glycyrrhiza glabra L.), каштана конского обыкновенного семена (Aesculus hippocastanum L.), шиповника плоды (Rozae), обладает выраженной антиагрегационной активностью, ангиопротекторными и противовоспалительными свойствами, оказывает венотонизирующее и улучшающее микроциркуляцию действие, активизирует диуретическую функцию почек. «Ангионорм^®» оказывает влияние на общее состояние организма (повышает физическую работоспособность, проявляет стресспротективную активность и умеренный противоболевой эффект).

«Эндотелон» - ангиопротективное, венотонизирующее, уменьшающее ломкость и проницаемость капилляров средство. Предохраняет фибриллярные белки, прежде всего коллаген и эластин, от ферментной деградации и защищает коллаген от температурной денатурации.

Наиболее близким аналогом изобретения является препарат «Антистакс» растительного происхождения с эндотелиопротекторным действием. «Антистакс» представляет собой экстракт из красных листьев винограда, содержит фармакологически активные флавоноиды, основными из которых являются кверцетина глюкуронид и изокверцетин. Препарат оказывает защитное действие на эндотелий сосудов (стабилизируя мембраны) и увеличивает эластичность сосудов (нормализуя сосудистую проницаемость). Снижение проницаемости сосудистой стенки для плазмы, белков или воды из сосудов в окружающую ткань замедляет образование отеков и уменьшает уже существующие отеки. Препарат обладает также антиоксидантным и противовоспалительным действием [О.В. Голованов, А.Н. Кузнецов. Антистакс - новый препарат для лечения ХВН. Итоги проекта «Анонс» / Справочник поликлинического врача №4, 2006, с.62-64].

Задачей изобретения является расширение области применения препаратов из травы первоцвета, а также расширение арсенала эндотелиопротекторных средств.

Технический результат при использовании изобретения - получение средства с выраженным эндотелиопротекторным действием.

Указанный технический результат достигается за счет применения густого экстракта из травы первоцвета весеннего (Primula veris L.) в качестве эндотелиопротекторного средства.

Сущность изобретения заключается в применении густого экстракта из травы первоцвета весеннего (ГЭТПВ) в качестве эндотелиопротекторного средства.

Известны следующие фармакологические свойства препаратов из первоцвета: отхаркивающее, потогонное, мочегонное, спазмолитическое, седативное, противовоспалительное. Отмечена высокая антимикробная активность препаратов из первоцвета. Растение является богатым источником поливитаминов [В.К. Лавренов, Г.В. Лавренова. Важнейшие лекарственные растения.- Донецк: «Сталкер», 2004, с.324-325]. Ранее было выявлена высокая антиоксидантная активность густого экстракта травы первоцвета весеннего [Патент РФ 2342942, 2009 г.]. Данных об эндотелиопротекторном воздействии препаратов из первоцвета в доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено.

Приготовление густого экстракта производили методом перколяции, для чего 100,0 г измельченного растительного сырья экстрагировали 1000 мл 70% раствора этилового спирта. Полученные водно-спиртовые экстракты очищали от балластных веществ отстаиванием при t=8°C в течение трех суток с последующим фильтрованием для отделения смолистых веществ и хлорофилла. Объединенные очищенные экстракты упаривали под вакуумом на роторном испарителе модели «ИР-1М» для отгонки экстрагента. Далее доводили до состояния густого экстракта в выпарительных чашах в сушильном шкафу при температуре 60°C. Полученный экстракт травы первоцвета весеннего представлял собой густую вязкую массу темно-зеленого цвета с приятным специфическим запахом, горьковатого вкуса с влажностью не более 25%.

Проведенные нами исследования по изучению химического состава БАВ ГЭТПВ показал наличие в нем богатого комплекса БАВ: полифенольных соединений (флавоноидов, фенилпропаноидов, катехинов, оксикоричных кислот), обусловливающих антиоксидантную активность препарата; производных тритерпеноидов урсанового ряда и эсцина, аминокислот, органических кислот [Романова, З.Р. Фармакогностическое исследование первоцвета весеннего и первоцвета крупночашечного: Дис.… канд. фарм. наук. - Курск, 2010. - 138 с]. Содержание тритерпеноида эсцина в достаточно высокой концентрации в сырье до 4%, а у экстракта еще выше, позволило нам предположить наличие эндотелиопротекторной активности у ГЭТПВ.

В качестве хронической модели эндотелиальной дисфункции нами была выбрана модель хронического аллоксанового диабета. Аллоксан разрушает панкреатические β-клетки со специфической селективностью и приводит к развитию инсулин-дефицитной гипергликемии. Введение аллоксана приводит к повышению внутриклеточного кальция, что в свою очередь ведет к единовременному выбросу инсулина β-клетками и параллельно к их свободнорадикальному повреждению. Таким образом, при формировании хронического аллоксанового диабета у экспериментальных животных развивается окислительный стресс.

Механизмы повреждения эндотелия микроциркуляторного русла при сахарном диабете различны. По всей видимости, основными факторами эндотелиальной дисфункции являются следующие. Эритроциты, содержащие гликозилированный гемоглобин, обладают измененным поверхностным s-потенциалом. Последнее приводит к стазу, агглютинации и сладжу эритроцитов. Финалом данных процессов является микротромбоз, что создает местную циркуляторную и гемическую гипоксию, активацию перекисного окисления липидов с повреждением цитоплазматических мембран эндотелиальных клеток. Дополнительными факторами повреждения мембран эндотелиальных клеток, по-видимому, являются кетоацидоз и гликозилирование N-концов трансмембранных протеинов.

Особое место в патологии эндотелия занимает неферментативное гликозилирование белковых макромолекул, входящих в его состав. Как отмечено выше, эндотелиальные клетки продуцируют широкий спектр факторов, регулирующих систему гомеостаза. К эндотелиальным анти-тромботическим факторам относят антитромбин A₂, простациклин, оксид азота (NО), активаторы плазминогена и их рецепторы, а также аннексии. Среди веществ, способствующих тромбообразованию и синтезируемых в эндотелии, наибольшее значение имеют фибриноген, V, IX, X, XI и XII факторы свертывания крови, калликреин, ингибиторы фибринолиза, блокаторы рецепторов плазминогена, тромбоксан A₂ и эндотелины. Гликозилирование захватывает преимущественно белковые элементы противосвертывающей системы, что является дополнительным фактором местного тромбообразования. Коагулянты по каким-то причинам обладают относительной устойчивостью к метаболическому повреждению.

Свободнорадикальные процессы и гликозилирование компонентов эндотелиальных клеток приводят к снижению выработки в последних вазодилататоров, таких как NO и простациклин I₂. Так, гликолизирование NO-синтазы и истощение НАДФН, необходимой для работы фермента, сопровождается снижением количества NO. Возникающий при этом спазм артериол усугубляет гипоксию и, следовательно, свободно-радикальное повреждение эндотелия.

Аллоксановый диабет вызывали двухкратным подкожным введением водного раствора аллоксана в дозе 75 мг/кг голодавшим в течение суток животным. Были сформированы следующие группы (таблицы 1, 2): 1 группа - группа интактных животных (без лечения и без диабета); 2 группа - контрольная группа животных с экспериментальным диабетом, не получавшая лечения; 3 группа - группа животных с экспериментальным диабетом, получавшая препарат сравнения раствор антистакса; 4 группа - группа животных с экспериментальным диабетом, получавшая раствор густого экстракта травы первоцвета весеннего. Исследуемый препарат густого экстракта травы первоцвета весеннего вводили в дозе 21 мг/кг. Исследуемые препараты вводились внутрижелудочно на протяжении трех месяцев с момента введения аллоксана ежедневно.

Животные содержались в условиях вивария с естественным световым режимом на стандартной диете [ГОСТ Р 50258-92], с соблюдением "Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях" [2007] и правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ [ГОСТ Р 51000.3-96, ГОСТ Р 51000.4-96]. Забой животных проводился согласно требованиям "Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных" [2007].

В течение аллоксанового диабета наблюдалась смертность животных в экспериментальных группах, которая отражена в табл.1.

Далее проводили оценку антиоксидантной активности препарата густого экстракта травы первоцвета, как одного из компонентов эндотелиопротекторного действия изучаемых веществ, результаты приведены в табл.2. Дополнительно нами были изучены показатели эндотелина и метаболиты NO в плазме крови (табл.2).

Общую антиокислительную активность (ОАА) определяли колориметрическим методом с помощью стандартного тест-набора "Total intioxidant status" фирмы "Randox Laboratories" (Великобритания). Принцип метода основан на подавлении развития окраски хромогена в тестируемой пробе пропорционально концентрации антиоксидантов. Хромоген ABTS^R (2,2-азино-ди-[3-этилбензтиазолина сульфонат]) при инкубации с пероксидазой и H₂O₂ образует радикал ABTS^R+, полученный раствор имеет стабильный зелено-голубой цвет, интенсивность которого может быть измерена при 600 нм. Активность ГПО и СОД оценивали с использованием коммерческих тест-систем фирмы "Randox Laboratories" - "Ransel" и "Ransod", соответственно, согласно приложенным инструкциям. Количественное определение содержания ТБК-активных продуктов в плазме крови определяли с помощью наборов «ТБК-АГАТ» фирмы «АГАТ-МЕД» (Россия). Уровень эндотелина определялся методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием коммерческого набора QuantiGlo ELISA Kit (RnD Systems, Англия). Содержание окиси азота определяли биохимическим методом с помощью наборов Total Nitric Oxide and Nitrate/ Nitrite Parameter Assay Kit фирмы RnD Systems, Англия.

Антиоксидантный статус крыс на фоне экспериментального сахарного диабета значительно изменился. Достоверно увеличились показатели интенсивности ПОЛ в плазме крови при снижении активности СОД, ГПО и ОАА. На фоне применения ГЭТПВ концентрация ТБК-РП достоверно снижалась, приближаясь к уровню интактных животных, а содержание СОД, ГПО и ОАА достоверно повышалось. Показатели ПОЛ на фоне лечения экспериментального сахарного диабета ГЭТПВ не уступали показателям в группе сравнения (на фоне лечения препаратом «Антистакс»).

Одной из составляющих эндотелиопротекторного действия препарата является его ангиопротекторная активность. Раннее нами была изучена и доказана ангиопротекторная активность раствора ГЭТПВ [дисс. Романова З.Р.] Результаты исследования показали, что комбинированный стресс в группе животных, не получавших раствор ГЭТПВ, приводил к уменьшению времени появления петехий и времени отчетливого их прокрашивания по сравнению с контрольной интактной группой. В группе интактных и стрессированных животных, получавших раствор ГЭТПВ, достоверно увеличилось время появления петехий и время отчетливого их прокрашивания (p<0,001) относительно групп контроля (интактных и стрессированных). Результаты представлены в таблице 3.

Таким образом, раствор ГЭТПВ существенно улучшает вазодилатирующую функцию при эндотелиальной дисфункции у животных с экспериментальным сахарным диабетом, о чем свидетельствуют улучшение антиоксидантного статуса, снижение уровня эндотелина и увеличение содержания метаболитов NO. Исследуемый препарат экстракт первоцвета весеннего оказывает эндотелиопротекторное действие, сопоставимое с препаратом сравнения «Антистакс».

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению густого экстракта травы первоцвета весеннего (Primula veris L.). Густой экстракт травы первоцвета весеннего эффективен в качестве эндотелиопротекторного средства. Изобретение расширяет арсенал лекарственных эндотелиопротекторных средств. 3 табл.

Применение густого экстракта травы первоцвета весеннего (Primula veris L.) в качестве эндотелиопротекторного средства.